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对于念珠菌性阴道炎，分子疗法是有限的，因为它们破坏阴道的正常细胞和组织，加剧阴道微生物群的不平衡，增加复发。

为了解决这一限制，来自南京大学的魏辉课题组通过将类似过氧化物酶（POD）的rGO@FeS2纳米酶[还原的氧化石墨烯(rGO)]与乳酸菌产生的乳酸和H2O2结合，开发了一种响应性透明质酸(HA)水凝胶rGO@FeS2/乳酸菌@HA (FeLab)。FeLab同时具有抗白色念珠菌和阴道微生物群调节活性。特别地，由rGO@FeS2纳米酶和乳酸菌产生的羟基自由基杀死从临床样本中分离的白色念珠菌，而不影响乳酸菌。在念珠菌性阴道炎小鼠中，FeLab具有明显的抗白色念珠菌活性，但几乎不损伤阴道粘膜细胞，有利于阴道粘膜修复。此外，厚壁菌门(尤其是乳酸杆菌)的比例更高，变形菌门的减少，重塑了健康的阴道微生物群，以减少复发。这些结果提供了纳米酶和益生菌的组合疗法，具有治疗念珠菌性阴道炎的转化前景。相关论文“A probiotic nanozyme hydrogel regulates vaginal microenvironment for Candida vaginitis therapy”于2023年5月17日发表于杂志《Science Advances》上。

本文中，利用POD样纳米酶和益生菌乳酸杆菌的互补优势，开发的FeLab可有效治疗念珠菌阴道炎并减少复发率。当应用于阴道时，白色念珠菌和细菌分泌的透明质酸酶(HAase)可以降解透明质酸，从而在局部释放乳酸杆菌和rGO@FeS2纳米酶。一方面，乳酸菌通过发酵产生乳酸使阴道微环境正常化，使阴道pH值降至4 ~ 4.5。另一方面，rGO@FeS2纳米酶可以催化乳酸菌产生的H2O2产生大量的•OH，杀死白色念珠菌(图1)。

图1 念珠菌阴道炎微环境示意图和Felab微环境调控对念珠菌阴道炎治疗的影响

1. rGO@FeS2纳米酶的表征

透射电子显微镜成像表明，rGO具有二维层片状结构(图2A)，白铁矿FeS2纳米颗粒均匀分布在rGO表面(图2B)。相反，单独的白铁矿FeS2纳米颗粒明显聚集(图2C)。如图2D所示，X射线衍射图中的特征峰被标示为rGO和白铁矿FeS2的立方相。然后用X射线能谱(XPS)分析了薄膜的表面化学成分和电子状态。X射线光电子能谱(图2E)显示了C 1s、N 1s、O 1s、Fe 2p和S 2p的典型峰。此外，在710-715 eV和724-728 eV处有几个峰，由于前驱体FeCl3和空气中白铁矿FeS2的轻微氧化，这些峰可能属于Fe3+氧化物状态(图2F)。此外，在168.3 eV处的另一个与SOx2− 相关的峰与白铁矿FeS2不可避免的氧化有关(图2G)。

图2 rGO@FeS2纳米酶的表征

2. rGO@FeS2纳米酶的类POD和抗白色念珠菌活性

利用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)在H2O2存在下的氧化来检测rGO@FeS2纳米酶的类POD活性。如图3A所示，只有含有rGO@FeS2纳米酶、H2O2和TMB的系统变成蓝色[氧化TMB (oxTMB)的颜色]。图3B显示，rGO@FeS2纳米酶在酸性条件下表现出更强的类POD活性，并且在pH 4至4.5时具有最佳活性。接下来，使用EPR光谱研究rGO@FeS2纳米酶的•OH生成活性，如图3C所示，rGO@FeS2纳米酶能有效催化低浓度H2O2 (80 μM)产生强•OH。然后，研究了抗白色念珠菌活性，与其他组相比，真菌菌落明显减少，表明两者治疗组的白色念珠菌存活率最低rGO@FeS2纳米酶和H2O2（图3D和E）。

