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本文刊于：2022,24(6) : 844-848,853.

       目的    探讨Klotho通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和胞外信号调控激酶(ERK)途径对高糖条件下人肾小管上皮细胞自噬的影响。方法    将体外培养人肾小管上皮细胞分为对照组和高糖(HG组，加入30 mmol/L葡萄糖)；按照转染pcDNA3.1-Vector或pcDNA3.1-Klotho分为两组：Vector组和Klotho组；按照转染pcDNA3.1-Klotho后是否加入AMPK抑制剂compound C或ERK抑制剂curcumin和高糖刺激分为4组：HG+Vector组、HG+Klotho组、HG+Klotho+compound C组和HG+Klotho+curcumin组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)法检测各组细胞Klotho的表达；Western blot法检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，p-AMPK/AMPK和p-ERK/ERK的相对表达；透射电镜观察人肾小管上皮细胞自噬体的变化。结果    HG组人肾小管上皮细胞中Klotho蛋白和mRNA相对表达量显著低于对照组(均P<0.05)；Klotho组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著高于Vector组(P<0.05)；Klotho组的自噬体数量也较Vector组明显增加(P<0.05)；Klotho组p-AMPK/AMPK显著高于Vector组(P<0.05)，而p-ERK/ERK显著低于Vector组(P<0.05)。HG+Klotho+compound C组中p-AMPK/AMPK蛋白相对表达量(0.44±0.04)显著低于HG+Klotho组(0.79±0.08)(P<0.01)，HG+Klotho+curcumin组中p-ERK/ERK蛋白相对表达量(1.05±0.12)显著高于HG+Klotho组(0.56±0.05)(P<0.01)。HG+Klotho+compound C组和HG+Klotho+curcumin组中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白相对表达量(0.79±0.12；0.68±0.09)显著低于HG+Klotho组(1.65±0.20)(均P<0.01)。结论    Klotho可通过激活AMPK和抑制ERK通路增强高糖条件下人肾小管上皮细胞的自噬。

       糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)中最常见、最严重的微血管并发症之一^[1]，已成为世界范围内终末期肾病的主要病因^[2]。然而，关于DKD病理机制的相关研究十分有限。因此，DKD发病机制的深入研究对开发新的靶向治疗方法具有重要意义。自噬作为一种重要的应激反应机制，与糖尿病患者肾脏的肾小管间质病变密切相关^[3]。有研究证实，腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)通路的改变可抑制自噬，导致DKD的发生^[4]。因此，自噬相关分子机制的探究对DKD的治疗至关重要。前期研究证明，DKD患者的肾小管中Klotho表达明显降低^[5]。研究证实Klotho与自噬密切相关^[6]。因此，本研究拟进一步探究Klotho在DKD自噬中的作用及相关机制。

1.1　实验材料    人肾小管上皮细胞购于上海中科院细胞库。DMEM/F12培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)；脂质体Lipofectamine 3000(美国Invitrogen公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；反转录试剂盒(中国Takara公司)；SYBR Green qPCR试剂盒(中国Takara公司)；RIPA裂解液(中国Beyotime公司)；BCA试剂盒(中国Beyotime公司)；Klotho单克隆抗体(美国Abcam公司；1∶1 000)；LC3B单克隆抗体(美国Abcam公司；10 μg/ml)；AMPK单克隆抗体(美国Abcam公司；1∶2 000)；p-AMPK单克隆抗体(美国Abcam公司；1∶5 000)；胞外信号调控激酶(ERK)1/2单克隆抗体(美国Abcam公司；1∶10 000)；p-ERK1/2单克隆抗体(美国Abcam公司；0.1 μg/ml)；GAPDH单克隆抗体(美国Abcam公司；1∶2 000)。

1.2　细胞培养和分组    将人肾小管上皮细胞于含10% FBS的DMEM/F12培养液中，在37 ℃，5% CO2的条件下培养，2~3 d传代一次。细胞分组：对照组和高糖组[(HG组)，30 mmol/L葡萄糖)]；Vector组(pcDNA3.1-Vector)和Klotho组(pcDNA3.1-Klotho)；HG+Vector组(30 mmol/L葡萄糖和pcDNA3.1-Vector)、HG+Klotho组(30 mmol/L葡萄糖、pcDNA3.1-Klotho)、HG+Klotho+compound C(30 mmol/L葡萄糖、pcDNA3.1-Klotho和AMPK抑制剂compound C)和HG+Klotho+curcumin组(30 mmol/L葡萄糖、pcDNA3.1-Klotho和ERK抑制剂curcumin)。

