（一）TNBS乙醇灌肠致大鼠炎症性肠病的分子机制

1实验材料 1.1试剂耗材

TRIzol（Solarbio, China）；磷酸酶抑制剂（CWBIO, China）；蛋白酶抑制剂（CWBIO, China）；RIPA裂解液（Solarbio, China）；BCA 蛋白质检测试剂盒（Solarbio, China）；广谱彩虹预染蛋白Maker（CWBIO, China）；T-bet、RORy t、Foxp 3

1.2实验仪器

超声破碎仪（Sonics, USA）、小型垂直电泳仪（Bio-Rad, USA）、凝胶成像系统（Bio-Rad, USA）。

2实验方法 2.1动物实验及取材方法

动物实验及过程如前所述。

2.2转录组学分析

使用TRIzol（Solarbio, China）从对照组和IBD大鼠中提取总RNA，进行转录组学分析。使用NanoDrop和Agilent 2100对RNA质量进行评估，然后使用Illumina测序平台（HiSeqTM4000）对RNA进行测序。通过HTSeq对各基因表达水平进行分析，然后从负二项分布检验得到p值，并使用FDR (BH)进行调整。差异表达基因(DEGs)筛选的标准为p值小于0.05。

2.3蛋白质印迹分析

将大鼠结肠组织匀浆，并在含有 1% 磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物（CWBIO, China）的RIPA（Solarbio, China）中裂解。使用 BCA 蛋白质检测试剂盒（Solarbio, China）对匀浆中的蛋白质浓度进行定量，并调整至相同浓度。将蛋白在100℃水浴中加热5 min使蛋白变性，并保存与-80℃。

上样25-50 ug 变性蛋白质和3 ul广谱彩虹预染蛋白Maker（CWBIO, China）进行电泳。之后转膜至硝酸纤维素膜（0.2 μm）上。膜在5%脱脂牛奶中封闭1.5小时，并在4℃下孵育特异性一抗过夜。随后，在室温下孵育二抗（CWBIO, China）1.5 h（山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG H&L，在1：5000稀释）。使用增强的化学发光方法在凝胶成像系统（Bio-Rad, USA）中曝光，使蛋白质表达可视化。最后将蛋白条带强度与相应的总蛋白或 GAPDH比进行标准化。

2.4组织病理和免疫组织化学分析

将大鼠结肠组织用4%多聚甲醛缓冲液固定24 h，然后用石蜡包埋。切下5 um厚的结肠切片，并用苏木精和伊红（H&E）染色。

2.5数据分析

使用 ImageJ 软件（1.8.0, National Institutes of Health, USA）对蛋白条带进行定量。使用t检验分析两组数据之间的差异。使用单因素方差分析用于两组以上的比较。当数据偏离正态分布时，使用非参数检验。使用 SPSS 25.0软件（IBM Corp., USA）进行统计计算。 所有数据均表示为平均值±平均值的标准误差（SEM），以p < 0.05判断为显著。 使用 GraphPad Prism 7.0（USA）绘制图形。

3实验结果 3.1 TNBS乙醇溶液灌肠致大鼠肠上皮细胞炎症浸润

为了研究TNBS乙醇溶液灌肠诱导大鼠IBD发生的机制，我们对与胃肠道运动相关的结肠组织进行了研究。对TNBS乙醇溶液灌肠造模后，HE染色观察结肠组织形态，空白对照组结肠组织切片中，黏膜上皮细胞排列整齐紧密，模型组炎性细胞严重浸润，杯状细胞缺失。上述表明，TNBS乙醇溶液灌肠造模可造成大鼠肠黏膜上皮细胞出现破裂、炎症介质浸润。

3.2 IBD大鼠结肠转录组学研究

为了系统地研究TNBS乙醇溶液灌肠对大鼠结肠部位产生的影响，通过转录组测序分析了对照组和TNBS乙醇处理大鼠的结肠。在对照组与模型组中共发现了x个差异表达基因（DEGs）。其中模型组显著上调了195个基因，显著下调了44个基因(图8a)。KEGG富集分析结果表明。。基于KEGG结果的热图显示，x信号通路、基因均受到TNBS处理的显著调控(图8b)。GO分子功能分析表明，；细胞成分分析显示，；并且在生物过程中也富集了许多x过程相关的代谢途径(图8d)。转录组分析结果表明，TNBS乙醇致大鼠炎症性肠病的原因与。。有关，并与。。AMPK信号通路密切相关。

