这项研究招募了年龄在18至70岁之间的男性和女性患者，这些患者根据2010年美国风湿病学会和欧洲抗风湿病联盟（EULAR）分类标准诊断。如果有其他急性或慢性疾病，则排除在外。队列I（NORA）包括40名治疗初期RA患者（25名ACPA阳性RA患者和15名ACPA阴性RA患者）和29名年龄和性别匹配的健康个体（表S1）。队列II（确定RA）包括37例接受标准治疗的RA患者和31例年龄和性别匹配的健康对照组（表S6和图1)本研究依据《赫尔辛基宣言》和《国际协调良好临床实践指南会议》的规定，经北京大学人民医院伦理委员会批准。试验方案和所有相关研究表格均已由北京大学人民医院机构评审委员会批准（批准号：2016PHB200）。所有患者均提供书面知情同意书。
所有粪便样本在北京大学人民医院采集，冷冻后运至中国科学院北京基因组研究所，保存于?80°C用于后续的亚基因组测序。我们使用E.Z.N.A.土壤DNA试剂盒（D5625-02，OMEGA）从粪便样本中提取DNA，并在Illumina Hiseq2000/2500平台上进行配对末端基因组测序[100碱基对（bp）/150 bp×2；插入大小，350 bp]。原始读取随后被应用到质量控制中，模糊的序列和适配器被FastQC（版本0.11.5）过滤，低质量的基被Trimmomatic过滤(29)（版本0.33，选项：滑动窗口：4:20最小长度：40）或FASTX工具箱(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/commandline.html，版本0.0.13，选项：-q 20-p 80）。然后，由BWA（带有默认参数的mem模块）删除了与Hs37人类基因组对应的人类起源的读数(http://bio-bwa.sourceforge.net/)聚合酶链反应（PCR）复制品用PRINSEQ去除(http://prinseq.sourceforge.net/)使用-verbose-derep 1-derep_min 2选项。最后的干净读取应用于分类法注释。用Kraken进行微生物分类(http://ccb.jhu.edu/software/kraken/，1.0版，Kraken translate模块，选项--mpa格式），用于所有测序样本的干净数据，其中样本中所有物种的总相对丰度标准化为1。极低丰度的物种（相对丰度<10?5)在极少数样本中（<10%的总样本）被移除，以避免随机关联。每个样本的功能分析都是用human2进行的(http://huttenhower.sph.harvard.edu/humann2)，它将读取数据映射到默认的功能注释泛基因组数据库（ChocoPhlAn数据库），并识别基因家族（UniRef数据库）和潜在代谢途径（MetaCyc数据库集合，https://biocyc.org/)微生物群落。
如前所述，构建准配对队列(10)，除了一些修改。简单地说，首先构建了一个高维空间，其中每个物种的丰度代表一个维度，所有受试者都根据其物种分布在空间中。因此，样本形成了一个基于欧几里德距离的相似度网络。下一步是寻找边界样本，这对定义表型组之间的边界至关重要。边界样本是那些表现出与相对群的样本比同一组中的样本具有更高物种剖面相似性的样本，即在高维空间中，与邻域的距离比相对群的成员长。为了寻找边界样本，每个样本的相似度与其最近的k邻域首先被计算为KNN（平均欧几里德距离到k最近的邻居），在哪里k是样本量的平方根。然后，去除距离相邻点太远（KNN>mean KNN+SD）的异常值和离相邻点太近（KNN<mean KNN-SD）的冗余，以避免随机影响。最后，选择组内KNN>组间KNN作为两组的边界样本。每个边界样本被用来构建k样本对及其k对侧的最近邻，这些对被用来构成成对样本的队列，其中每对样本具有相似的物种特征（高维空间中的最近邻），但表型相反。去除冗余对后，最终重建准成对队列。
对于丁酸盐生产商来说，至关重要等等。(14)共检索了3184个细菌基因组，根据丁酸基因途径中所有必需基因的存在以及这些基因的同源性，鉴定出225种细菌有可能产生丁酸盐。这225种细菌隶属于131种，在同一种菌株中表现出明显的一致性。因此，我们将样本中的注释物种归类为丁酸盐生产商，如果它们在之前出版物提供的131种丁酸物种列表中。