1.3　实时荧光定量PCR(qRT-PCR)    用Trizol试剂提取各组人肾小管上皮细胞总RNA，用NanoDrop ND-1000分光光度计检测质量。1 μg总RNA被反转录成cDNA。用qRT-PCR实验检测Klotho mRNA的表达。各引物分别为人Klotho：5′-GAAAAATGGCTTCCCTCCTT-3′(正向引物)和5′-ACAACTCCCCAAGCAAAGTC(反向引物)；人β-actin：5′-GCAAGTGCTTCTAGGCGGAC-3′(正向引物)和5′-AAGAAAGGGTGTAAAACGCAGC-3′(反向引物)。采用2-ΔΔCt法计算Klotho mRNA的相对表达量。

1.4　蛋白免疫印迹(Western blot)实验    收集和裂解各组人肾小管上皮细胞，离心后，收集上清蛋白。使用BCA试剂盒测定蛋白质浓度后，在95 ℃下变性。将等量的蛋白质加入到10% SDS-PAGE凝胶上样孔中，经电泳和转膜，蛋白用5%脱脂牛奶封闭，一抗在4 ℃下孵育过夜，过氧化物酶偶联的二抗孵育1 h。用增强化学发光法来显色，并扫描结果。Image J软件计算各条带的灰度值。

1.5　透射电子显微镜    2.5%戊二醛固定后，各组人肾小管上皮细胞分别经过1%四氧化锇、0.5%鞣酸和1%硫酸钠的处理，包埋并进行超薄切片。用醋酸铀酰和柠檬酸铅分别染色各组切片。JEM-1230透射电镜检测超薄切片中的自噬体。

1.6　统计学处理    采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。正态分布的计量资料用x±s表示。多组计量资料比较采用F检验；两两计量资料比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。所有实验重复3次。

2.1　高糖刺激后Klotho在人肾小管上皮细胞中的相对表达量    与对照组比较，HG组Klotho mRNA表达下降至54.3%，且差异具有统计学意义(P<0.01，图1A)。与Klotho mRNA的表达变化一致，Western blot结果也显示HG组的Klotho的蛋白水平相对于对照组下降，且差异具有统计学意义(P<0.01，图1B)。

图1    高糖条件培养的人肾小管上皮细胞中Klotho表达情况　A：实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Klotho mRNA的表达；B：蛋白免疫印迹(Western blot)法检测Klotho蛋白的表达(B1为条带图；B2为柱状图)；HG组为高糖组，加入30 mmol/L葡萄糖；与对照组比较，aP<0.05

2.2　高糖条件培养的人肾小管上皮细胞过表达    lotho后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白的表达变化    高糖处理24 h后，Klotho组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的相对表达与Vector组比较差异无统计学意义(P>0.05)；高糖处理48 h后，Klotho组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相对表达增加至Vector组的1.2倍，且差异具有统计学意义(P<0.01)；高糖处理72 h后，Klotho组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相对表达增加至Vector组的1.9倍，且差异具有统计学意义(P<0.01)。见图2。

图2    过表达Klotho后各组高糖刺激的人肾小管上皮细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相对表达情况　A：蛋白免疫印迹(Western blot)法检测LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白的表达；B：LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相对表达量的柱状图；Vector组和Klotho组分别在高糖处理后转染pcDNA3.1-Vector或pcDNA3.1-Klotho；与Vector组比较，aP<0.05，bP<0.01

2.3　高糖条件培养的人肾小管上皮细胞过表达Klotho后自噬体的变化    高糖培养的人肾小管上皮细胞分别转染pcDNA3.1-Vector和pcDNA3.1-Klotho 72 h后，用透射电子显微镜检测各组自噬体的变化。结果显示，在高糖条件培养的人肾小管上皮细胞中，Klotho组的自噬体数量较与Vector组明显增加(图3)。

图3    过表达Klotho后高糖刺激的人肾小管上皮细胞中自噬体的变化(×13 500)　Klotho组(B)的自噬体数量较Vector组(A)明显增加。黑色箭头表示细胞器和其他细胞质成分受损的自噬体

2.4　高糖条件培养的人肾小管上皮细胞过表达    Klotho后p-AMPK、AMPK、p-ERK和ERK蛋白的表达变化在高糖条件培养的人肾小管上皮细胞中，Klotho组中p-AMPK/AMPK相对表达量(1.05±0.12)显著高于Vector组(0.71±0.09)，差异具有统计学意义(P<0.05)；且Klotho组中p-ERK/ERK相对表达量(0.87±0.08)显著低于Vector组(1.21±0.14)，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4    过表达Klotho后各组高糖刺激的人肾小管上皮细胞中p-AMPK、AMPK、p-ERK和ERK蛋白的表达情况　A：高糖刺激的人肾小管上皮细胞转染Klotho过表达载体72 h后，蛋白免疫印迹(Western blot)法检测p-AMPK、AMPK、p-ERK和ERK蛋白的表达；B：p-AMPK/AMPK和p-ERK/ERK相对表达量的柱状图，与Vector组比较，aP<0.05

