肥胖是由过量的热量摄入导致的，这与暴饮暴食有关，并且给公共卫生带来了重大挑战。下丘脑因其在控制进食行为和体重平衡方面的作用而备受关注。然而，下丘脑以外的大脑回路也通过改变感觉知觉、动机和奖赏来调节食欲和摄食量。我们最近发现了一群基底前脑胆碱能（BFc）神经元，它们能够抑制食欲。通过在小鼠模型中使用病毒追踪方法，我们发现 BFc 神经元密集地支配着基底外侧杏仁核（BLA），这是一个与动机行为有关的边缘结构。利用通道视紫红质辅助的回路图谱技术，我们发现 BFc 回路操作后 BLA 神经元中出现了胆碱能反应。此外，在 BLA 内使用乙酰胆碱传感器（GACh3）和遗传编码钙指示剂（GCaMP）进行体内成像，揭示了进食期间活动的特异性反应模式。最后，通过体内光遗传学操作，我们发现从 BFc 到 BLA 的胆碱能信号增强会抑制食欲和食物摄入。这些数据共同支持这样一种模型，即来自背侧腹侧纹状体（BFc）到基底外侧杏仁核（BLA）的胆碱能信号传导直接对食欲和进食行为产生影响。

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重要性声明：进食行为通常与下丘脑中的稳态脑回路相关联。在此，我们确定了一个非稳态的脑回路节点，它通过基底前脑的胆碱能信号传导来抑制进食。这一回路或许有助于解释情绪、动机、奖赏和厌恶如何影响进食行为。

一、介绍

体重的稳定需要能量消耗与热量摄入之间的平衡。能量失衡与多种疾病有关，包括肥胖相关的并发症，这些并发症会增加死亡率，如心脏病、中风和癌症。人们普遍认为进食行为受中枢神经系统控制。迄今为止，大量研究已经表明研究重点在于下丘脑，这是大脑中主要的摄食中枢。然而，众多下丘脑以外的神经环路塑造并评估食物的感官知觉、质量、价值和可得性，共同直接作用于食欲。值得注意的是，基底前脑内的布罗卡斜带就是这样一个节点，它在感觉处理、注意力、动机等方面发挥作用，最近还发现其在食欲调节方面也具有作用。破坏胆碱能DBB神经元会导致暴食和肥胖，而激活胆碱能神经元下游的兴奋性DBB神经元则会导致食欲减退和饥饿。然而，DBB投射到众多下游节点，目前尚不清楚其中哪些节点可能驱动DBB激活所引起的食欲抑制。

乙酰胆碱与食欲抑制有关，乙酰胆碱受体激动剂尼古丁是食欲的强效调节剂。此外，毒蕈碱受体基因敲除小鼠体重出现显著变化。尽管有现象学证据表明乙酰胆碱可调节食欲抑制，但乙酰胆碱抑制食欲的详细神经环路机制仍不清楚。胆碱能背侧脑桥及其多样的投射系统能够直接合成感知和内稳态信号，从而调节和/或直接控制进食行为。鉴于DBB传统上被认为控制注意力、动机和奖赏，并且DBB内胆碱能神经元的遗传消融会导致肥胖，我们试图确定DBB下游介导食欲抑制的目标。

通过针对DBB胆碱能神经元的遗传靶向顺行追踪，我们发现DBB与基底外侧杏仁核有大量神经纤维投射。尽管杏仁核传统上因在恐惧和焦虑中的作用而备受关注，但最近的研究表明，杏仁核也与食欲调节有关。此外，BLA能够为感觉刺激赋予价值，从而改变动机行为。因此，我们推测通过BLA形成的负面和正面关联可能促进或抑制摄食行为。从分子层面来看，啮齿动物BLA中的进食行为与乙酰胆碱释放之间存在直接关联。这些证据表明BLA可能是胆碱能DBB的下游靶点，从而调节进食行为。为了探究这种因果效应，我们进行了顺行病毒示踪和靶向电生理记录，发现基底外侧杏仁核是背侧被盖区胆碱能信号传导的一个重要下游靶点。为了测试背侧被盖区→基底外侧杏仁核胆碱能信号传导如何影响食欲控制和感觉处理，我们在进食期间监测了杏仁核的活动和胆碱能释放动态，结果表明胆碱能释放增强且基底外侧杏仁核被激活。最后，通过光遗传学和药理学方法，我们发现背侧被盖区在杏仁核释放的乙酰胆碱是胆碱能背侧被盖区介导的食欲抑制的强驱动因素。综上所述，我们表明基底外侧杏仁核是胆碱能背侧被盖区介导的食欲抑制的下游效应器。

二、材料与方法

01.实验小鼠品系

本文所报告的所有研究中，分析均包含雄性和雌性小鼠。所有实验均使用标准颗粒状小鼠饲料，所有动物均在正常的12小时光照/黑暗周期下饲养。Chat-Cre和vGlut2-Cre小鼠最初是从杰克逊实验室购入的，其详细信息分别在Rossi等人和Vong等人的研究中有过描述。Cre的PCR基因分型使用以下引物进行。

