PMMA 基水泥是椎体成形术和全髋关节置换术中最常用的骨水泥。然而，它们存在一些缺点，包括易受细菌感染、单体泄漏毒性和高聚合温度，这些都可能导致周围组织损伤和失败。在本研究中，引入银纳米线 (AgNWs) 以赋予其抗菌特性；引入壳聚糖 (CS) 以促进孔隙率并降低聚合温度，而不会对机械性能产生负面影响；引入甲基丙烯酰壳聚糖 (CSMCC) 以促进与甲基丙烯酸甲酯 (MMA) 的交联并减少聚合所需的单体量。配制了新型 PMMA 水泥，其中含有 AgNWs (0 和 1% w/w) 和不同浓度 (0、10、20 和 30% w/w) 的 CS 或 CSMCC，测试了两种不同的粉末和 MMA (P/L) 比例。测试了所得复合水泥的机械、热、抗菌和细胞毒性性能。CS 浓度 > 10% 的水泥聚合温度显著降低。浓度 > 20% 且 P/L 浓度等于 2:1 时，机械性能会受到影响。低至 1% w/w 的 AgNW 浓度赋予了对金黄色葡萄球菌的抗菌活性，而当制剂中加入 CS 时，水泥表面的生物膜形成增加。CS 和 AgNW 的组合允许更高浓度的 Ag +随时间释放，同时增强抗菌活性。加入 AgNW 不会影响支架上的细胞活力。总之，CS 和 AgNW 的组合可能有利于降低聚合温度和生物膜形成，而不会显著影响支架上的间充质干细胞增殖。降低 P/L 比或使用 CSMCC 代替 CS 并未发现任何优势。

一、介绍

聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）是目前最常见的骨水泥，用作骨中的螺钉、假体或植入物固定器、骨腔或颅骨缺损的填充物以及骨质疏松患者的椎体成形术。PMMA 珠粒与液体单体（甲基丙烯酸甲酯，MMA）结合形成浆体，一旦注入，浆体就会与周围形状相符，从而分散植入物负荷，并在单体聚合后与骨骼形成牢固的机械结合。尽管 PMMA 的应用十分广泛，但它仍受到许多限制的阻碍：缺乏生物活性、骨水泥与骨骼的结合不良、骨骼与骨水泥之间的硬度不匹配、放热反应温度高可能导致组织坏死，以及单体毒性，其特征是血压突然下降。此外，据报道，MMA 可能通过直接接触皮肤（皮炎）或吸入引起过敏反应。最后，与任何生物材料植入相关的一个重要风险是发生感染，这可能导致生物膜形成和植入物失败。

为了促进 PMMA 骨更好地整合，一种策略是通过添加可生物降解的材料来增加水泥的孔隙率。例如，壳聚糖可以随着时间的推移而降解，留下粗糙多孔的三维 (3D) 结构，骨骼可以在其中生长，由于骨骼和水泥之间的互锁得到改善，固定更加稳定。在骨水泥中使用添加剂的另一个优点是它们能够消散聚合反应产生的热量，从而最大限度地降低骨坏死的风险；甲基丙烯酸缩水甘油酯 (GMA) 和甲基丙烯酸三甲氧基硅丙基酯 (3MPMA) 已被用于降低聚合温度。或者，用甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）对壳聚糖进行功能化以促进与 MMA 的交联也可以产生类似的效果。

PMMA 植入可能会因骨髓炎的发生而变得复杂，骨髓炎是一种通常由金黄色葡萄球菌引起的骨细菌感染。感染会导致骨质破坏，从而增加治疗失败率。由于越来越多的细菌对抗生素产生耐药性，人们的注意力已经转向纳米技术提供的替代品，例如银纳米线 (AgNW)。例如，装入 PMMA 基水泥中的油酸封端 AgNW (5.3 ± 2.3 nm) 在 0.05% 的低浓度下显示出对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) 和金黄色葡萄球菌的抗菌活性。研究人员配制了一种 PMMA 骨水泥，其中负载了用聚乙烯吡咯烷酮功能化的银 NP（30-50 纳米），浓度分别为 0.25%、0.5% 和 1%。悬浮液中未发现抗菌活性，但所有浓度的 AgNP 均能显著减少支架上的生物膜生长。然而，所有这些系统都存在一个关键问题，即 PMMA 的生物降解性和连接性极差。如果塑料不降解，银就不会与生理液体接触、氧化并对细菌细胞产生影响。

在目前的工作中，我们报告了含有壳聚糖 (CS) 或甲基丙烯酰壳聚糖 (CSMCC) 的新型 PMMA 复合材料的制备和表征，以降低聚合温度，改变机械行为，有利于孔隙的形成，以及可以通过控制银离子释放而提供延长抗菌效果的 AgNW，比球形纳米粒子更持久。我们进一步研究了复合材料的细胞相容性、抗菌性和机械性能。

