实验一氨基酸的分离鉴定——纸层析法实验目的1.学习氨基酸纸层析的基本原理。
2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。
实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成，滤纸和水的亲和力强，与有机溶剂的亲和和弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。
将样品点在滤纸上（原点），进行展层，样品中的各种AA在两相溶剂中不断进行分配，由于它们的分配系数不同，不同AA随流动相移动速率就不同，于是将这些AA分离开来，形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用比移（rate of flow ,R f）来表示R f= 原点到层析点中心的距离（X）/原点到溶剂前沿的距离(Y) 只要条件（如温度、展层剂的组成）不变，某种物质的R f值是常数。
可根据R f作为定性依据。
R f值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
样品中如有多种AA，其中有些AA的R f值相同或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转90度再用另一种溶剂展层，从而达到分离的目的，这种方法叫双向层析。
仪器、试剂1、扩展剂：是水饱和的正丁醇和醋酸以体积比4：1进行混合得混合液。
将20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15 ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。
取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。
2、氨基酸溶液⑴.已知单一氨基酸：5%赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、⑵.混合氨基酸：各5 ml混合。
3、显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
4、层析缸、滤纸（14*17）、喷雾器、电吹风实验步骤1.放置平衡溶剂：用量筒量取约5 ml平衡溶剂，放入培养皿中，然后置于密闭的层析缸中。
2.准备滤纸：取层析滤纸（长17㎝、宽14㎝）一张。
在纸的一端距边缘2㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样线。
3.点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这8个位置上，干后再点一次。
每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。
4.扩展：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。
将盛有约20ml扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1㎝）。
待溶剂上升12㎝时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。
5.显色：用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟（100℃）或用热风吹干即可显出各层析斑点。
6.计算：计算各种氨基酸的比移（Rf）值。
精讲点播1. 利用逆流分溶或逆流分配的方法作为分配层析原理的说明：2.物质的结构与极性对Rf 值的影响物质的结构不同，其分子的极性不一样，物质在水和有机溶剂两相中的溶解度就不同，分配系数的不同可通过Rf 值反应出来，极性较强的物质，在水中的溶解度较大，其Rf 值就较小，相反极性较弱的物质，在有机溶剂中的溶解度就较大Rf 值就大些，如中性AA 的极性弱于酸碱性AA ，故中性AA 的Rf 值较大。
注意事项、出现的问题及解决办法1.取滤纸前，要将手洗净，并尽可能少接触滤纸，不得已时只能拿滤纸的一角，平放在洁净的纸上。
2.点样点的直径不能大于0.5㎝，否则分离效果不好，样品用量大会造成“拖尾巴”现象。
3.分离时间短使有些已知氨基酸的Rf 值非常相似，分析时可以辅颜色不同加以区分。
4.样品在原点未移动，是因为展层剂出问题，在展层剂中混入了平衡溶液，因为平衡溶液是放置时间长了的展层剂，展层剂出现脂化现象，使分配系数发生变化。
思考题1.何谓纸层析法？2.何谓Rf 值？影响Rf 值的主要因素是什么？3.怎样制备扩展剂？4.层析缸中平衡溶剂的作用是什么？实验二. 酶的特异性（专一性）及影响酶活性的因素实验目的1. 掌握检查酶特异性的方法和原理。
2. 了解温度对酶活性的影响。
3.了解激活剂、抑制剂对酶活力的影响。
实验原理1. 酶的专一性酶是生物体中一种具有催化功能的特殊蛋白质（传统酶的概念），也常称为生物催化剂。
它与一般催化剂的最主要区别就是具有高度的特异性，即专一性。
根据各种酶对底物的选择程度不同，可分为绝对专一性、相对专一性、立体异构专一性，。
例如唾液淀粉酶属于相对专一性酶，它只能随机作用于淀粉链内部的a——1，4糖苷键，使其分子迅速断裂成较短的链，称为糊精，糊精分子量递减，淀粉——大分子糊精——中分子糊精——小分子糊精——简单分子糊精——麦芽糖和a——糊精（含a——1，6糖苷键的短链聚糖，平均分子量为8个残基）。
由于淀粉酶催化所形成的产物都是还原糖，故可用灵敏度较高的Benedict试剂检测和观察。
2.温度对酶促反应速度的影响酶的催化作用受温度的影响很大，与一般化学反应一样，提高温度可以增加酶促反应的速度，通常温度每升高10℃，反应速度加快一倍左右。
另一方面酶是一种蛋白质，温度过高可引起蛋白质变性，导致酶的失活。
因此，反应速度达到最大值以后，随着温度的升高，反应速度反而逐渐下降，以至完全停止反应。
反应速度达到最大值时的温度称为酶作用的最适温度。
大多数动物酶的最适温度为37—40℃，植物酶的最适温度为50—60℃。
