FerroOrange是一种检测不稳定二价铁离子的荧光探针，定位在内质网，在遇到二价铁离子时，会发出不可逆的橙色荧光。

特点：

● 荧光法高敏检测胞内二价铁

● 适合于多种检测仪器

● 铁死亡常见指标之一

铁是生物体内最丰富的过渡金属元素，它参与各种生理过程活动。 近年来，活细胞中的游离铁受到广泛关注， 游离铁最常以其稳定的氧化还原态存在，即亚铁离子 (Fe2+) 和铁离子 (Fe3+)。对研究者来说，在研究细胞内的还原环境，金属转运蛋白和Fe2+的水溶性时，了解Fe2+的行为比了解Fe3+的行为更为重要。FerroOrange作为一种新型的荧光探针，可对活细胞内的Fe2+进行荧光成像。

所需的设备和材料

二甲基亚砜 (DMSO)，二甲基甲酰胺 (DMF) 或乙醇

HBSS

无血清培养基

微量移液器

溶液制备

在含有24 ug FerroOrange的管中加入35 ul DMSO，用移液器吹打混匀，配制得到1 mmol/l FerroOrange溶液。 用HBSS溶液稀释1 mmol/l 的FerroOrange溶液，制备得到1 umol/l 的FerroOrange工作液。

* DMF或乙醇也可以代替DMSO进行制备。 该溶液在-20℃稳定1个月。1 umol/l FerroOrange工作液不稳定。需要现配现用，并尽快使用。

* 必要时，可使用无血清培养基代替HBSS，但血清会增加背景。

操作步骤

1. 接种细胞于荧光培养皿中，在37℃，5% CO2培养箱中过夜培养。

2. 弃去上清液，并用HBSS或无血清培养基洗涤细胞3次。

3. 更换含有药物的培养基，在37℃，5% CO2培养箱中培养。

* 请根据药物特性优化培养时间。

4. 去除培养基，用HBSS或无血清培养基清洗3次。

5. 加入浓度为1 umol/l的FerroOrange工作液，在37℃，5% CO2培养箱中培养30分钟。

* 无需清洗，培养后直接进行观察。

6. 在荧光显微镜下观察细胞。

常见问题

Q1：如果发生铁死亡，细胞膜破裂，FerroOrange的荧光是否存在？
A1：由于FerroOrange是活细胞探针，对死细胞无法发挥出探针的正常性能。

Q2：FerroOrange只能检测游离铁吗？是否可以检测某些如铁硫蛋白里的结合铁？
A2：FerroOrange只能检测游离的二价铁，不能检测结合铁。

Q3：FerroOrange适合用哪些仪器检测？
A3：Ex (nm) = 543，Em (nm) = 580，荧光显微镜或荧光酶标仪检测。我们建议使用绿色激发光 (Ex: 532 nm) 激发FerroOrange。

Q4：染色时需要注意什么？
A4：注意事项如下，
1、FerroOrange染色后是否需要更换培养基？
更换培养基会导致FerroOrange泄漏到细胞外，因此染色后不要更换培养基。
2、对照实验。
为了检查铁检测的实验条件，建议准备1个加入铁螯合剂Bpy (2,2'-Bipyridine) 或硫酸亚铁(Ⅱ) 铵的
样品，并观察FerroOrange荧光强度的变化。
3、细胞染色后荧光强度弱的解决办法。
根据细胞种类的不同，染色程度也有差异。
如果荧光强度弱，建议FerroOrange Working Solution的浓度高于推荐的1 umol/l，可在1-5 umol/l范围
内摸索最佳染色浓度。

Q5：使用荧光酶标仪的操作步骤
A5：请参考下面的实验例进行检测：
<测定样品>。
样品A：无添加剂(仅HeLa细胞)。
样品B：含有铁螯合剂2,2'-Bipyridyl(Bpy)的HeLa细胞。
样品C：含有硫酸亚铁(Ⅱ) 铵的HeLa细胞。
<检测步骤>
1、在96孔透明底黑板上接种100 ul HeLa细胞，细胞数量为10,000个细胞/孔，在37℃，5% CO2培养箱中
过夜培养。
2、用100 ul不含FBS的MEM培养基清洗样品C的细胞3次。
3、向样品C中加入100 ul含有硫酸亚铁(Ⅱ) 铵的MEM(不含FBS)培养基 (终浓度: 100 umol/l)，在37℃，
5% CO2培养箱中静置30分钟。
4、用100 ul HBSS清洗所有孔的细胞3次。
5、向样品A和C中加入100 ul的1 umol/l FerroOrange Working Solution，向样品B中加入100 ul含有
FerroOrange (终浓度：1 umol/l)和Bpy(终浓度：100 umol/l)的HBSS溶液，在37℃，5% CO2培养箱中
培养30分钟。
6、用多功能酶标仪检测各样品的荧光强度
(Ex:543 nm/Em:580 nm)。