二、材料和方法

DePuy SmartSet MV 中等粘度骨水泥购自 eSutures.com (伊利诺伊州莫凯纳)。低粘度虾壳壳聚糖（经 GPC-MALLS 测定，分子量为149.9 ± 4.7 kDa，分子量为170.5 ± 4.9 kDa，经1 H NMR 计算，脱乙酰度约为 85%）、聚乙烯吡咯烷酮粉末（55 kDa）以及所有其他试剂（除非另有说明）均购自 Sigma-Aldrich (英国欧文)。含glutaMAX和酚红的DMEM高糖培养基、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）、甘油、热灭活胎牛血清、异丙醇、MTT、PBS pH 7.4、鬼笔环肽Dylight 550、台盼蓝染色剂、硝酸银、含酚红的胰蛋白酶0.25％EDTA、×100青霉素/链霉素均购自Fisher（英国拉夫堡）。ATPlite发光ATP检测分析系统购自PerkinElmer（英国考文垂）。氯化氘（D，99.5%，DCL 20%）、氧化氘（D，99.9%）和二甲基亚砜-d6 （ D，99.9%）+0.05% v/v 四甲基硅烷（TMS）均购自剑桥同位素实验室（马萨诸塞州特克斯伯里）。

2.1 CSMCC的合成与表征

将壳聚糖（CS，2 g）均匀分散在 0 °C 的甲磺酸（11 mL）中，并顶置式搅拌器搅拌 2 小时。然后将甲基丙烯酰氯（MCC，12 mL）滴加到壳聚糖分散体中，并将浅棕色反应混合物在 0 °C 避光条件下继续搅拌 4 小时。将反应混合物倒入冷水中，用氨水（35% v/v）中和后得到淡奶油色沉淀。将沉淀物在去离子水中透析 1 天，然后在室温下以 2880 g离心20 分钟（×3）回收固体；将颗粒在 40 °C 下真空干燥，然后粉碎得到细粉。

使用 Varian FT-IR 640-IR 仪器（Agilent，加利福尼亚州圣克拉拉）记录 FT-IR 光谱，并使用 Agilent Resolutions Pro 软件处理光谱。对于1 H NMR 分析，将 CSMCC 溶解在含有 0.5% TMS 标准的 DMSO - d 6中；将壳聚糖溶解在 D 2 O:DCl（98:2）中；将甲基丙烯酰氯（200 μL）与 800 μL CDCl 3混合。所有样品均使用 Jeol Eclipse + 400 MHz NMR 仪器（Oxford Instruments，英国牛津）进行分析。反应产物中的取代度（DS%）根据以下公式确定

其中I v1和I v2是分配给甲基丙烯酰氯中存在的两个乙烯基质子的信号的积分强度，而I a是异头质子的积分强度。

粉末粒度采用 Helos 粒度仪、RODOS 干分散装置和 ASPIROS 微剂量模块（Sympatec GmbH，德国克劳斯塔尔-采勒费尔德）通过激光衍射测定；测量时使用 2 巴的压力。

在悬浮液中评估了 CS 和 CSMCC 对金黄色葡萄球菌的抗菌特性。在无菌溶源肉汤 (LB) 中制备 10 mg/mL 原液 CS 和 CSMCC，进一步在紫外线下灭菌过夜，并在 40 Hz 下超声处理 20 分钟后进行测试。抗菌研究根据研究人员的方法进行，并进行了一些修改。将金黄色葡萄球菌(ATCC 25923) (10^6 CFU/mL) 加入 CS 和 CSMCC 悬浮液 (最终浓度为 0.2、0.4、0.8、1、2、5 和 10 mg/mL) 中，并用无菌 LB 培养基将体积定容至 2 mL，放入 8 mL 无菌密封瓶中。在 37 °C 下孵育并以 200 rpm 的速度摇动 12 小时 (MaxQ 8000，Thermo Scientific) 后，通过测量悬浮液在 600 nm 处的光密度 (OD 600nm ) 来确定细菌浓度。使用不同浓度的 CS 和 CSMCC 原悬浮液以及纯 LB 作为空白对照。实验重复进行三次 ( n =3)。

2.2 银纳米线的合成与表征

AgNW 是使用多元醇法合成的，如前所述。获得了平均长度为 5 μm、平均直径为 99 nm 的 AgNW。

制备并测试了具有不同添加剂浓度和/或粉末与液体单体比例的水泥配方（表1）。使用涡旋器（Fisherbrand）将选定比例的粉末均匀混合，然后按照所需的 P/L 比例与液体单体混合，用抹刀手动混合，直到粉末完全湿润。如果制备过程中包含 AgNW，则将冷冻干燥的 AgNW 悬浮在 MMA 中，以 40 Hz 的频率进行超声处理至少 20 分钟，然后再与粉末混合。当混合物变成面团状且更易于处理时，将整个混合物转移到定制的 10 孔 PTFE 模具（直径 6 毫米，高 12 毫米）中并手动压制。让水泥固化 1 小时，然后从模具中取出并在室温下储存在干燥器中直至进一步使用。

重量损失和吸水量以平均值±SD（ n≥3 ）表示。进行了 Dunnett 多重比较检验，以将每个样品的结果与对照（PMMA_2:1）的结果关联起来。

2.3 热行为

凝固温度的测量按照陈等人的方法进行，并略作调整。将 MMA 添加到粉末中（3 克）并混合直至面团完全湿润。将其放入塑料容器中（直径 3.5 厘米 × 高 1 厘米），并将三个热电偶插入面团表面下几毫米处，使用数据采集软件 Pico Technology 的 Pico Log 以 5 秒为间隔测量并记录温度，持续 25 分钟。绘制温度与时间的关系图以确定峰值温度 ( T max ) 和凝固时间 ( t set )。凝固时间是放热温度达到环境温度 ( T amb ) 和峰值温度 ( T max ) 之间的中点温度的时间点。使用以下公式确定凝固温度

