第二部分 调谐

1、PPG就是正离子校正液，PPG3000负离子调谐液，本台仪器只用两瓶校正液，正离子一瓶，负离子一瓶。洗液一瓶50%的甲醇水。调谐前先用洗液洗针两次。吸校正液的时候慢慢吸，避免吸入气泡，吸好以后将针泵卡住。再将高度调到5，将管路重新连接。不再连接六通阀，由质谱直接进样，且将针泵的速度调到10μL/ml；

2、调谐液弄好后在仪器面板工具栏上：TOOl→项目→创建项目。此项目为一个文件夹，文件夹里面包括所有此次采集的信息，方法、序列等，且所有采集的项目都固定在一个文件夹下面：D:/Analyst Data/Project。新建项目的时候，弹出窗口中有个Add All，可以创建孙文件夹；

3、联机：软件打开后在左上方硬件配置（单机选中，双击打开）→只需选中仪器MS→active profile。图标变为绿色，表示联机成功。调谐只需要选中质谱。仪器的实时状态可以点击右下方的图标，质谱和液相都是单独观察，质谱要注意真空度，为0.5；

4、调谐→手动调谐→项目（文件夹）选中下拉菜单中的Installation 20161102（为系统默认的调谐文件夹），先Q1→start syring pump（打开针泵）→start（质谱），开始采集以后观察基线是否平衡，若等两分钟还未平衡好，则手动将针泵往上抬；

5、平衡好后（基线平稳则为平衡好），重新进样，重新点击start syring pump。Resolution（分辨率）→advanced（高级选项）（看到结果后调节质量轴和分辨率做准备，只能先打开这个，再打开谱图）→实时质谱图右键→open file→随便点一个框→软件上方的从谱图校正   →PPG.POS(正离子) →start→出现三行：（1、质量轴。2、分辨率。3、两次调谐的差异）→若质量轴有差异→右上角  →yes→若分辨率飞离出虚线→offset（偏大调大，偏小调小）输入校正的数值，再重新进样，如此反复，直到点落在虚线以内，实线代表最合适；

6、校正好后仪器会自动保存，直接关掉窗口即可。负离子调谐和正离子调谐步骤一样，只是在选择方法的时候要注意选择负离子模式。还有看结果时要选择PPG3000.此为负离子调谐液。调谐因针泵流速很小，10μL/ml，所以不需要设定离子源温度及辅助气，直接设定喷雾器流速为50，就可以将样品雾化，气帘气也不需要设置，因为没有多余的溶剂需要吹走。

第三部分：方法优化

此时将仪器从校正状态退出，进入分析模式。确认泵已打开，首次进样液相先排气，再平衡仪器：先点击工具条上的equilibrate平衡按钮，在弹出的平衡窗口中输入平衡时间10min，点击ok。右下角图标会变黄，待平衡结束后此处图标会变成绿色，此时即可点击start sample按钮采集样品信息，仪器会自动对已提交的全部样品进行采集。

原理：在进行多级质谱分析(MS-MS)时，首先限定目标质量的离子。通过调整交变电压，将大于以及小于目标质量的离子射出，从而使得仅有一个质量的离子存在于离子阱中并将其富集。目标质量的范围被称为Isolation Width。之后通过向离子阱内注入气体（通常为氦气或氮气），与离子发生碰撞使其被打成碎片。

操作方法：首先在Analyst中打开一个成熟的MRM采样方法，然后右键单击Acquisition Method中的MRM，在弹出菜单中选择Add IDA Criteria Level。在新增的IDA-First Level Criteria页面中设置相关逻辑选项（其中四项尤为重要）。

完成以上IDA Criteria逻辑选项设定后，添加EPI方法。首先，在IDA Criteria上点击右键，在弹出菜单中选择Add experiment。软件会添加一个新的experiment，并自动与上一个MRM保持一致。然后在Scan Type处选择Enhancde Product Ion（EPI）。设定离子阱扫描速度Scan Rate为10000Da/s（根据自动调谐的参数设定）。在右侧表内设定二级质谱的扫描范围（应包含母离子及子离子）。点击Edit Parameters按钮，进入此EPI对应的离子源和化合物电参数的设定窗口（将CAD模式改为High，其余参数应与MRM保持一致）。举例：设定CE为35，CES为15，此处表示子离子扫描的碰撞能量为20、35、50三个值，即二级质谱为低中高三个碰撞能量所得的碎片离子混合图。

最后选择菜单File/Save保存现有采样方法。