02.立体定位注射和病毒构建体

对于所有立体定位注射，小鼠在诱导箱中使用3%异氟烷进行麻醉，并通过含氧的异氟烷蒸气维持麻醉状态。所有注射均使用与Angle Two软件同步的立体定位仪进行坐标引导。用于顺行追踪从DBB中，对12周龄的Chat-Cre小鼠进行双侧注射，注射部位为DBB，每侧注射500纳升条件重组腺相关病毒EF1α-DIO-Syn::mRuby2-WPRE-hGHpA，血清型DJ/8。通过在DBB中对胆碱乙酰转移酶进行染色，以事后确定注射部位。对于从杏仁核基底外侧核进行突触素追踪，对8至12周龄的vGlut2-Cre小鼠进行双侧注射，注射部位为BLA，每侧注射500纳升条件rAAV-EF1α-DIO-Syn::EGFP-WPRE-hGHpA，血清型DJ/8。

03.光纤光度法进食实验及分析

将vGlut2-Cre小鼠的DBB区域注射rAAV-hSyn-DIO-GCaMP8或rAAV-hSyn-DIO-GACh3.0，并在小鼠双侧植入硅质光纤，光纤位于更靠前的杏仁核基底外侧区或更靠后的杏仁核基底外侧区。光纤通过头罩固定。手术后，小鼠至少有1周的恢复期和病毒表达期。所有小鼠首先在行为室中接受5天每次15分钟的适应性训练，以适应0.48克、200微米芯径的光纤的重量。使用Doric Lenses的光纤光度系统，在小鼠自由活动时同时记录和刺激两种荧光载体。GCaMP8和GACh3.0分别在465纳米处激发，以记录钙结合和乙酰胆碱活性。GCaMP8和GACh3.0的等吸收点均接近405纳米，因此该波长通道产生的发射光可作为运动伪影和噪声的对照。光度测量信号通过视频软件与神经痕迹对齐，以确定进食时段。实验时间线包括四个记录时段。每个时段都包含5分钟的电缆适应期，以及至少15分钟的进食期，在此期间给小鼠提供预先称重的颗粒饲料。这四个时段两两配对，每对时段间隔3天，第一天测量标准进食活动，第二天小鼠整夜禁食，第三天测量禁食后的进食活动。配对时段相隔一周。进食时段评估了在标准饲料呈现期间的活动情况。

光度测量轨迹按小鼠和记录会话进行分离，未应用逐次或逐次平均基线减法或振幅归一化。因此，所报告的值反映了等吸收点校正后的dF/F值。整个记录的平均值和标准差用于z分数计算。在每次咬食开始前3秒和开始后1秒计算z分数dF/F值，咬食的开始时间通过手动视频评分确定。在记录过程中使用Doric视频捕获软件作为数字输入，以精确对齐光纤光度测量记录与进食行为的视频记录。一旦对每只小鼠的进食咬食的技术重复进行平均，生物重复再进行平均，以创建复合平均值。为了计算平均z分数进食反应以及曲线下面积，计算进食前3秒和进食开始后1秒的平均z分数反应。然后从进食反应中减去基线，以生成所有咬食的标准化进食反应。为了简化数据分析，我们排除了在进食过程中包含的咬食。在此，我们将进食时段定义为在6秒内多次咬食重叠的进食实例。随后使用Sidak多重比较的单因素方差分析对AUC值进行比较。所有分析均在Prism 8中完成。