2.4 降解研究

通过测定在 PBS 中孵育后的重量损失、吸水率和孔隙率变化来评估复合水泥的可降解性。将水泥样品浸入 PBS（pH = 7.4）中，并放置在 37 °C 的孵育箱中 4 周，以 90 rpm 的速度摇动（Grant，剑桥，英国）；每周更换一次 PBS 培养基。在预定的时间点，取出样品并称重（去除多余液体后）。然后将样品在 37 °C 的真空烘箱中干燥 3 天，然后测量其最终重量。应用 Kim 等人报告的方程式确定吸水率和重量损失。使用高分辨率 X 射线计算机断层扫描 XCT（Xradia 520 Versa，Carl Zeiss X 射线显微镜，CA）检查总孔隙率和孔径，然后使用 Avizo（9.3.0，FEI 公司）分析 3D 数据。使用 60 kVp 管电压、84 μA 管电流和 ZEISS LE1 滤波器收集图像。各向同性体素尺寸为 6.11 μm，在 360° 上收集了 1601 个投影，每个投影的曝光时间为 3 秒。重建后，选择感兴趣的体积并应用阈值来分割孔隙。从分割的图像中，计算出孔隙的体积和总孔隙率。与图像边缘接触的孔隙被排除在分析之外。每种类型测试了六个样品的重量减轻和吸水率。对每种类型的一个样品进行三次分析，以测定孔隙率和孔径。

2.5 机械行为

进行抗压试验以评估极限抗压强度 (UCS) 和杨氏模量 ( E )。将水泥制成如上所述的圆柱形，打磨两端，使用游标卡尺精确测量直径和长度。使用定制的对准系统将水泥圆柱体嵌入环氧树脂金属端盖后，以 0.02 毫米/秒的速度测试高达 25% 的压缩率（MTS Bionix，MTS Systems Corp.，明尼苏达州伊甸草原）。在降解前后，每种水泥类型测试了六个样品。

2.6 形态特征

使用高分辨率扫描电子显微镜（SEM，Jeol JSM-6160L）观察了降解前后水泥的外表面。使用 Polaron e500 仪器（Quoram Technologies，英国）对样品进行镀金。使用 ImageJ（版本 1.8.0）软件确定表面孔径。

2.7 银释放研究

将水泥放入 5 mL HPLC 级水中，在 37 °C 下振荡（90 rpm）培养，研究银离子的释放情况。在预定时间，取出 1 mL 上清液，用 1 mL 淡水代替。银离子浓度通过炉原子吸收分光光度计（VarianSpectrAA 220FS）测定，波长和光谱带宽分别为 328.1 和 0.2 nm。将银标准品（1 g/L）稀释在去离子水中（范围为 1–5 mg/L），绘制校准曲线。

2.8 水泥表面生物膜的形成

直接在 96 孔板中制备水泥。第二天，用 70% 乙醇处理 30 分钟，用无菌水清洗三次，进行灭菌。然后，在层流中用紫外线照射 1 小时。将 100 μL 的 LB 培养基中的 1 × 10^6 CFU /mL金黄色葡萄球菌悬浮液接种到每个孔中，并在 37 °C 下孵育 24 小时。除去培养基，用 PBS 轻轻清洗每个孔一次，以去除松散粘附的细菌。进行 MTT 测定以量化粘附在水泥表面的细菌：将 100 μL 的 PBS 中的 0.5 mg/mL MTT 溶液加入每个孔中，然后将板在黑暗中孵育 1 小时。弃去上清，加入DMSO溶解细胞内的甲臜盐，将紫色溶液转移至新的96孔板中，以DMSO为空白，在570nm处读取吸光度，实验重复三次。

2.9 细胞毒性研究

原代绵羊间充质干细胞是根据项目许可证号 PPL70/8247 获得的，并获得了英国伦敦皇家兽医学院动物福利和伦理审查委员会 (AWERB) 的伦理批准。细胞在第 2 代和第 5 代之间使用。细胞在高葡萄糖 DMEM 中生长，其中添加了 1% 青霉素/链霉素和 10% 热灭活 FBS。细胞在 37 °C 和 5% CO 2的培养箱中生长至 70% 汇合，然后用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 分离。将细胞悬浮液以 400 g离心5 分钟（Eppendorf Centrifuge 5702，英国），将沉淀物重新悬浮在培养基中，计数并接种到圆筒上。制造一天后，将水泥圆柱体以 1:5 的重量与体积比浸入完全 DMEM 中，并在 37°C 下孵育 24 小时。取出 DMEM，通过 0.22 μm 过滤器过滤，然后冷冻直至进一步使用；这些样品用于测试水泥提取物的生物相容性。细胞在 96 孔板中以 5 × 10 3 个细胞/孔的细胞密度培养过夜。然后，除去培养基，向每个孔中加入 100 μL 水泥提取物，随后孵育 24 和 48 小时。在这些预定的时间点，除去培养基并进行 MTT 测定。将细胞置于完全培养基中，加入 0.5 mg/mL MTT，培养 4 小时。然后，除去培养基，加入 100 μL/孔 DMSO。以 DMSO 作为空白对照，在 570 nm 处读取吸光度。实验重复进行三次。