对于丁酸盐消费者，目前还没有此类报告提供丁酸盐消费的微生物种类的明确清单。齐尔斯等等。(15)确定了微生物降解丁酸盐催化丁酸反应的关键基因?辅酶（辅酶）?3-羟基丁酸酯。第一步为酰基辅酶A脱氢酶或丁酰辅酶A脱氢酶，第二步为烯醇基辅酶A水合酶或巴豆酰辅酶A水合酶。因此，我们根据KEGG数据库筛选了所有物种的公开存储基因组，并根据KEGG数据库对这四个基因的存在进行了注释，并确定了携带这两个步骤酶的基因组是潜在的丁酸盐消费者，属于185个物种。我们注意到，许多丁酸盐生产商也含有丁酸盐消耗基因，这表明他们有能力利用自己合成的丁酸盐；这些物种仍被归为生产者。本研究样本中确定的所有丁酸盐生产和消耗物种列于表S3中。
以12种丁酸盐生产树种和24种丁酸消费树种的丰度为输入，建立了随机森林模型(https://cran.r-project.org/web/packages/caret/)还有randomForest R软件包(https://cran.r-project.org/web/packages/randomForest/index.html)然后，通过R-packages-pROC，用AUC和准确度评估了面板中丁酸盐种类的诊断能力(https://cran.r-project.org/web/packages/pROC/index.html)还有ROCR(https://cran.r-project.org/web/packages/ROCR/index.html)鉴别NDJ患者ACPA状态和DJ。用40%的样本进行二次交叉验证，并以所有样本作为测试数据集来评估诊断能力。对1000个自举复制和物种重复该过程，并记录每个重复的基尼评分下降情况。
雄性DBA/1小鼠（6~8周龄）从华富康（北京）有限公司购买，在特定的无病原体条件下喂养。所有实验均按照北京大学人民医院动物保护与使用委员会规定的指南进行。CIA诱导是根据先前公布的方案进行的(30)简单地说，用150μg牛II型胶原蛋白（CII；Chondrex，Redmond，WA，USA）在完全弗氏佐剂（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）中乳化，在尾端底部皮肤内免疫DBA/1小鼠。21天后，用75μg的CII乳化在弗氏不完全佐剂（Sigma-Aldrich）中进行强化免疫。临床评分在强化免疫后使用以下系统进行评估(30)：0，正常；1、一指或数指红斑、肿胀；2、红斑、中度肿胀，从踝关节向足中段（跗骨）；3、从踝关节至跖骨关节出现红斑和严重肿胀；4、脚踝、足部和手指周围出现完全红斑和肿胀，导致畸形和/或强直。所有四肢的得分相加，得出每只老鼠的总分为0到16分。
我们将小鼠随机分为两组，丁酸饮食组和对照组。在初次免疫后（第1天）和整个实验期间，所有小鼠均饲喂含有20%（w/w）丁酸盐[20%（w/w）、均匀混合在饲料中的丁酸盐、HFK Bioscience Co.Ltd.）或常规饲料（HFK Bioscience Co.Ltd.）。在研究终点，对小鼠实施安乐死，收集血清样本进行细胞因子和自身抗体检测。取小鼠脾脏、关节引流淋巴结（腘窝和腋窝淋巴结，DLN）、派尔斑片和肠系膜淋巴结，通过70μm细胞过滤器（Corning）在含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基和单细胞悬浮液（10%）中进行筛选6细胞/100μl）制备流式细胞仪。
收集每只老鼠的爪子并将其固定在4%多聚甲醛中48小时，然后使用微型CT扫描仪（Quantum FX，Caliper，USA）进行扫描。然后，用5%EDTA脱钙，石蜡包埋，切片，苏木精和伊红染色。对矢状切面进行显微镜评估，并根据以下先前报告的参数对组织病理学变化进行评分(31)：0，滑膜正常；滑膜肥大，细胞浸润；血管紧张和软骨糜烂；软骨和软骨下骨严重糜烂；4、关节完整性丧失，关节强直。所有四肢的得分相加并除以4，得出每只老鼠的平均得分为0到4。