04.CRACM 和切片电生理学

对于急性脑切片的制备，动物先用异氟烷麻醉，然后用 pH 值为 7.35、渗透压为 310 毫渗量/升的冷人工脑脊液溶液灌注，该溶液包含以下成分（单位：毫摩尔/升）：125 氯化钠、2.5 氯化钾、1.25 NaH2PO4-H2O、2 氯化钙、1 氯化镁、10 葡萄糖、25 碳酸氢钠。迅速取出大脑并转移至 pH 值为 7.35 的蔗糖基切片溶液中，该溶液包含以下成分（单位：毫摩尔/升）：87 氯化钠、2.5 氯化钾、1.25 NaH2PO4-H2O、0.5 氯化钙2，7 MgCl2-6H2O，13 抗坏血酸，75 蔗糖，10 葡萄糖，25 碳酸氢钠3，用 5% CO2/95% 氧气2混合气体平衡。我们使用振动切片机制备 300 微米厚的冠状脑切片，并将其置于 37°C 的 5% CO2/95% 氧气2气泡的 ACSF 溶液中至少 15 分钟。然后将其逐渐降至室温（RT；25°C），并适应至少 15 分钟后进行记录。记录时，将切片转移到持续以 1 - 2 毫升/分钟的速度在 25°C 下灌注 ACSF 的记录室中。通过透射光 DIC 识别神经元。使用放大器以 10 千赫兹进行数字化记录。记录电极（3 - 5 兆欧）由硼硅玻璃微毛细管（外径，使用微管拉制仪将玻璃管拉制成 1.5 毫米的微电极。内溶液包含 110 毫摩尔/升的葡萄糖酸钾、10 毫摩尔/升的氯化钾、4 毫摩尔/升的 ATP-Mg、0.5 毫摩尔/升的 GTP-Na、10 毫摩尔/升的磷酸肌酸二钠、1 毫摩尔/升的 EGTA、10 毫摩尔/升的 HEPES、0.5%的生物素，用氢氧化钾将 pH 值调至 7.3，用葡萄糖酸钾将渗透压调至 305 毫渗量/升。根据形态、大细胞电容（50 - 120 皮法）和相对较低的输入电阻（70 - 250 兆欧姆）来识别基底外侧杏仁核内的主要神经元。对于典型的通道视紫红质辅助电路图谱（CRACM）实验，将细胞电压钳制在 -70 毫伏数分钟，以评估被动膜特性并确保封接稳定。在整个实验过程中监测接入电阻，通常在 10 - 20 兆欧姆范围内，认为 30 兆欧姆以内是可以接受的。为了评估光诱导突触反应的抑制性或兴奋性，我们将膜片钳模式切换为电流钳模式，并在有或无去极化电流注入的情况下获取 470 纳米光（10 毫秒脉冲）诱导的反应。在浴液中持续加入 GABA 受体拮抗剂苯甲酰胺以排除通过 GABA 释放产生的抑制作用。为了确定反应细胞的胆碱能特性，我们将电压钳制模式切换回 -70 毫伏，并施加一系列药物处理。每种药物处理条件下，细胞记录至少 10 次。每次扫描记录时间为 2 秒，蓝光（470 纳米）刺激持续 10 毫秒，每次扫描间隔 30 秒。为评估胆碱能神经元对基底外侧杏仁核（BLA）神经元的连接情况，我们在脑片室中使用了含以下终浓度药物的 ACSF（单位：微摩尔）：20 AP-5，10 CNQX，20 石蒜碱，10 阿托品，1 TTX，0.5 4-AP 和/或 0.5 美加明。

05.显微镜检查和免疫组织化学

在病毒注射后，动物至少需要 2 周的时间进行标记。处理时，动物用异氟烷深度麻醉，然后经心脏灌注 1×PBS，接着灌注 10%中性缓冲福尔马林。取出大脑，置于 4°C 的 10% NBF 中过夜后固定。大脑在 4°C 的 20%蔗糖 PBS 溶液中进行 1 天的冷冻保护处理，随后在 4°C 的 30%蔗糖 PBS 溶液中再处理 1 天。然后将大脑嵌入 OCT 冷冻包埋剂中冷冻，并在 -80°C 下保存。使用冰冻切片机将大脑切成 25 - 30 微米厚的冠状切片。对于 ChAT 染色，将 40 微米的自由漂浮切片在室温下用 10%马血清封闭液（含 1×PBS、0.5% Triton X-100，pH 7.35）封闭 1 小时。然后将切片在 4°C 下于 10%马血清封闭液中与山羊抗 ChAT 一抗（1:500，AB144P）孵育过夜。随后，切片在 PBS-T 中洗涤 4 次，每次 30 分钟，然后在室温下用 1:1000 稀释的二抗（山羊抗兔 Alexa Fluor 488 或 Alexa Fluor 555）孵育 3 小时。切片再用 PBS-T 洗涤 4 次，每次 30 分钟。所有切片均用 DAPI Fluoromount-G（0100-20）封片。使用共聚焦显微镜在 10× 或 20× 物镜下检测并拍摄荧光表达情况。

06.组织透明化

在异氟烷深度麻醉后，通过心脏灌注 10 毫升 1×PBS，然后灌注 10 毫升 4%多聚甲醛。取出整个大脑，置于 4%多聚甲醛中于 4°C 下过夜，随后在 4°C 下用 1×PBS 冲洗过夜。然后将大脑置于 4%丙烯酰胺水凝胶溶液（每只大脑 5 毫升溶液）中，于 4°C 下轻轻振荡过夜。接下来，将大脑转移至聚合系统（货号：C20001）中进行组织-水凝胶聚合（设置：温度 37°C，压力 -90 千帕，定时 3 小时）。聚合周期结束后，用 1×PBS 反复冲洗大脑，直至所有残留的水凝胶被清除。然后将大脑在电泳组织透明化溶液（货号：C13001）中短暂冲洗，再置于组织透明化系统 II（货号：30001）中进行主动电泳脂质清除（设置：电压 70 伏，电流 1 安，温度 35°C，定时 7 小时，泵速 100）。完成循环后，将脑组织用 1× PBS 反复冲洗，共冲洗 3 天。最后，将脑组织置于恒光溶液（折射率匹配溶液，25°C 时折射率 RI = 1.46，货号 C13101）中，在室温下过夜。