使用 ATP 生物发光测定法测定水泥表面的细胞增殖。水泥圆柱体的制备如上所述。接种细胞（5000 个细胞/孔），并根据制造商的说明（ATPlite，PerkinElmer）使用 ATP 测定法测量其增殖。在 96 孔板（SpectraMax i3x，Molecular DEVICES）中获取发光读数。每种类型测试六次重复。

将细胞在水泥盘上培养 24 小时后，用荧光显微镜对细胞进行形态学研究。用 PBS 中的 4% 多聚甲醛固定细胞 15 分钟，用 PBS 洗涤，在 0.1% Triton X-100/PBS 中通透 10 分钟，用 PBS 洗涤两次，用 PBS 中的 2% 牛血清白蛋白 (BSA) 封闭 1 小时，用 PBS 洗涤两次，用 PBS 中的 Phalloidin Dylight 550（2 单位/mL，甲醇中 300 单位/mL 的储备溶液）染色 1 小时（300 μL，室温），用 PBS 洗涤两次，用 PBS 中的 2 μg/mL DAPI 染色 10 分钟，最后再次用 PBS 冲洗。使用配备 Hamamatsu HR 相机和彩色 AxioCam MRc 相机的落射荧光显微镜（Zeiss Axio Imager Z1）拍摄照片。图像由 Volocity 6.3 软件处理。

2.10 统计分析

使用 GraphPad Prism 7.03 软件进行统计分析。所用不同统计测试的详细信息已在图注中报告。

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三、结果

3.1 CSMCC 的物理化学表征

CSMCC 是通过在强酸性环境（甲磺酸；p Ka = −1.9）下进行亲核取代反应，用甲基丙烯酰基部分修饰壳聚糖中的伯羟基而合成的（图1 A）。未反应的甲基丙烯酰氯在洗涤步骤中以甲基丙烯酸铵盐的形式被去除。(21)FT-IR（图1 B）证实了 CSMCC 的形成：1710 cm –1处的新峰归因于新形成的酯基中的 C═O 键。1 H NMR（图 1 C）也证实了 CSMCC 的化学结构，其中乙烯基质子信号出现在 δ 5.71 和 6.02 ppm 处，对应于甲基丙烯酰基的甲基质子出现在 δ 1.01 ppm 处。1 H NMR谱还显示，δ 1.48 ppm 处有来自三个甲基 H 原子（ N-乙酰葡萄糖胺）的信号，δ 2.24 ppm 处有来自 H2（葡萄糖胺）的信号，多个重叠信号（从 δ 1.7 到 2.0 ppm）分配给与葡萄糖吡喃环中非异头 C3-C6 碳相连的 H3-H6，δ 2.3 ppm 处有来自异头质子的信号。CSMCC 的取代度确定为 25.7%。

图 1. CSMCC 的合成和 FT-IR 和1 H NMR 表征。(A) 甲基丙烯酰壳聚糖 (CSMCC) 合成示意图。(B) CS (黑色)、MCC (深灰色) 和 CSMCC (浅灰色) 的 FT-IR 光谱。(C) CSMCC 的1 H NMR 光谱。

在复合骨水泥的配方中，组成粉末的颗粒大小和形状对于保证在液体单体中均匀混合和分散非常重要。CS 和 CSMCC 颗粒呈现不规则形状（图 S1），且颗粒大小明显高于 PMMA 粉末（p < 0.05，表2），而 PMMA 粉末的颗粒大小在商用骨水泥的典型范围内。

表 2. 通过激光衍射测定的平均粒度，以 CS、CSMCC 和 PMMA 粉末的索特平均直径 (SMD) 和体积中值直径 (VMD)表示

3.2 CS 和 CSMCC 粉末的抗菌性能

通过测量细菌悬浮液在 LB 中孵育 12 小时后的吸光度，测试了 CS 和 CSMCC 粉末对金黄色葡萄球菌的抑菌潜力（图2）。研究化合物是在悬浮液而不是溶液中进行的，因为壳聚糖和改性壳聚糖以固体形式掺入 PMMA 水泥中，在生理 pH 下不太可能溶解。虽然在所有研究浓度下都检测到了细菌生长，但结果表明，需要浓度≥2 mg/mL 才能显著影响细菌生长。在这方面，壳聚糖和改性壳聚糖之间没有差异。

图 2. CS 和 CSMCC 的抗菌特性。不同浓度的金黄色葡萄球菌悬浮液在培养基对照（黑条）、CS（浅灰色条）和 CSMCC（深灰色条）存在下的光密度（OD 600 nm ）。数据以平均值 ± SD（ n = 3）报告。单因素方差分析结果为p < 0.05；Dunnett 多重比较检验的结果报告在图表中（* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001；**** p < 0.0001）。在不同浓度的 CS 和 CSMCC 之间进行的t检验显示无统计学差异（p > 0.05）。

