瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）是一种阳离子通道，可作为辣椒素等有害刺激的多模式检测器。因此，辣椒素处理常被用于研究TRPV1的生理功能。本研究报道了新生期大鼠辣椒素处理诱导的生理变化：在SD大鼠出生48小时内系统性给予辣椒素（50毫克/千克）或溶剂对照，6周后检测TRPV1表达、辣椒素水摄入量及伤害性热感觉，并通过生物遥测技术记录昼夜体温节律和运动活动，同时检测Per1、Per2、Bmal1和Hsf1等时钟基因的表达。结果显示：新生期辣椒素处理不仅降低了TRPV1表达，还诱导了对伤害性热刺激的脱敏现象；与溶剂对照组相比，辣椒素处理组大鼠的昼夜体温显著升高，且昼夜体温振幅出现倒置；下丘脑Hsf1和肝脏Per2时钟基因的表达也呈现相似变化趋势。本研究结果可为TRPV1相关生理机制研究提供重要参考。

一、介绍

辣椒素是辣椒的主要成分，其辛辣味和刺激性口感均源于该物质。新生大鼠皮下注射辣椒素可作为神经毒素，特异性破坏特定类型的小直径初级传入神经元。

瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）通道是瞬时受体电位离子通道大家族的成员。该通道是一种配体门控的非选择性阳离子通道，对钙离子具有通透性。体外实验表明，TRPV1可被伤害性热刺激、质子、辣椒素及某些内源性因子激活。因此，辣椒素被视为研究TRPV1介导的感觉纤维功能（包括触觉、痛觉、味觉及温度感觉）的重要工具。

TRPV1研究揭示了多种感觉机制。例如：使用拮抗剂阻断TRPV1可引起啮齿类动物体温升高；但在TRPV1基因敲除小鼠中未观察到该现象，表明体内TRPV1的紧张性活动参与体温调节；大剂量重复注射辣椒素可诱导啮齿类动物对伤害性热刺激产生脱敏。

目前多数TRPV1介导的感觉机制研究通过成年啮齿类动物的长期辣椒素处理实现，而关于新生儿期TRPV1表达降低的生理效应仅有少数报道。

本研究通过新生期辣椒素处理大鼠，观察TRPV1表达变化，并探究其对TRPV1热敏感范围内伤害性热刺激的生理反应。特别采用生物遥测技术记录了自由活动状态下新生期辣椒素处理大鼠的核心体温变化，同时设置溶剂对照组进行对比分析。

二、材料与方法

01.实验动物

本研究的动物设施获国际实验动物评估认证协会（AAALAC）认可，所有实验操作均遵循延世大学机构动物护理与使用委员会制定的指南（IITC-2012-0177）。孕期的斯普拉格-杜勒（SD）大鼠在分娩前1周购入，单独饲养于铺有软垫料的塑料笼中自然分娩。每窝幼鼠随机分配至实验组，于出生后21天断奶，并按性别分笼，每笼3-5只饲养至实验结束。本研究仅使用雄性大鼠。所有动物在12小时光暗循环（光照时间08:00起）、室温22-25℃条件下饲养，自由获取食物和饮水。

02. 新生儿期辣椒素处理

参照既往方法，在SD幼鼠出生48小时内系统性注射辣椒素处理组（50 mg/kg）或溶剂对照组（含10% Tween 80和10%乙醇的生理盐水），给药体积为10 μl/g（体重）。

03.TRPV1免疫荧光染色

辣椒素处理6周后，用戊巴比妥钠（50 mg/kg，腹腔注射）深度麻醉大鼠，先后以肝素化生理盐水和含4%多聚甲醛、0.1%苦味酸的0.1 M磷酸缓冲液（PB，pH 7.4）灌注取材。通过椎板切除术取S1节段背根神经节（DRG），置于含30%蔗糖的0.1 M PB中4℃过夜保护。DRG经冷冻切片机切成14 μm厚切片，室温下用含1%牛血清白蛋白和10%正常山羊血清的0.05 M磷酸盐缓冲液封闭1小时，随后与豚鼠多克隆抗TRPV1抗体（1:1000）孵育。切片与FITC标记的二抗混合物室温孵育1小时后，通过荧光显微镜（BX51）检测信号。每只大鼠随机选取6-10张切片计数TRPV1免疫荧光阳性细胞。

04.辣椒素水摄入量测试

采用双瓶偏好实验评估大鼠对辣椒素的味觉能力。每笼同时放置辣椒素水（1.65 μM溶于0.05%乙醇）和溶剂水（0.05%乙醇），让大鼠自由摄取。连续10天每日记录两瓶水的摄入量。

05.伤害性热感觉评估

参照既往方法，使用足底刺激仪（IITC）测量红外辐射热刺激引起的缩爪潜伏期，设定20秒截断时间以防止组织损伤。另将鼠尾浸入43℃热水中测量缩尾潜伏期，设定15秒截断时间。所有实验以15分钟为间隔重复3次以避免热适应，结果取平均反应值。