07.光片显微镜技术

将一只小鼠大脑半球（中矢状切面）用强力胶固定在亚克力载物台上，并将其浸入经 0.22 微米过滤的 1% 琼脂糖溶液中。待琼脂糖凝固后，将含样本的琼脂糖在室温下置于折射率匹配溶液中孵育 3 天。样本使用配备有定制大孔径样本室和 5× 干式物镜的侧平面照明显微镜进行可视化。所得图像使用软件进行合并和拼接。3D 重建和图形生成在图像分析软件上完成。

08.体内喂食实验

将 rAAV-EF1α-DIO-ChR2 (H134R)::EYFP-WPRE-hGHpA 或 rAAV-Ef1a-DIO-GFP-WPRE（如上所述）注射到 DBB 中的 Chat-Cre 小鼠，双侧植入自制的 200 微米石英光纤植入物（TS1249968）；230 微米插芯（MM-FER2007C-2300），并置于 BLA 上（ML，±3.35 毫米；AP，−1.60 毫米；DV，−4.70 毫米）。光纤植入物通过由粘合剂（C&B Metabond 快速粘合剂系统）制成的帽固定，帽的头部用闪光丙烯酸（44115 和 44119）交联。在进行实验前，小鼠至少有两周的时间恢复并表达病毒。所有小鼠在行为实验前，先在行为室中适应 30 分钟，同时通过一根双光纤线（Doric Lenses）与 473 纳米激光源相连。适应后，小鼠禁食过夜。早上，给小鼠提供标准的预先称量好的颗粒饲料，每 30 分钟记录一次进食量，持续 2 小时，分别在光照刺激（5 毫瓦，10 毫秒脉冲，20 赫兹，5 秒脉冲串，30 秒间隔）条件下和无刺激条件下进行。试验随机安排，且在同一批动物身上每隔一周进行一次。采用独立样本 t 检验比较不同动物在“刺激”和“无刺激”条件下的进食量。作为对照组，同窝小鼠按照上述方法注射表达绿色荧光蛋白的病毒，并与实验小鼠进行相同的植入操作。对模拟刺激组和实验组之间的比较采用非配对统计方法进行分析。

09.套管喂食实验

在药理学实验中，将 12 周龄的 Chat-Cre 小鼠双侧注射 500 纳升重组腺相关病毒（rAAV AAV-Ef1a-FLEX-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA）至背侧被盖区（DBB）（ML ±1.34 毫米；AP 1.10 毫米；DV -5.80 毫米），每侧 500 纳升，随后在 DBB 区植入 0.22 数值孔径、200 微米芯径的光纤植入物（200 微米芯径，数值孔径为 0.22），并植入给药套管（药物套管起始套件，28 号单内套管，26 号单导向管）。在基底外侧杏仁核（BLA）上方（内侧-外侧，±3.35 毫米；前-后，−1.60 毫米；上-下，−4.70 毫米）植入了导管。手术后，小鼠有两周的时间用于恢复和病毒表达。所有小鼠都适应了连接 0.22 数值孔径、200 微米芯径的光遗传学电缆（Doric Lenses）3 小时。小鼠进行了三次每次 1 小时的进食实验，每次实验间隔一周，以便从禁食中恢复。每次实验前，小鼠禁食过夜，称重，然后连接光遗传学电缆放入行为室。小鼠有 1 小时的时间适应行为室。接下来的 1 小时内，给小鼠提供预先称重的标准饲料颗粒（4 2920X），在进食实验结束时再次称重以追踪小鼠的进食量。进食实验结束后立即称量食物和小鼠的重量。第一次实验测量禁食后小鼠的基线食欲。第二次实验引入对背侧被盖区（DBB）的光遗传学刺激（5 毫瓦，10 毫秒脉冲，20 赫兹，5 秒脉冲串，30 秒间隔）。第三次实验结合了对 DBB 的光遗传学刺激以及向 BLA 注射药物混合物（美加明 20 毫摩尔加阿托品 1 毫摩尔）。

10.饱食和饥饿状态下动物的 Fos 表达

野生型动物在前一天晚上禁食，次日早晨给予标准颗粒状小鼠饲料 1 小时（饱食组），而另一组小鼠则禁食一夜但未给予饲料（饥饿组）。随后立即处死小鼠，并用 PBS 和 10% 中性缓冲福尔马林灌注。将脑组织在 10% 中性缓冲福尔马林中固定过夜，然后在 20% 和 30% 蔗糖/1× PBS 溶液中各固定一夜。将脑组织在 OCT 切片包埋剂中冷冻，切成 35 微米厚的切片。切片在室温下于 10% 马血清封闭液（1× PBS-T，即 1× PBS、0.5% Triton X-100、0.1 mM CaCl2，pH 7.35）中封闭 1 小时。切片在 4°C 下用兔抗 c-Fos 抗体（PC38）以 1:1000 稀释度封闭液中孵育过夜。然后用 1× PBS-T 冲洗 4 次，每次 30 分钟。切片在室温下用二抗（山羊抗兔 Alexa Fluor 594）以 1:500 稀释度孵育 3 小时，然后用 1× PBS-T 冲洗 4 次，每次 30 分钟。所有切片均用 DAPI Fluoromount-G（0100-20）封片。使用共聚焦显微镜在 20×物镜下对荧光表达进行检测。