3.3 水泥的峰值温度和凝固时间实验

市售的丙烯酸骨水泥通常通过以 2:1 的 P/L 比率混合粉末 (P) 和液体成分 (L) 来激活。粉末通常由 PMMA 珠粒组成，含有自由基引发剂（例如过氧化苯甲酰）和（必要时）射线不透剂（例如硫酸钡）。液体含有单体甲基丙烯酸甲酯 (MMA)、稳定剂（例如对苯二酚）和促进剂（例如N，N-二甲基对甲苯胺），以促进聚合反应在室温下发生（冷固化水泥）。

当两种成分混合在一起时，液态单体在预聚合的 PMMA 颗粒周围发生聚合（图3），并产生热量。在本研究中，我们记录了复合骨水泥的聚合温度，发现与 PMMA 2:1 对照（66.7 ± 8.7 °C）相比，所有复合材料的峰值聚合温度均有所下降（图4 A、B）。

图 3. PMMA 水泥的形态。（A）整个 PMMA_2:1 水泥的代表性 XCT 重建体积和（B）同一样本的横截面。（C）PMMA_2:1 水泥表面的 SEM 图像；箭头显示固化水泥内的 PMMA 珠（有关更多图像，请参阅图 S2 ）。

图 4. 水泥的凝固特性。含有 CS (A) 或 CSMCC (B) 的 PMMA 水泥的峰值聚合温度，以及含有 CS (C) 或 CSMCC (D) 的 PMMA 基水泥的凝固时间，P/L 比率不同。数据以平均值 ± SD ( n = 6) 的形式报告。单因素方差分析结果为p < 0.05；用于将所有样品与 PMMA 对照进行比较的 Dunnett 多重比较检验结果以及用于比较具有不同 P/L 比率的样品的t检验结果在图表中报告（* p < 0.05、** p < 0.01、*** p < 0.001、**** p < 0.0001）。

较高浓度的 CS 和 CSMCC（尤其是≥20%）会导致聚合温度显著降低（CS20%_0.8，p < 0.01；CSMCC20%_1 p < 0.05）。另一方面，当 P/L 比率降低至 2:0.8 时，放热反应温度没有统计学差异（p > 0.05）。富含 CS 的水泥的最低聚合温度为 PMMA CS30%_0.8（45.4 ± 3.4 °C）和 PMMA CS30%_AgNWs_0.8（44.2 ± 1.4 °C），而 CSMCC 的最低聚合温度为 PMMA CSMCC30%_0.8（44.9 ± 7.6 °C）和 PMMA CSMCC30%_AgNWs_1（45.0 ± 2.5 °C）。根据 ISO 5833:2002，丙烯酸树脂水泥的理想凝固时间应根据用途在 3 至 15 分钟之间。随着 CS 和 CSMCC 浓度的增加（图4 C、D），凝固时间从 PMMA_1 的 667.2 ± 28.1 秒（约 11 分钟）增加到 PMMA CS30%_1 的 843.8 ± 2.9 秒（约 14 分钟），但仍在最大建议时间内。P/L 比越高，凝固时间越短。

3.4 体外降解研究

通过 XCT 评估了复合水泥的孔隙率和孔径分布。在聚合过程中，由于水泥浆粘度的原因，滞留空气无法逸出，从而形成了空隙。含有可生物降解材料（如壳聚糖）的水泥预计会随着时间的推移而增加孔隙率，这也通过 XCT 进行了评估。对 PMMA 对照和含有 20% CS 或 CSMCC 的复合水泥样品进行了扫描。在降解之前分析的 PMMA-CS 样品的孔隙率明显高于仅 PMMA（p < 0.05），而 PMMA_2:1_CSMCC20% 没有统计学差异。此外，含有 CS 和 CSMCC 的水泥在 PBS 中的 4 周孵育期内发生降解（p < 0.05），而仅含 PMMA 的水泥未显示明显降解（图5 A）。

图 5. 水泥的孔体积和孔径。PMMA（黑色）、4 周后的 PMMA（灰色）、CS_20%（红色）、4 周后的 CS_20%（橙色）、CSMCC_20%（深绿色）和 4 周后的 CSMCC_20%（浅绿色）的百分比孔体积 (A)。数据以平均值 ± SD ( n = 3) 的形式报告。在浸泡前后对同一种水泥类型进行t检验（ $ p < 0.05）。在比较 CS_20% 与 PBS 中降解前的 PMMA 的百分比孔体积时，单因素方差分析返回p < 0.05 (*)；Dunnett 多重比较检验的结果报告在图中。在比较 CS_20% 与 PBS 中降解后的 PMMA 的百分比孔体积时，单因素方差分析返回p < 0.01；图表报告了 Dunnett 多重比较检验的结果 ( && p < 0.01)。（B）PMMA（黑色）、4 周后的 PMMA（灰色）、CS_20%（红色）、4 周后的 CS_20%（橙色）、CSMCC_20%（深绿色）和 4 周后的 CSMCC_20%（浅绿色）的孔径分布。