图8 通过RNA-Seq分析TNBS乙醇对大鼠结肠基因表达的影响（mean ± SEM，n=3）。（a）结肠中x个特异性DEGs的火山图；（b）DEGs的KEGG富集分析；（c）信号通路相关的DEGs表达热图; （d）DEGs的GO富集分析。

3.3 TNBS乙醇诱导IBD结肠组织炎症、溃疡与PPAR γ

PPAR γ 参与炎症及免疫反应的调节，作为巨噬细胞的负调节因子，在炎症反应中发挥抗炎的作用。PPAR γ 配体抑制免疫、炎症反应可能与抑制 IκB 磷酸化有关。PPAR γ 激活有助于下调 Th1 细胞因子(INF-γ、 TNF-α)，上调 Th2 细胞因子(IL-4、IL-10)，调节 T 细胞分化。

4小结

本研究证明了IBD大鼠的炎症与过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR γ）有关。TNBS乙醇溶液诱导的炎症性肠病是由于免疫激活而引起的，这主要与PPAR γ/T细胞调节有关。通过调控PPAR γ/NF-κB信号通路，释放炎性因子，调节T细胞分化，导致炎症性肠病发生。这些证据为治疗TNBS乙醇溶液诱导炎症性肠病提供了思路。

（二）以美沙拉嗪为阳性药，对戊己丸治疗IBD大鼠的功效进行评价验证

1实验材料 1.1实验动物

SD雄性大鼠60只，6周龄，体重220-240 g，购自北京市维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：CXK（京）2021—0011、SCXK（京）2021—0006。动物购入后于SPF级动物中心饲养。保持饲养环境安静，室温22-25℃，湿度50%-60%，明暗交替周期12 h/12 h。整个实验过程中大鼠可自由进食进水。

1.2实验试剂和仪器

TNBS（sigma）；粪便隐血试剂盒（雷根生物）；戊巴比妥钠（sigma）；炎性因子Elisa试剂盒。阳性药“美沙拉嗪”。戊己丸（李时珍医药集团有限公司）

酶标仪（Thermo scientific）。

2实验方法 2.1动物分组、造模及给药

大鼠适应性饲养4天，根据体重将动物随机分为5组，即空白对照组、模型组、阳性药组、戊己丸低剂量组和高剂量组，每组10只。

空白对照组使用生理盐水，其余各组均使用TNBS乙醇溶液灌肠刺激以建立大鼠IBD模型。实验前禁食不禁水 24h，称重，腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉；用直径 2.0 mm 长 12 cm 的输液管经液体石蜡润滑后,通过肛门轻 轻插入结肠至标记好的 8 cm 处，一次性缓慢推入新鲜配制的 TNBS 造模溶液(150 mg/kg TNBS+50%乙醇，体积比 2:1),捏紧肛门提尾倒立 1-3 min，以避免造模液 回流，同时轻揉鼠腹，保持动物臀部高于腹部 15 min。最后，使大鼠侧卧，放回 笼中自然苏醒,之后常规饲养。

造模造模 24h 后给药，阳性药物组和戊己丸各剂量组灌胃相应剂量的药物，空白对照组、模型组灌胃等量饮用水，给药x天后，进行检测。

3实验结果 3.1戊己丸对IBD大鼠体重的影响

结果如图所示，与空白对照组相比，模型组大鼠在TNBS乙醇溶液处理后模型大鼠精神状态萎靡不振，在2-4天体重将发生一定程度的降低。之后大鼠体重开始呈现稳定增长，但仍然显著低于空白组，且戊己丸给药组的低和高剂量组与模型组相比有显著性差异。

3.2戊己丸对IBD大鼠DAI评分的影响

在整个实验过程中，与空白对照组相比，模型组大鼠在TNBS乙醇溶液刺激后DAI 评分显著降低。戊己丸和美沙拉嗪给药各组较模型组DAI评分有所升高。

3.3戊己丸对IBD大鼠相关生化指标的影响

在造模给药后，与空白对照组相比，模型组小鼠在TNBS乙醇溶液刺激后血清中炎性因子IL-1β、TNF-α显著升高。戊己丸和美沙拉嗪给药各组较模型组炎性因子有一定程度的降低。

4小结

在TNBS乙醇溶灌肠模型上，研究发现戊己丸给药后可以显著改善TNBS乙醇所致的DAI评分降低、炎症因子升高。本研究证明了戊己丸的改善严重性肠病药效，也验证了TNBS乙醇溶灌肠模型评价治疗IBD功效的有效性。