11.采用 OFA 和 EPM 测量焦虑水平

将 Chat-Cre 小鼠分别注射 rAAV-Ef1a-DIO-ChR2::EYFP 或 rAAV-Ef1a-DIO-GFP-WPRE，并按照上述方法植入光纤，以评估蓝斑核胆碱能末梢光遗传激活对焦虑和恐惧的影响。在行为实验前，动物每天适应实验人员和光纤连接 3 分钟，持续 3 天。实验当天，动物在行为实验开始前至少适应环境 1 小时，并在连接光纤后恢复 1 分钟，然后放入 40 厘米×40 厘米×20 厘米的开放场装置中。在行为测试期间，小鼠在三个 180 秒的阶段内自由探索装置：（1）光遗传刺激前的基线阶段（“预光遗传”），（2）光遗传刺激阶段（“光遗传”），（3）光遗传刺激后的阶段（“后光遗传”）。使用软件自动追踪动物并记录测量数据。

12.腺相关病毒

1201. Cre 依赖型突触素：AAV-Ef1a-FLEX-突触素：：mRuby2-WPRE-hGHpA

0101. 血清型：DJ8

0102. 滴度：4.06×10⁻12 拷贝/毫升

0103. 位于简和丹·邓肯神经学研究所的神经连接核心实验室

1202.Cre 依赖型 ChR2：AAV-Ef1a-FLEX-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA

0201. 血清型：2/9

0202. 滴度：9.02×10⁻12 拷贝/毫升

0203. 来源：丹·邓肯神经科学研究所神经连接核心实验室；由 #40260 子克隆而来

1203.四环素依赖型绿色荧光蛋白：AAV-Ef1a-FLEX-eGFP

0301. 血清型：DJ8

0302. 8.20189×10⁻12 毫克/毫升

0303. 来源：丹·邓肯神经科学研究所神经连接核心实验室；由 #28304 子克隆而来

1204.Cre 依赖型 GCaMP：AAV-Syn-FLEX-GCaMP8s-WPRE-hGHpA

0401. 血清型：DJ8

0402. 滴度：3.53×10⁻12 拷贝/毫升

0403. 来源：丹·邓肯神经科学研究所神经连接核心实验室；由 #100839 子克隆而来

1205.Cre 依赖型 GACh3.0：rAAV-hSyn-DIO-GACh3.0

0501. 血清型：DJ8

0502. 滴度：7.93×10⁻12 拷贝/毫升

0503. 来源：丹·邓肯神经学研究所的神经连接核心实验室；由 #121923 提供包装材料

三、结果

01.DBB 胆碱能神经元投射至基底外侧杏仁核（BLA）

基底前脑胆碱能神经元可调节食欲抑制。为了确定胆碱能基底前脑下游潜在的抑制食欲神经元，我们利用条件性病毒表达突触定位报告基因 Synaptophysin::mRuby2 在 Chat-Cre 小鼠中靶向 DBB（图 1A、B）。注射三周后，我们观察到 DBB 胆碱能神经元的多个投射目标，包括海马体、嗅球、垂体柄、视觉皮层和基底外侧杏仁核（BLA）（图 1C）。其中，我们注意到 BLA 具有高密度的 DBB ACh 突触末梢，从解剖学上表明该结构是下游靶点（图 1D）。此外，利用 CLARITY 和光片成像技术，我们三维可视化了 DBB 向 BLA 的投射，进一步证明了 DBB 与 BLA 之间存在强大的连接性，并且投射至杏仁核的胆碱能突触末梢选择性地支配 BLA 而非其他杏仁核亚结构（图 1C）。此前曾有研究提出，基底外侧杏仁核（BLA）内具有地形学差异的亚区可能分别负责奖赏和厌恶的功能输出。为了探究杏仁核内的亚区是否可能选择性地接收来自背侧被盖区（DBB）的输入，我们沿 BLA 的前/后轴量化了 DBB 乙酰胆碱（ACh）投射密度，发现 DBB 胆碱能神经元在整个 BLA 内表现出广泛的投射模式，且在前部区域的标记最为密集（图 1E、F）。由于 BLA 已知具有功能上不同的亚核，这些数据表明 DBB 胆碱能信号在所有 BLA 亚核中均有传递。然而，BLA 亚核接收和响应不同 DBB 胆碱能输入的程度仍有待确定。