仅 PMMA_2:1_CS20% ( p < 0.05)在降解 4 周后孔径有所增加，平均孔径从 11.6 ± 13.4 增加到 13.1 ± 10.9 μm。与含有 CS 或 CSMCC 的水泥相比，降解前后的 PMMA 水泥具有更窄的孔径分布（图5 B）。

为了进一步评估复合水泥，我们采用重量法评估了体外降解情况。该方法被认为是体外磨损评估的黄金标准。该数据提供了有关整体质量损失的信息，但并未提供有关材料内部磨损分布的任何信息。如表1所示，仅含 PMMA 的水泥显示出较差的重量损失（PMMA_2:1 和 PMMA_2:0.8 分别为 0.09 ± 0.09 和 0.12 ± 0.12%），而基于 CS 和 CSMCC 的水泥表现出更高的重量损失，并且正如预期的那样，随着多糖浓度的增加而增加。例如，对于 10%、20% 和 30% 壳聚糖含量的 PMMA_CS_2:1 样品，计算出的重量损失分别从 0.16 ± 0.25 增加到 0.68 ± 0.57，最后增加到 3.66 ± 1.03%。两种 MMA 浓度之间没有统计学差异。吸水率随着 CS 或 CSMCC 的增加而增加，最高达近 13%（表1）。文献中也报道了壳聚糖基聚酯和聚甲基丙烯酸甲酯水泥的类似趋势。(25)这种趋势可以用两种不同的方式解释：壳聚糖的存在具有吸湿性，促进了支架的吸水，而这在疏水性的纯 PMMA 水泥中是不可能的。或者，由于壳聚糖降解，材料孔隙率和/或连通性更高，可以促进支架内的水分保留（如 XCT 所建议的）。CS 和 CSMCC 基水泥之间没有统计学差异（p < 0.05）。

3.5 机械性能

在本研究中，我们加入了增加的 CS 或 CSMCC 质量比，以研究 PMMA 水泥的机械性能如何受到影响。外科 PMMA 水泥本质上是脆性的。因此，它在拉伸下很弱，但在压缩下相当强，并且能够在单轴压缩下屈服。复合水泥的抗压强度和弹性模量通常会降低，混合物中 CS 或 CSMCC 的质量比会增加（图6）。对于在较低浓度（1%、3% 和 5% w/w）下加载壳聚糖的 PMMA 骨水泥（Palacos R），这种趋势与 Dunne 等人的趋势非常一致，研究人员将20％的壳聚糖加入PMMA骨水泥(CMW耐力骨水泥)中。当配方中加入银纳米线时，没有报告统计差异。Slane 等人也报告了这种趋势，他们将 1.0% 重量的银纳米粒子加入丙烯酸骨水泥中。当粉末和液体的比例为 2:1 时，加入 30% CS 后，抗压模量和弹性模量显著降低。这可以归因于水泥内部化学连接较少，也可能存在松散的粉末。另一方面，当粉末和液体的比例为 2:0.8 时，即使 CSMCC 浓度较低（20%），抗压强度也存在显著差异。

图 6. 含 CS（A、C）和 CSMCC（B、D）的复合水泥的抗压强度（MPa）和杨氏模量（MPa）。结果以平均值 ± SD（n = 6）报告。对于抗压强度，单向方差分析返回p < 0.05；Dunnett 多重比较检验的结果（用于将所有样品与 PMMA_2:1 进行比较）报告在图表中（* p < 0.05、** p < 0.01、*** p < 0.001、**** p < 0.0001）。进行非配对t检验以比较每种重量体积比为 2:1 的配方与相应重量体积比为 2:0.8 的配方（$ p < 0.05、$$ p < 0.01）。对于杨氏模量，单向方差分析返回p < 0.05；图表报告了 Dunnett 多重比较检验的结果，该检验用于将所有样品与 PMMA 对照进行比较 (* p < 0.05)。进行非配对t检验以比较每个重量体积比为 2:1 的配方与重量体积比为 2:0.8 的相应配方 ( $ p < 0.05)。

进行 4 周的体外降解研究后还对其机械性能进行了评估；然而，通过非配对t检验未发现显著差异（p > 0.05）（图 S3 和 S4）。

3.6 复合水泥中的银释放

在去离子水中进行了为期 21 天的银离子释放研究，累积释放曲线如图7所示。负载 AgNW 的骨水泥不断向周围的水中释放 Ag +离子，银的量在第一天内显著增加，然后达到稳定水平。所研究的不同水泥之间没有统计学差异（p > 0.05），尽管含有 CS/CSMCC 的水泥在任何时间点都表现出更高的 Ag +释放量。

图7. 骨水泥中银离子的累积释放量：PMMA_AgNWs_1（黑色）、PMMA_AgNWs_0.8（红色）、PMMA_CS20%_AgNWs_1（蓝色）、PMMA_CS20%_AgNWs_0.8（绿色）、PMMA_CSMCC20%_AgNWs_1（黄色）、PMMA_CSMCC20%_AgNWs_0.8（紫色）。数据以平均值 ± SD（n = 3）的形式报告。21 天的单因素方差分析结果显示p > 0.05。