首先对细胞表面标记物进行染色，然后按照制造商的方案用细胞内染色缓冲液组（Thermo Fisher Scientific）固定、渗透，并用细胞内或核内标记物染色。如表S7所示，抗体从BD Biosciences（加利福尼亚州圣何塞市，美国）、eBioscience（Thermo Fisher Scientific）或BioLegend（美国加利福尼亚州圣何塞）购买。T雷格斯定义为CD4+CD25+FOXP3型+，吨FH公司CD4细胞+CD44细胞+CXCR5型+PD-1型+Bcl6公司+，吨法国CD4细胞+CD44细胞+CXCR5型+PD-1型+Foxp3型+，GCB电池为B220+CD4-CD95+GL-7型+详细的选通策略见图S11。流式细胞术使用FACSAria II（BD Biosciences）进行，数据使用FlowJo v10进行分析。0.7软件（美国阿什兰州Tree Star公司）。
用Ficoll分离法从正常人、健康献血者和RA患者的血液中分离出单核细胞。收集的细胞在含有10%FBS、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100μg/ml）的α-最低基本培养基（Thermo Fisher Scientific）中重新悬浮，并在24孔平板中放置7至9天。为了确定丁酸盐对破骨细胞发育的影响，我们用1000μM丁酸盐或不添加丁酸盐培养单核细胞。用巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）（30 ng/ml）和核因子-κB配体受体激活剂（RANKL）（50 ng/ml；中国上海研发系统）在破骨细胞中分化成熟。每隔3天将培养基和细胞因子完全清除并更换。在培养结束时采集细胞进行PCR扩增。
用密度梯度离心法分离出24例mcs。随后，细胞在RPMI 1640中培养，RPMI 1640中添加10%FBS和1%青霉素链霉素和5%CO2在37℃下，添加1000μg/ml丁酸盐以刺激细胞。三天后，细胞在含2%FBS的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤，并用如下结合抗体染色：抗CD3–周环蛋白叶绿素蛋白（PerCP）、抗CD4–异硫氰酸荧光素（FITC）、抗CD25–藻红蛋白（PE）和抗CD127–灿烂紫605（BV605）。在黑暗中孵育30分钟后，T雷格斯（CD25）+川地127?)还有T转换（CD4+CD25?)使用Astrios EQ流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司）进行分类和纯化。
对新鲜T雷格斯（CD25）+川地127?)还有T转换（CD4+CD25?)同一供体在丁酸盐共培养前后产生。简单地说，RNA序列库是使用Illumina TruSeq绞合总RNA试剂盒（Illumina，San Diego，CA，USA）生成的。通过过滤核糖体RNA（rRNA）读取、测序适配器、短片段读取和其他低质量读取，对原始测序读数进行预处理。我们使用Hisat2（版本：2.0.4）将干净读数映射到有两个不匹配的人类hg38参考基因组。在基因组图谱绘制之后，StringTie（1.3.0版）与一个参考注释一起运行，为已知的基因模型生成FPKM（每百万个外显子模型千碱基的读数）。差异表达基因用edge R进行鉴定P多个测试中的值由FDR设置。
共1×105PBMC衍生T雷格斯或分离的破骨细胞前体进行分类，并按照制造商的说明（天根）采集RNA。用总RNA（0.5μg）制备第一链互补DNA（cDNA），作为两步反转录PCR的起始步骤。对于实时PCR，SYBR Green Master Mix与ViiA 7系统（应用生物系统）一起使用。