图 1. DBB 胆碱能神经元向基底外侧杏仁核（BLA）投射密集。A，将 DIO-Syn::mRuby2 递送至基底前脑并定位至 BLA 的策略。B，通过抗 ChAT 抗体检测 DBB 中 ChAT+细胞靶向，并通过条件性 AAV Syn::mRuby2 报告基因共表达进行免疫组织化学确认。C，CLARITY 图像显示 DBB 胆碱能投射（比例尺，1000 微米）。代表性的图像显示胆碱能 DBB 神经元投射至 BLA 下游的四个最密集的脑区，从前往后依次为（比例尺，50 微米）。D，胆碱能 DBB 投射至视觉皮层（0.1633 ± 0.120 AU）、海马体（0.2533 ± 0.027 AU）、嗅球（0.1033 ± 0.015 AU）和 BLA（0.4867 ± 0.018 AU）的量化，n = 3。E，胆碱能末梢从前往后投射至 BLA 的代表性图像（比例尺，50 微米）。F，BLA A-P 轴上胆碱能 DBB 末梢的量化，n = 7。

02.DBB 胆碱能神经元与基底外侧杏仁核（BLA）存在功能连接

顺行病毒示踪数据揭示了杏仁核基底外侧核（BLA）与背侧缰核（DBB）之间的解剖学连接（图 1）。然而，仅通过解剖学示踪无法确定相关脑区是否具有功能连接。因此，我们采用光遗传学结合 CRACM 技术来探究 DBB 与 BLA 之间的突触连接。为此，我们通过立体定位将病毒载体（携带 ChR2）递送至 Chat-Cre 小鼠的 DBB（图 2A）。在验证 BLA 中 ChR2+纤维的表达后，我们接下来对 BLA 内的谷氨酸能细胞（通过形态和电生理特性识别）进行体外全细胞膜片钳电生理记录，同时光刺激表达 ChR2 的 DBB 突触末梢，并采用药理学方法探究这两个节点之间的突触传递性质（图 2B）。

图2.DBB 胆碱能神经元与 BLA 神经元单突触连接。A，DBB 中靶向表达 ChR2 的策略，结合 BLA 切片电生理记录。B，含 BLA 的脑切片及记录位点示意图。C，蓝光脉冲（10 毫秒）刺激后 BLA 神经元的电压钳记录示例，以及依次阻断谷氨酸受体（CNQX、APV）、GABA 能传递（箭毒）、毒蕈碱受体阻滞剂（阿托品）、快速突触传递（TTX/4-AP）和烟碱受体（美加明）的药理学阻断实验。细胞表现出单突触烟碱反应。试验包括 20 秒的扫描，试验间隔 1 分钟，每个基线重复 5 次扫描。D，DBB 终末光遗传学刺激后 BLA 神经元光诱发内向电流峰值幅度（pA）在含阿托品（22.18 ± 2.815 pA）、CNQX + APV（15.91 ± 1.816 pA）、TTX（1.000 ± 0.3015 pA）、4-AP（18.73 ± 1.784 pA）、阿托品（16.82 ± 2.235 pA）和美加明（0.3636 ± 0.1521 pA）的 ACSF 中的记录。误差线代表标准误。n = 11 个细胞，4 只小鼠。E，来自基底外侧杏仁核（BLA）神经元的代表性电压钳记录，展示了对美加明敏感的内向电流和对阿托品敏感的外向电流。在 10 毫秒的蓝光脉冲后，依次施加了对 GABA 能传递（箭毒碱）、谷氨酸受体（CNQX、APV）、动作电位依赖性突触传递（TTX/4-AP）、毒蕈碱受体阻滞剂（阿托品）和烟碱受体阻滞剂（美加明）的药理学阻断。试验包括 20 秒的扫描，试验间隔为 1 分钟，每个基线重复 5 次扫描。细胞表现出单突触烟碱和毒蕈碱反应。F，光刺激背侧纹状体（DBB）末梢后，BLA 神经元中光诱发的阿托品敏感外向电流的峰值幅度（pA）在人工脑脊液（ACSF）+ 箭毒碱（21.18 ± 2.522）、CNQX + APV（17.91 ± 2.651 pA）、TTX（1.091 ± 0.3682 pA）、4-AP（24.73 ± 1.641 pA）和阿托品（0.0909 ± 0.09091 pA）条件下。误差线代表标准误差。n = 11 个细胞，4 只小鼠。G，37 个记录的神经输入在毒蕈碱和烟碱（24.3%）、烟碱（32.4%）、毒蕈碱（5.4%）和无反应者（37.8%）之间的分布。H，基底外侧杏仁核（BLA）神经元在电流钳模式下的记录总结。图中显示了平均 8 个神经元及其在蓝光刺激（10 毫秒）下的基线校正超极化反应（单位：毫伏）。I，BLA 神经元在光脉冲前的膜电位（-66.67 ± 0.718 毫伏）、光遗传学刺激后的峰值超极化反应（-70.81 ± 1.088 毫伏）以及蓝光刺激后的恢复期膜电位（-66.79 ± 0.7508 毫伏），所有记录均在含 ACSF + 鸦片碱的溶液中进行。n = 8 个细胞，3 只小鼠。J，代表性曲线显示了由于持续去极化电流注入（50 皮安）引起的胆碱能输入对主要 BLA 神经元放电的影响。光诱导的胆碱能末梢激活导致 IPSP 及相关放电暂停（ACSF + 鸦片碱）。