06.昼夜节律监测

使用可植入式微型传感器监测生理变化。大鼠在异氟烷（0.5-2%）气体麻醉下于腹腔植入传感器，通过ER4000接收器连续10天自动记录昼夜体温和运动活动数据。数据按12小时光（昼）/暗（夜）周期分段分析。

07.实时荧光定量PCR分析

在光照开启后3小时（ZT3）或关闭后3小时（ZT15）处死大鼠，取下丘脑和肝脏组织。取2 mm³组织块，使用RNeasy Micro试剂盒提取总RNA。通过逆转录系统合成cDNA，采用SYBR Green PCR预混液在20 μl体系中进行实时荧光定量PCR反应。使用2−ΔΔCT法以GAPDH为内参计算生物钟基因（Per1、Per2、Bmal1、Hsf1）的相对表达量，引物序列见表1。

08.统计分析

数据以均值±标准误表示，符合正态分布时采用Student t检验，非正态分布时采用Mann-Whitney秩和检验。P < 0.05视为具有统计学显著性，所有分析通过SigmaStat软件（v3.5）完成。

三、结果

01.新生儿期辣椒素处理减少TRPV1阳性DRG神经元数量

辣椒素处理组大鼠背根神经节（DRG）中TRPV1免疫荧光阳性神经元比例降至5.12%，与溶剂对照组相比显著降低15.8%（图1A、B）。实时荧光定量PCR结果显示，辣椒素处理组L5节段DRG中TRPV1 mRNA表达量较溶剂对照组下降约40%（图1C）。

图1. 辣椒素处理大鼠TRPV1阳性DRG神经元数量减少。S1节段背根神经节TRPV1免疫荧光染色及阳性神经元比例（A和B）；L5节段背根神经节TRPV1 mRNA表达的定量分析（C）。数据以均值±标准误表示。*P < 0.01。

02.新生儿期辣椒素处理损害辣椒素感知与伤害性热反应能力

溶剂对照组大鼠明显偏好普通饮水而非辣椒素水，而辣椒素处理组未表现出对两种饮水的偏好差异。辣椒素处理组的辣椒素水摄入量显著高于溶剂对照组（图2A）。

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在足底测试（Hargreaves法）中，辣椒素处理组对红外辐射热刺激的缩爪潜伏期显著延长（图2B）。在43℃热水浸尾实验中，辣椒素处理组的缩尾潜伏期也显著增加（图2B）。

图2. 新生儿期辣椒素处理后辣椒素感知与伤害性热刺激反应能力受损。辣椒素水与溶剂水摄入量对比（A）；后爪与尾部对伤害性热刺激的退缩潜伏期（B）。数据以均值±标准误表示。*P < 0.01。

03.新生儿期辣椒素处理导致昼夜体温节律异常而运动节律正常

基于12小时光暗周期分析昼夜节律。辣椒素处理组与溶剂对照组大鼠的腹腔温度均在昼夜交替时发生明显变化（图3A）。值得注意的是，辣椒素处理组夜间体温较对照组显著升高（图3B），且其体温昼夜波动幅度出现倒置现象（图3C）。然而两组动物的运动活动节律保持正常，未见显著差异（图3D）。

图3. 通过生物遥测技术记录的大鼠昼夜节律。异常昼夜体温节律（A）与正常昼夜运动节律（B）。数据以均值±标准误表示。*P < 0.01。

溶剂对照组大鼠表现出正常的昼夜体温节律：夜间体温最高，白天体温最低。而辣椒素处理组呈现出相反的节律模式：夜间体温最低，白天体温最高，该差异具有统计学意义（图3A）。值得注意的是，辣椒素处理组无论昼夜体温均显著高于溶剂对照组（图3A）。在运动活动方面，两组大鼠均表现出典型的啮齿类动物昼夜节律特征：夜间活动量最高，白天活动量最低（图3B）。统计分析表明，两组间的运动活动节律趋势相似且无显著差异（图3B）。

04.生物钟相关基因表达变化

我们重点关注生物钟基因对昼夜节律的调控作用。通过检测生物钟基因mRNA表达的昼夜变化发现（图4），所有检测基因（Per1、Per2、Bmal1和Hsf1）均保持表达，其中Per2和Hsf1在两组间呈现差异表达。辣椒素处理组肝脏Per2基因在ZT3时点的表达显著升高；下丘脑Hsf1基因在ZT15和ZT3时点的表达均显著增加，且在ZT3时点达到峰值；肝脏Hsf1基因在ZT3时点也显著上调。Per1和Bmal1基因的表达在两组间未呈现显著差异。

图4. 下丘脑与肝脏中内源性生物钟基因表达情况。通过实时荧光定量PCR检测Per1、Per2、Bmal1和Hsf1的mRNA表达水平。ZT15：23:00；ZT3：11:00。数据以均值±标准误表示。*P < 0.05；**P < 0.001。