使用了以下引物：HDAC1、atccgcatgactcatatttgc（sense）和ggatggaggcaagattataat（反义）；HDAC2，aaagtctgctactactagacg（sense）和ttatggtcatgcgattat（反义）；HDAC3、ttcaataccctctctcgtgc（sense）和aggtttcaaagattgtctggc（反义）；HDAC4、gccaagatgacttcctctta（sense）和tttcggccatttctgctttag（反义）；HDAC5、ctacgacgtttcatgctaaag（sense）和CACTGTCTGGATCTCATCTAGC（反义）；HDAC6、gtgtcacttcgaaggaatat（sense）和ccacgatggtcttcttcat（反义）；HDAC7，ctcaaactggacacggaag（sense）和aatgagtcattccaggatggt（反义）；HDAC8、tgctgtcctgggaatattacctgc（sense）和aactgaatgcgttcttctcacatctc（反义）；HDAC9、accttcttctttgcccacattac（sense）和ggaacccttgcctaaggctctg（反义）；HDAC10、gcttgtgtacatgagacat（sense）和cagtgaagctctgtgca（反义）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GADPH）、TGCACACACTGCTTAGC（sense）和GGCATGGACTGTGGTCATGAG（反义）。
利用气相色谱法对粪便和血液进行SCFA分析。SCFA分析包括以下脂肪酸：乙酸（C2:0）、丙酸（C3:0）、异丁酸（C4:0I）、丁酸（C4:0N）、异戊酸（C5:0I）、戊酸（C5:0N）、异己二酸（C6:0I）、己酸（C6:0N）和庚酸（C7:0）。使用安捷伦技术1260 A气相色谱系统和火焰离子化检测器进行色谱分析。采用自由脂肪酸相（30m×0.53mm×0.5μm）的熔融石英毛细管柱。以14.4ml/min的流速供给氢气作为载气。初始温度为100℃，保持0.5min，然后以8℃/min的速度升至180℃，并保持1min。然后，以20℃/min的速度将温度升至200℃，最后在200℃保持5min。注入量为1μl，每次分析的运行时间为17.5min。
利用代谢分析仪进一步分析与代谢物浓度相对应的积分峰面积(www.metaboanalyst。加利福尼亚州)代谢物丰度表示为相对于内标物。
用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（Multisciences）测定细胞因子（IL-6和IL-10）浓度，用小鼠抗牛Ⅱ型胶原IgG抗体检测试剂盒（Chondrex）检测胶原特异性抗体效价。所有测量均遵循制造商说明中所述的套件协议。
R包装素食主义者(https://cran.r-project.org/web/packages/vegan/index.html)对微生物群落的α多样性和β多样性进行了分析。用Simpson指数、Shannon指数和均匀度（Pielou指数）来表示多样性。用ADONIS〔置换多元方差分析（PERMANOVA）〕对Bray-Curtis相异距离的主坐标分析（PcoA）进行了分析(https://cran.r-project.org/web/packages/PERMANOVA/index.html)表示β多样性。用Mann-Whitney检验各组间丰度差异的显著性美国用P由Benjamini和Hochberg方法调整的值。对于准配对队列中的配对样本，用Wilcoxon符号秩检验检验物种丰度的统计显著性，用单侧Kolmogorov-Smirnov检验检验物种存在频率的差异。用Spearman秩相关检验或线性回归分析物种丰度与临床标志物的相关性。
实验中，采用双向方差分析（ANOVA）、Tukey多重比较检验和Kaplan-Meier对数秩检验确定各组关节炎评分和发病率的差异。用Mann-Whitney分析两组间细胞因子、抗体或淋巴细胞的差异美国非参数检验。在GrapV7中进行统计分析。00软件（GraphPad，加利福尼亚州圣地亚哥，美国）。双面AP<0.05的值被认为具有统计学意义。