3.7 水泥的抗菌性能

在金黄色葡萄球菌悬浮液中孵育 24 小时后，使用 MTT 法测定复合骨水泥的抗菌性能。仅含 PMMA 的水泥的细菌附着率低于含有浓度高于或等于 20% 的 CS 或 CSMCC 粉末的水泥（图8）。另一方面，当将 AgNW 添加到配方中时，它们会显著减少所有研究配方中附着在水泥上的活菌（p < 0.05），10% 的 CS 和 CSMCC 除外。

图 8. 以活细胞计数表示的生物膜形成抑制。24 小时后通过 MTT 测定获得的相对于水泥 (P/L 2:1) 表面上细菌细胞数量的吸光度。 (A) 含有 CS 的 PMMA 基水泥。 (B) 含有 CSMCC 的 PMMA 基水泥。数据以平均值 ± SD ( n = 4) 报告。单因素方差分析返回p < 0.05；事后 Tukey 多重比较检验的结果报告在图中 (* p < 0.05)。进行非配对t检验以比较含有和不含有 AgNW 的每种配方。 * 代表p < 0.05，** 代表p < 0.01，*** 代表p < 0.001，**** 代表p < 0.0001。

3.8 复合水泥的细胞相容性评价

对水泥洗脱液（图9 A、B）和复合 PMMA 水泥（图9 C、D）的细胞相容性进行了评估。使用洗脱液模拟了术后有毒可浸出物释放到周围骨环境中的情况。此外，通过连续稀释，可以评估剂量依赖性效应。在将细胞与洗脱液孵育 24 和 48 小时后评估细胞相容性，除 PMMA_AgNWs_1（p < 0.01）外，没有发现统计学差异（ p > 0.05） 。所有 P/L 为 2:1 的水泥在 24 小时时的细胞活力均为 > 80%；除含有 20% CS 或 CSMCC 和 AgNWs 的水泥导致细胞活力显著下降外：PMMA_CS20%_AgNWs_1（51.6 ± 31.5%）、PMMA_CSMCC20%_AgNWs_1（55.6 ± 36.6%）、PMMA_CS20%_AgNWs_0.8（52.4 ± 9.3%）和 PMMA_CSMCC20%_AgNWs_0.8（45.2 ± 30.9%）。稀释提取物（50%）始终保持细胞活力 > 80%，表明存在剂量依赖性效应（图 S5）。当比较不同时间点的两种不同浓度的 MMA 时，没有发现统计学差异（p > 0.05）。总体而言，这些结果表明，随着配方中添加 CS/CSMCC（从而减少骨水泥粉），更少的液体水泥能够与引发剂发生反应，并且随着时间的推移，更多的有毒可浸出物从水泥中释放出来。

图 9. 水泥对间充质干细胞的细胞毒性。通过水泥洗脱液（A、B）和细胞与水泥直接接触（C、D）测试细胞毒性。P/L 比为 2:1（A）和 2:0.8（B）的水泥提取物在 24 小时（左栏）和 48 小时（右栏）时的毒性。数据以平均值 ± SD（n ≥ 3）报告。单因素方差分析结果p < 0.05；事后 Tukey 多重比较检验的结果报告在图中（* p < 0.05）。进行非配对 t 检验以比较每种配方是否含有 AgNW。在 CS 水泥（C）和 CSMCC 水泥（D）上孵育 1 天和 3 天后对 MSCs 进行 ATP 测定。进行单因素方差分析，比较第 1 天和第 3 天时每种水泥与 PMMA 2:1 的 ATP 水平，结果显示存在统计学差异（p < 0.05）。Dunnett 多重比较的结果在图表中报告；特别是，$ p < 0.05、$$ p < 0.01、$$$ p < 0.001 和p < 0.0001，在第 1 天。£ p < 0.05、££ p < 0.01、£££ p < 0.001 和££££ p < 0.0001，在第 3 天。进行t检验以比较第 1 天和第 3 天的每种水泥（* p < 0.05、**** p < 0.0005）。

还评估了细胞在水泥表面接种 1 天和 3 天时的细胞增殖情况。研究发现，接种在仅含有 PMMA 的样品上的细胞在第 1 天到第 3 天之间，无论是含有 ( p < 0.05) 还是不含 AgNWs ( p < 0.0001)，细胞增殖都显著增加。而对于含有少量 CS/CSMCC 的样品，只有以下样品显示出增殖增加：PMMA_CS10% ( p < 0.0001)、PMMA_CS10%_AgNWs ( p < 0.05)、PMMA_CSMCC10% ( p < 0.05) 和 PMMA_CS20% ( p < 0.05)。对于较高浓度的多糖，增殖并没有统计学上增加 ( p > 0.05)。这些结果与 Tan 等人报道的结果相似，他们在 PMMA 基水泥中加入了 20% w/w 的壳聚糖粉 (PMMA-C)。与 PMMA 相比，PMMA-C 水泥的增殖率较低。这些结果也与对提取物进行的细胞毒性研究一致；随着时间的推移，骨水泥液体和骨水泥粉末之间的比例增加会降低细胞活力。