四、讨论

本研究旨在探讨新生儿期辣椒素处理对大鼠TRPV1表达及生理反应的影响。结果表明，辣椒素处理组大鼠TRPV1通道表达降低，从而导致伤害性热感觉异常和昼夜体温节律紊乱，尤其表现为体温昼夜波动幅度倒置。

TRPV1作为感觉机制研究中的重要通道，已通过基因敲除小鼠模型在感觉感知和体温调节等领域得到广泛应用。近年来，TRPV1拮抗剂诱导的生理变化研究也取得显著进展。由于TRPV1被确认为辣椒素受体，利用辣椒素毒性诱导TRPV1脱敏的方法已被广泛采用。

辣椒素因其刺激性可导致口腔黏膜疼痛反应，动物通常排斥含辣椒素的食物。TRPV1同时响应43℃以上的伤害性热刺激。本研究通过辣椒素水厌恶实验及爪尾退缩反应测试，证实辣椒素处理组大鼠因TRPV1系统性缺失及DRG神经元损伤，表现出辣椒素味觉识别能力和伤害性热反应能力缺陷。值得注意的是，成年大鼠需持续辣椒素处理才能减少TRPV1阳性初级传入神经元，而新生儿期单次处理即可诱导DRG中TRPV1表达的长期抑制，该现象在皮肤组织中亦有报道。

TRPV1拮抗剂处理通常引起体温升高。本实验室前期研究显示，使用TRPV1拮抗剂辣椒平处理后1小时内体温显著上升（数据未显示）。辣椒素处理组大鼠呈现与拮抗剂处理相似的体温升高现象，但其特点是通过TRPV1表达减少诱导长期性高热效应。尽管新生儿辣椒素处理的神经毒性机制与TRPV1拮抗剂存在本质差异，但高热效应可作为研究TRPV1靶向镇痛的重要副效应指标，因此该模型对TRPV1介导的体温调节机制研究具有潜在价值。

正常啮齿类动物因夜行性行为特征，夜间体温较白天升高约1℃。溶剂对照组保持该正常节律，而辣椒素处理组呈现节律倒置。为阐明该现象，我们重点分析了下丘脑和肝脏生物钟基因表达。下丘脑作为中枢体温调节核心区域，其视交叉上核（SCN）控制运动活动、体温和内分泌等昼夜节律，并对不同器官生物钟起同步化调节作用。肝脏作为代谢核心器官需快速适应环境周期变化，其节律受SCN控制的系统信号调控。本研究检测到Per1、Per2、Bmal1和Hsf1等生物钟基因在下丘脑和肝脏中的表达，其中Hsf1和Per2在辣椒素处理组出现异常表达。

正调节因子Bmal1的mRNA表达在白天开始时达到峰值，而负调节因子Per1和Per2的表达与之相反。本研究新发现辣椒素处理组Hsf1和Per2基因异常表达：Hsf1不仅是热应激反应的关键转录因子，其表达量更与人体每日体温波动同步；近期研究证实Hsf1在高体温状态下调控TRPV1基因，脂多糖诱导的高热状态可导致下丘脑Hsf1表达增加，这与辣椒素处理组白天异常高热伴下丘脑Hsf1高表达的结果一致。肝脏Hsf1在白天呈现与下丘脑相似的表达增加模式，这可能是SCN对不同器官生物钟基因的同步化调控效应。

既往研究表明，下丘脑中Per2与Hsf1基因呈现相似表达模式。本研究发现辣椒素处理组白天肝脏Per2表达较对照组显著增加，其变化趋势与肝脏Hsf1表达相似，但下丘脑Per2表达未随Hsf1同步增加，提示辣椒素处理可能破坏了下丘脑Per2与Hsf1的基因网络调控。我们推测异常高热可能通过影响Hsf1和Per2表达，进而干扰生物钟基因网络的正常运行。目前本实验室正致力于研究新生儿辣椒素处理大鼠下丘脑和肝脏中Per2与Hsf1基因的同步化高表达机制，以期揭示生物钟基因网络的调控机制。

值得注意的是，虽然我们最初推测异常高热可能导致运动节律倒置及白天失眠等问题，但辣椒素处理组仍保持与对照组相似的"昼低夜高"运动节律。既往研究提示进食时间改变等异常行为可 altering 体温节律，本研究则发现该现象与Hsf1和Per2异常表达相关。现有结果未发现生物钟基因与运动活动间的直接关联，表明时钟基因表达改变可能不影响辣椒素处理组的运动节律。

综上所述，新生儿期辣椒素处理通过降低TRPV1表达，诱导伤害性热感觉异常和昼夜体温节律紊乱，并引起Hsf1和Per2等生物钟基因表达改变。这些发现为TRPV1相关生理机制研究提供了重要实验依据。

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