医用酶液怎么稀释荧光素酶检测实验介绍!

本实验通过构建含目标调控序列的荧光素酶报告质粒，转染至细胞后，检测荧光素酶活性，从而评估特定转录因子对目标基因的调控作用，或筛选影响基因表达的化合物。  

• 实验流程

（一）转染及荧光素酶活性检测

1. 1. 1. 1. 转染体系(每孔)

• 1. 1. 1. 转染程序
• 转染前一天，将细胞用胰酶消化铺96孔板，控制第二天细胞汇合度约为70~80%
• 将Hieff TransTM、报告基因载体、VecFOXO3、无血清培养基平衡至+15~25℃；
• 对于每孔用10ul无血清培养基稀释0.15ug报告基因载体，用10ul无血清培养基稀释0.45ul Hieff TransTM试剂,并在室温孵育5min;
• 轻轻涡旋载体溶液，并逐滴添加稀释的Hieff TransTM试剂，充分混匀后，室温静置 10~25 min以形成 DNA-Hieff TransTM复合物；
• 对于每孔用3ul无血清培养基稀释0.3ul Hieff TransTM试剂,并在室温孵育5min;
• 轻轻涡旋溶液，并添加0.25ul VecFOXO3，充分混匀后，室温静置 10~25 min以形成 RNA-Hieff TransTM复合物；
• 96孔细胞培养板每孔换成80ul无血清培养基;并将复合物逐滴加入孔中，边加边摇晃；

⑧  37℃，5% CO2培养箱培养24-48h，直至进行转基因表达分析，无需去掉复合物或更换培养基。但对于脆弱的细胞，可能有必要在6h后更换成完全培养基，不会降低转染活性

（3）荧光素酶检测

①　将荧光检测仪打开，设定参数测定时间为10s，测定间隔为2s；

②　裂解细胞：对于贴壁细胞，96孔板培养板吸尽细胞培养液，加入100ul细胞裂解液，轻轻旋转培养板使裂解液完全覆盖细胞,冰上孵育5 min，充分裂解细胞；

③　配制萤火虫荧光素酶反应工作液和海肾荧光素酶反应液，即萤火虫荧光素酶底物（50 X）和海肾荧光素酶底物（50 X）分别用对应的缓冲液稀释至1 X 工作液。并孵育至室温；

④　取20 μL细胞裂解液，加至黑色酶标板中。⑤　加入100 μL 萤火虫荧光素酶反应液，震板混匀，检测萤火虫荧光素酶的活力，

⑥ 加入100 μL 海肾荧光素酶反应液，震板混匀，静置10min后检测海肾荧光素酶的活力；

检测值比值ratio=萤火虫荧光素酶检测值 / 海肾荧光素酶检测值；

✅ 高灵敏度：生物发光信号无背景干扰，检测下限低至单细胞水平

✅ 高通量：适用于96/384孔板，可快速筛选大量样本或化合物  

✅ 动态范围广：发光信号与酶活性呈线性关系，覆盖宽浓度范围
✅ 灵活性高：可结合多种实验设计（如双荧光素酶系统、药物处理等）

• 适用范围

1️⃣ 转录因子活性检测（如NF-κB、STAT3等信号通路研究）

2️⃣ 启动子或增强子功能分析

3️⃣ 药物或小分子化合物对基因表达的调控研究

4️⃣ 基因编辑（CRISPR/Cas9）后调控效应评估

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六、代表性实验结果