另一方面，与对照组相比，AgNW 的加入不会干扰细胞增殖。

四、讨论

精心设计复合生物材料对于克服目前使用的产品（如 PMMA）的局限性至关重要。在本研究中，结合了多种策略来解决影响 PMMA 水泥性能的主要限制。这些策略包括 1. 添加可生物降解的壳聚糖以增加材料的孔隙率和可降解性，从而有利于 PMMA/骨整合并调整材料的机械性能；2. 使用甲基丙烯酸酯化壳聚糖来降低聚合温度并避免组织坏死的风险；3. 添加 AgNW 以赋予抗菌性能。

成功获得了取代度为 25% 的甲基丙烯酰壳聚糖 (CSMCC)，并将其用于复合水泥的配制。在添加到复合水泥之前，对壳聚糖和改性壳聚糖都进行了测试，以评估其在固体状态下的抗菌性能。所研究的所有壳聚糖粉末的抗菌活性均低于文献报道的抗菌活性。这是意料之中的，因为粉末在 pH 值为中性时处于悬浮状态，而已发表的研究是在 pH 值低于壳聚糖的 pK a的情况下进行的。在酸性环境中，壳聚糖被质子化，因此能够与带负电荷的细菌表面相互作用。这些结果证实，除了壳聚糖之外，还需要在复合 PMMA 水泥中添加其他具有抗菌特性的成分，以有效抵御可能的细菌感染。在确定 CS 和 CSMCC 本身无法提供抗菌活性后，我们评估了它们对聚合温度和时间的影响。根据 ISO 5833:2002，丙烯酸树脂水泥的最高聚合温度应≤90°C；低于 56°C 的温度可确保减少水泥和天然组织界面处的组织坏死。我们的研究表明，添加 CS 和 CSMCC 通过整个骨水泥材料的散热降低了峰值聚合温度，就像之前对其他添加剂（如 MgO、羟基磷灰石、CS、BaSO 4和 SiO 2 ）所显示的那样。添加多糖也会增加凝固时间，但在可接受的范围内。该实验表明，将壳聚糖改性为 CSMCC 并没有带来任何显著降低聚合温度的优势；简单添加壳聚糖就足以实现这一目标。同样，使用 CSMCC 不会影响复合水泥的吸水率和降解。然而，使用多糖使我们能够获得具有可调降解性能的水泥。同样，预计壳聚糖将有助于调节复合水泥的机械性能。这将有助于克服与标准 PMMA 水泥相关的一个主要问题，即水泥和骨骼的机械性能不匹配，尤其是在骨质疏松骨的情况下，使用 PMMA 进行椎体增强的情况下，相邻椎体骨折的风险会增加。先前已经表明，通过引入孔隙率或使用添加剂可以降低 PMMA 基骨水泥的机械性能。当添加剂浓度达到 20% w/w 时，添加 CS 和 CSMCC 会导致抗压强度和杨氏模量降低。这可能是由于凝固混合物中的多糖存在导致的孔隙率增加和单体聚合不完全，并且与观察到的聚合温度降低有关。该研究的目的之一也是制造能够抑制体内生物膜形成的水泥。正如 Dunne 等人所强调的那样，装入 PMMA 水泥中的壳聚糖粉末缺乏抗菌活性是意料之中的；这种行为可能是由于 CS 或 CSMCC 粉末的物理形态，它们充当了细菌附着的物理支撑，如先前对壳聚糖微球、粉末和薄片的报道一样。因此，我们添加了 AgNW 作为抗菌剂。我们之前已证明 AgNW 本身能够持续释放银离子；当前数据支持这一点；事实上，所有复合水泥释放的 Ag +都具有相似的特征，总累积释放量远低于人体细胞潜在毒性限值 10 ppm。我们的研究结果表明，AgNW 可以减少骨水泥上的生物膜形成；这些结果与研究人员的报告结果一致，他们发现在载有 0.05% 银纳米球（5.3 ± 2.3 纳米）的 PMMA 水泥上细菌附着量显著减少。与我们之前对复合水凝胶的研究类似，PMMA 水泥中的壳聚糖和 AgNW 的组合表明，由于协同作用，壳聚糖的存在增强了 AgNW 的活性。当壳聚糖浓度低于 20% w/w 时，相同的组合可提供良好的细胞活力。

五、结论

CS 和 CSMCC 以 10% 至 30% w/w 的浓度添加到 PMMA 水泥中。发现聚合温度的降低与剂量有关，浓度 > 10% 时聚合温度显著降低。与对照组相比，含有壳聚糖或改性壳聚糖的水泥吸水率和重量损失增加，并且随着浓度的增加，这种影响更加明显。随着混合物中 CS 或 CSMCC 的质量比增加，抗压强度和弹性模量通常降低；细胞毒性也呈现出相同趋势。在含有 CS 或 CSMCC 的材料之间没有观察到统计学差异。体外研究的结果表明，在 PMMA-壳聚糖水泥中加入 1% w/w 浓度的 AgNW 可以成为一种可行的方法，可以防止支架上的金黄色葡萄球菌感染，同时不会影响其机械性能和细胞相容性。这些配方提供了 Ag +离子的持续释放，表明在较长时间内具有潜在的抗菌活性。总体而言，这项研究表明，在现有的商业材料中加入 CS/CSMCC（10% 至 20%）和 AgNW（1%）可以为骨水泥提供良好的细胞相容性和适当的热、机械和抗菌性能。

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