图3 rGO@FeS2纳米酶的类POD和抗白色念珠菌活性

3. rGO@FeS2纳米酶内的乳酸菌增强了抗白念珠菌的活性，包括临床分离的5个样品

由于乳酸菌与白色念珠菌共发酵可产生约30 μM的H2O2(图4A)，还研究了rGO@FeS2在H2O2(30 μM)存在时抗白念珠菌的活性。激光扫描共聚焦显微镜观察清楚地证实，与其他处理相比，rGO@FeS2纳米酶和乳杆菌处理显示出最强的产生白念珠菌胞内ROS的能力(图4B)。此外，用绿色荧光质膜和囊泡染料(FilmTracer FM 1-43)和红色荧光碘化丙啶(PI)核酸染料进一步证实了白色念珠菌的破坏作用。如图4C所示，共聚焦荧光图像显示，rGO@FeS2纳米酶和乳酸菌处理组对白念珠菌细胞膜的损伤最为严重。此外，与其他处理相比，通过扫描电镜(SEM)成像对白念珠菌和乳酸菌表面的表征表明，rGO@FeS2纳米酶和乳酸菌处理后，白念珠菌的结构完整性受到的影响最为严重(图4D)。rGO@FeS2纳米酶和乳酸菌处理诱导的氧化状态和结构完整性仅在白念珠菌上观察到，而在乳酸菌上没有观察到(图4,B至D)。rGO@FeS2纳米酶与乳酸菌之间的自级联反应示意图如图4E所示。与乳酸菌处理相比，rGO@FeS2纳米酶和乳酸菌处理的临床分离的白念珠菌的细胞活力和菌落显著降低(图4,F至J)。

图4 rGO@FeS2纳米酶内的乳酸菌增强了抗白念珠菌的活性，包括临床分离的5个样品

4. FeLab对白念珠菌性阴道炎的体内抗真菌作用

为了进一步评估其作为局部抗真菌药物的潜力，在体内评估了FeLab对白色念珠菌诱导的阴道炎的抗真菌作用。对小鼠实施安乐死，获得用于组织化学的阴道组织(图5A)。如图5 B和C所示，与FeLab处理相比，阴道冲洗中FeLab和克霉唑处理的白念珠菌的细胞活力和菌落形成均显著降低。但通过阴道组织学染色，FeLab治疗组阴道角化、粘膜及粘膜下炎症细胞浸润明显低于氯曲霉唑治疗组(图5D)。乳酸杆菌释放后，可以通过将pH降低到4.5左右，产生H2O2来调节阴道微环境，有利于rGO@FeS2纳米酶催化产生大量•OH，就地杀死白念珠菌，从而最大限度地减少对阴道粘膜细胞的损伤(图5E)。而克霉唑虽然具有通过影响细胞膜的通透性抗白念珠菌的活性，它由于选择性差对阴道粘膜细胞造成严重的损伤。另一方面，克霉唑不能调节阴道pH值(大于5.0)，这是白色念珠菌生长的最佳条件，可能导致念珠菌阴道炎复发的风险高于FeLab(图5F)。

图5 FeLab对白念珠菌性阴道炎的体内抗真菌作用

5. FeLab与克霉唑对白色念珠菌性阴道炎小鼠阴道微生物群的改善作用

对阴道洗涤样品的分析显示，与克霉唑相比，FeLab治疗显著改善了念珠菌阴道炎小鼠的真菌和细菌多样性，这可以从独特的操作分类单位数量的增加中看出(图6A，B)。门水平的进一步分析显示，FeLab处理显著降低了变形菌门的相对丰度，增加了厚壁菌门的相对丰度，重塑了更健康的阴道微生物群(图6 C至E)。在属水平上，乳酸杆菌的相对丰度显著增加(图6F),而变形杆菌在用FeLab处理后显著减少(图6G )，乳酸杆菌可以促进阴道稳态的维持并防止有害微生物的定居和生长。

图6 FeLab与克霉唑对白色念珠菌性阴道炎小鼠阴道微生物群的改善作用

总之，开发了具有类POD和阴道微环境调节活性的响应性水凝胶FeLab，以杀死白色念珠菌并调节阴道微生物群平衡，用于治疗念珠菌性阴道炎并减少复发。所设计的rGO@FeS2结构保证了白铁矿FeS2纳米颗粒在rGO载体上的均匀分散，并且包封的乳酸菌能够产生H2O2并降低pH，有利于在白念珠菌诱导的阴道炎模型中增强POD-样活性以杀灭白念珠菌。自身级联催化几乎不影响乳酸菌，从而有效改善阴道微生物群，重塑更健康的阴道微环境。这项工作不仅证明了纳米酶-益生菌组合在治疗念珠菌性阴道炎和减少复发方面优于小分子抗真菌药物，还显示了纳米酶的转化前景。

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