在对谷氨酸能的杏仁基底外侧核（BLA）细胞建立电压钳制的全细胞配置后，用短暂的蓝光脉冲刺激表达 ChR2 的胆碱能背侧杏仁核基底部（DBB）末梢。光刺激后，我们观察到约 62% 的记录到的 BLA 细胞产生了明显的电流。添加 TTX 和 4-AP 的叠加洗脱表明，对光遗传学刺激作出反应的 DBB→BLA 神经元之间存在单突触连接。为了分离胆碱能反应，我们在所有记录条件下使用了 GABA 和谷氨酸受体拮抗剂（AP5、CNQX 和苯甲酰胺）。由于乙酰胆碱可以与离子型烟碱受体或代谢型毒蕈碱受体结合，因此使用了烟碱受体（美加明）和毒蕈碱受体（阿托品）的药理拮抗剂来确定 DBB→BLA 突触的性质。我们发现一些 BLA 神经元表现出内向的美加明敏感型烟碱电流（图 2C、D），一些 BLA 神经元表现出外向的阿托品敏感型毒蕈碱电流（图 2E、F），还有一些 BLA 神经元同时表现出烟碱和毒蕈碱电流（图 2G）。在记录的 37 个 BLA 神经元中，有 23/37 个表现出单突触胆碱能反应。在这些单突触反应细胞中，23 个中有 12 个仅表现出烟碱型反应，2 个仅表现出毒蕈碱型反应，而 9 个则同时表现出烟碱型和毒蕈碱型反应（图 2G）。因此，胆碱能 DBB 神经元与下游的 BLA 神经元形成了功能性的突触连接，由于烟碱型和毒蕈碱型乙酰胆碱受体的表达差异，产生了异质性反应。

由于乙酰胆碱与其相应受体结合对神经元产生的下游效应多种多样，接下来我们试图进一步评估 DBB→BLA 胆碱能传递可能产生的兴奋或抑制作用。为此，我们测试了光诱发的膜电位变化，采用电流钳模式。同样，我们在光遗传学激活胆碱能 DBB 神经末梢的同时，从兴奋性 BLA 神经元进行记录。为分离兴奋性反应，在整个记录过程中使用了 GABA 受体拮抗剂苯甲酰硫脲。在这样的条件下记录的 11 个神经元中有 8 个表现出光诱导的超极化（相对于静息电位 2 - 6 毫伏；图 2H、I），以及对略高于阈值（60 - 150 皮安）的注入电流的短暂（462 ± 92 毫秒）停火（图 2J）。

总之，胆碱能背侧脑桥核（DBB）与基底外侧杏仁核（BLA）在功能上相互连接，BLA 细胞通过烟碱型和毒蕈碱型乙酰胆碱受体接收来自胆碱能 DBB 的输入。综合来看，这些数据表明 DBB 胆碱能输入可能作用于 BLA 的不同亚群，抑制和/或激活特定的目标细胞群，从而调节食欲和进食行为。

03.蓝斑核在进食期间表现出选择性的胆碱能信号动态变化和活动模式

解剖追踪和电生理记录数据（图 1、2）表明胆碱能背侧被盖区（DBB）与基底外侧杏仁核（BLA）之间存在功能联系。近期研究强调 BLA 是影响进食行为的神经回路节点，包括线索驱动的食物摄入、食欲抑制以及高脂肪饮食偏好。