2.5　高糖条件培养的人肾小管上皮细胞过表达    lotho并给予Compound C或curcumin处理后，p-AMPK/AMPK、p-ERK/ERK、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ变化情况    为了进一步确认AMPK和ERK是否参与Klotho介导的高糖诱导的人肾小管上皮细胞自噬的调节，Klotho过表达质粒转染后，使用AMPK抑制剂compound C和ERK抑制剂curcumin分别处理高糖条件下培养的人肾小管上皮细胞，结果显示，HG+Klotho组中p-AMPK/AMPK相对表达量(0.79±0.08)显著高于HG+Vector组(0.39±0.05)(P<0.01)；HG+Klotho+compound C组中p-AMPK/AMPK相对表达量(0.44±0.04)显著低于HG+Klotho组(0.79±0.08)(P<0.01)(图5A、B)。HG+Klotho组中p-ERK/ERK相对表达量(0.56±0.05)显著低于HG+Vector组(1.12±0.08)(P<0.01)；HG+Klotho+curcumin组中p-ERK/ERK相对表达量(1.05±0.12)显著高于HG+Klotho组(0.56±0.05)(P<0.01)(图5A、C)。HG+Klotho组中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相对表达量(1.65±0.20)显著高于HG+Vector组(0.87±0.11)(P<0.01)；HG+Klotho+compound C组和HG+Klotho+curcumin组中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白相对表达量(0.79±0.12；0.68±0.09)显著低于HG+Klotho组(1.65±0.20)(均P<0.01)(图5A、D)。

图5    Compound C或curcumin处理后Klotho过表达的高糖刺激的人肾小管上皮细胞中p-AMPK、AMPK、p-ERK、ERK、LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ蛋白的表达情况　A：蛋白免疫印迹(Western blot)法检测p-AMPK、AMPK、p-ERK、ERK、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白的表达；B：p-AMPK/AMPK相对表达量的柱状图；C：p-ERK/ERK相对表达量的柱状图；D：LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相对表达量的柱状图，与HG+Vector组比较，aP<0.01；与HG+Klotho组比较，bP<0.05

       DKD的发病机制复杂，其主要病理特征包括基底膜增厚，肾小球和肾小管肥大，系膜扩张，肾小球硬化和肾小管间质纤维化^[7]。在外界刺激因素(炎症、缺氧和高糖)的作用下，肾小管更易受到各种代谢和血流动力学波动影响。肾小管的损伤是DKD发病和发展的重要原因^[8]。基于肾小管在DKD中的重大作用，本研究采用人肾小管上皮细胞来研究高糖诱导DKD的潜在机制以进一步寻找治疗靶点。

       自噬抑制是高糖诱导的DKD的一个关键因素^[9]。研究表明，自噬抑制可导致细胞损伤的积累，进而导致代谢性或年龄相关性肾脏疾病^[10]。此外，高血糖也会触发活性氧(ROS)和凋亡，导致DKD^[11]。因此，自噬的诱导是治疗DKD的一个潜在策略。

       Klotho作为一种抗衰老蛋白，主要在肾小管上皮细胞表达^[12]。临床研究通过探究Klotho与DKD的潜在关联，发现Klotho与DKD的发生呈负相关^[13]。本研究证明Klotho在高糖刺激的人肾小管上皮细胞中低表达，与前人研究一致^[14]。此外，Klotho也已被证明与自噬相关。例如，在阿尔茨海默病和急性肾损伤中，Klotho表达上调可促进自噬清除，减轻细胞损伤^[15]。因此，自噬是Klotho通路的关键机制，也是DKD的核心^[16]。本研究探究了Klotho对肾小管细胞的保护作用，并证明Klotho诱导了人肾小管上皮细胞的自噬，可能是DKD保护作用的重要机制。

       Klotho的生物学功能涉及多种途径。通过选择性抑制剂或激活剂的使用，本研究发现Klotho可显著诱导AMPK的激活和ERK的失活，最终调节自噬活性。AMPK作为细胞代谢的主调节器，与多种能量和代谢途径相关。同时AMPK信号通路的改变可能抑制自噬，导致DKD，进而加重肾损伤^[5]。ERK作为有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的重要成员之一，与细胞增殖、存活和分化相关^[17]。ERK信号通路在能量稳态中发挥重要作用，如调节糖酵解和脂肪生成。此外，ERK通路是2型糖尿病的重要因素^[18]。因此，本研究证实了Klotho通过AMPK和ERK途径调节人肾小管上皮细胞的自噬活性。

       综上所述，本研究发现了一种Klotho对人肾小管上皮细胞的保护作用的新机制，并证明Klotho介导的自噬调控可能是一种治疗DKD的新靶点。然而，明确Klotho对DKD自噬的影响和机制尚需要进一步动物实验来验证。另外，Klotho激活高糖条件下人肾小管上皮细胞AMPK和ERK通路的具体机制仍需进一步研究。

利益冲突    所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）