但一种酶的最适温度不是完全固定的，它与作用的时间称短有关，反应时间增长时，最适温度向数值较低的方向移动。
最适温度不是酶的特征性物理常数。
酶对温度的稳定性与其存在形式有关。
大多数酶在干燥的固体状态与比较稳定，能在室温下保存数月至一年，溶液中的酶，易被微生物污染，常难长期保存，在高温的情况与，如100℃即可失活。
低温降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。
3.激活剂和抑制剂对酶活力的影响酶的活性常受某些物质的影响，有些物质能增加酶的活性，称为酶的激活剂；另一些物质则会降低酶的活性，称为酶的抑制剂。
例如氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子则为该酶的抑制剂。
通常情况下，很少量的激活剂或抑制剂就会影响酶的活性，而且常具有特异性，但是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质对不同的酶所起的作用不同，如镁是脱羧酶烯醇化酶的激活剂，但是肌球蛋白ATP 酶的抑制剂，同一种酶也可因激活剂的浓度不同而作用不同，如CL-在低浓度时是激活剂，达三分之一饱和度时则变为抑制剂。
器材和试剂1.配制的溶于0.3％氯化钠的0.5％淀粉溶液：2.新配制的溶于0.3％氯化钠的0.1％淀粉溶液：3.新配制的溶于0.3％氯化钠的0.2％淀粉溶液：4.新配制的溶于0.3％氯化钠的1%淀粉溶液：5.稀释的新鲜唾液。
漱口后将唾液吐入量筒内收集约10ml加水至200ml，取0.2%的淀粉2ml，唾液2ml混匀，每间隔1分钟取1-2滴于白磁反应板内，加KI-I检测，控制酶的浓度使反应刚好在4-5分钟内完成。
6.碘化钾－碘溶液:将碘化钾20克及碘10克溶于100毫升水中。
使用前稀释10倍。
7.本尼迪克特（Benedict）试剂: 取86.5克柠檬酸钠（Na3C6O7·2H2O）和50克无水碳酸钠溶于450毫升蒸馏水中；再取硫酸铜（CuSO4·5H2O）8.7克溶于50毫升蒸馏水中；然后将硫酸铜溶液慢慢到入前液，边加边摇动；最后加蒸馏水稀释至500毫升（本试剂可长期保存）。
8. 1％氯化钠溶液：10、铜溶液：11、%硫酸钠溶液12恒温水浴锅、沸水浴、移液管、电子天平操作步骤淀粉→分子糊精-→中分子糊精→小分子糊精→麦芽糖和α-糊精KI-I 蓝蓝紫褐红不呈色不呈色一、酶的专一性二（一）淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。
糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。
最简单的糊精遇碘不呈颜色，麦芽糖遇碘也不呈色。
在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。
(三)中。
10分钟后取出（将2号管内液体分为两半），用碘化钾－碘溶液来检验1、2、3号管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。
记录并解释结果，将2号管剩下的一半溶液放入37℃水浴中继续保温10分钟，再用碘液检验，结果如何？三. 酶的激活与抑制（一）（二）加毕，摇匀，同时置37℃水浴锅中保温，每隔2分钟取液体1滴置白瓷板上用碘液试之，观察那支试管内液体最先不呈蓝色反应，那一管次之，说明原因。
注意事项1.所用唾液，应在收集前用蒸馏水漱口，以清除食物残渣，再含一口蒸馏水，约半分钟后将其流入量筒并稀释。
由于不同人或同一个人不同时间采收的唾液内淀粉酶的活性并不相同，有时差别很大。
所以稀释倍数可根据各人的唾液淀粉酶活性进行调整（一般在50~300倍）。
另外，稀释好的新鲜唾液若泡沫多，可进行过滤后再用。
2.实验中所用的淀粉溶液必须新鲜配制，并且在配制时必须将其煮沸至透明为止。
且下次实验若再用，必须重新煮至透明，否则将影响实验结果。
3.蔗糖是典型的非还原糖，若其中的非还原糖超过一定标准，则呈现还原性，这种蔗糖不能使用。
一般在实验之前要对所用蔗糖进行检查，不能呈现阳性反应，至少要用分析纯试剂。
4.唾液中除了含有淀粉酶以外，还含有少量的麦芽糖酶，该酶可使麦芽糖分解为葡萄糖。
思考题1．什么是酶的特异性？本实验如何验证了酶的特异性？2．蔗糖的纯度对该实验的成功与否有什么要求？3．若将唾液酶和蔗糖酶液煮沸15分钟，其实验结果会发生什么样的变化？4．酶反应的最适温度是酶的特征性物理常数吗？它与哪些因素有关？参考内容1.绝对专一性：只作用于一种底物，仅催化一种反应，如脲酶就是其中最典型的例子，只催化尿素水解而对尿素的任何衍生物均无催化水解作用。
2.相对专一性：可以催化某一类的底物或某一类的化学键，如蛋白水解酶脂酶。
3.立体异构专一性：只作用于底物的立体异构物中的一种，而且反应生成物也都是异构物中的一种。
此种现象普遍存在。
实验三小麦萌发前后淀粉酶活性的比较实验目的1.学习用分光光度法测定酶活力的原理和方法。
2.了解小麦萌发前后淀粉酶酶活力的变化。
实验原理淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称。
按照其水解淀粉的作用方式，可以分成α—淀粉酶、β—淀粉酶等. 实验证明，在小麦、大麦、黑麦的休眠种子中只含有β—淀粉酶，α—淀粉酶是在发芽过程中形成的，所以在禾谷类萌发的种子和幼苗中，这两类淀粉酶都存在。
其活性随萌发时间的延长而增高。
α—淀粉酶是工业上使用最广泛的酶之一，它在PH3.6下短时间内即可钝化，β—淀粉酶不耐热，加热至70℃以上即可钝化。
利用此原理可以灭活其中一种酶，测定另一种酶的活性。
本实验以淀粉酶催化淀粉生成还原的性糖的速度来测定酶的活力，淀粉水解成还原性糖，还原性糖能使3，5—二硝基水杨酸还原成棕色的3—氨基5—硝基水杨酸。
可用分光光度计法测定，2(C6H10O5)n + n H2→n C12H22O11器材、材料、试剂1.小麦种子2.0.1％标准麦芽糖：精确称量0.1g麦芽糖，用少量水溶解后，移入100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度。