由于在进食或获得奖励时已观察到杏仁核中乙酰胆碱的释放，我们接下来探究了基底外侧杏仁核（BLA）中乙酰胆碱的释放与进食行为之间的关联程度。

为了首先评估 BLA 目标神经元对进食信号的响应程度，我们试图在进食行为期间直接监测 BLA 神经元的活动。BLA 内 95% 的神经元为锥体兴奋性神经元，且 vGlut2 已被证明是谷氨酸能 BLA 神经元的普遍标志物。利用这一点，我们向 Slc17a6-Cre（vGlut2-Cre）小鼠的两个不同 BLA 坐标（前 BLA 定义为 Bregma -0.70 至 -1.46 毫米；后 BLA 定义为 Bregma -1.47 至 -2.18 毫米）注射了条件性遗传编码钙指示剂 GCaMP8，并植入光纤，以在活体中通过光纤光度测定法记录进食期间拓扑定义的兴奋性 BLA 神经元的活动动态（图 3A、B）。注射并植入光纤的小鼠禁食过夜，然后给予食物 1 小时，在此期间记录进食行为和 BLA 活动动态。在整个记录过程中，对小鼠进行视频追踪，以便事后对行为进行评分，从而确定进食时段，并将这些时间点与光纤光度记录数据对齐。GCaMP 反应表明，在进食期间，后侧杏仁基底外侧核（BLA）的活动显著高于基线水平（图 3C、D；1.272 ± 0.2045 AU；p = 0.0003）。我们还通过测量进食期间（食物摄入后 1 秒）前侧和后侧 BLA 组的响应曲线下的面积（AUC）来比较不同荧光报告信号。与基线相比，进食期间后侧 BLA 的活动显著增加（图 3E；18.09 ± 2.608 AU；p = 0.0001），且后侧 BLA 对进食的 GCaMP 反应性显著高于前侧 BLA（图 3F；18.09 ± 0.7693；p = 0.0364）。因此，BLA 对进食的启动反应具有区域选择性。

图 3.进食诱导的基底外侧杏仁核（BLA）活动增强及胆碱能信号传导。A，使用 GCaMP 和光纤光度测定法在 BLA 进行体内成像的注射和植入策略示意图。B，BLA 中 GCaMP 表达的免疫组织化学确认及光纤植入位置。C，所有动物的平均 GCaMP dF/F 曲线。阴影区域代表 95% 置信区间。进食期间 BLA 内沿 A-P 轴的表达情况。D，使用光纤光度测定法测量 BLA 神经元的平均进食反应。误差线代表标准误。n = 4。进食反应的平均 z 分数 dF/F：aBLA，p = 0.6943；pBLA，p = 0.0003。E，使用光纤光度测定法测量 BLA 神经元进食反应的平均 AUC。进食反应值减去基线以将其归一化到各自的基线。进食反应 AUC 与基线进行比较以确定统计学意义，使用单样本 t 检验，零假设等于 0。误差线代表标准误。n = 4。aBLA 和 pBLA 之间进食反应的平均 z 分数 dF/F AUC：aBLA，p = 0.0990；pBLA，p = 0.0001。F，使用光纤光度测定法测量 BLA 神经元进食反应的平均 AUC。G. 描绘了在基底外侧杏仁核（BLA）中使用 GACh3.0 和光纤光度测定法进行体内成像的注射和植入策略的示意图。H. 免疫组织化学确认了 BLA 中 GACh3.0 的表达以及光纤植入的位置。I. 在进食期间 BLA 内沿前后轴的平均 GACh3.0 ΔF/F 表达。阴影区域代表 95% 的置信区间。J. 使用光纤光度测定法测量的 BLA 神经元的平均进食反应。误差线代表标准误差。n = 6。平均 z 分数 dF/F 进食反应：aBLA，p = 0.3833；pBLA，p = 0.002。K. 使用光纤光度测定法测量的 BLA 神经元的平均进食反应面积（AUC）。进食反应值减去基线以将每个值归一化到其自身的基线。使用单样本 t 检验将平均进食反应 AUC 与基线进行比较以确定统计学意义，零假设等于 0。误差线代表标准误差。n = 4。aBLA 和 pBLA 之间 z 分数 dF/F 进食反应的平均 AUC：aBLA，p = 0.2424；pBLA，p = 0.0184。L. 进食期间前部和后部 BLA 的平均 AUC 定量。

由于乙酰胆碱已被证实具有抑制食欲的作用，接下来我们试图使用乙酰胆碱传感器 GACh3.0 在 vGlut2-Cre 小鼠的基底外侧杏仁核（BLA）内直接监测进食期间的乙酰胆碱释放情况（图 3G、H），记录 BLA 前后两个区域的 GACh3.0 反应差异。为此，将小鼠禁食过夜，然后在 1 小时内提供食物，同时记录胆碱能动力学变化。在整个记录过程中，通过视频追踪小鼠，以便事后对行为进行评分，从而确定进食时段，并将这些时间点与光纤光度测量记录数据对齐。对光度测量记录进行量化，包括进食前（进食开始前 3 秒）和进食开始时（进食开始后的第 1 秒）基底外侧杏仁核前部和后部的平均反应和曲线下面积（AUC）进行比较。这些数据表明，在进食期间乙酰胆碱的释放显著增加（图 3I），与基线水平相比，在咬一口食物后的 1 秒内，GACh3.0 信号显著增强（图 3J-L；0.2771 ± 0.09131 AU；p = 0.0037）。值得注意的是，后侧杏仁核对食物摄入的反应比前侧杏仁核更强烈（图 3J；0.2771 ± 0.068；p = 0.0020）。作为初步分析，我们比较了进食期间（初始摄食动作后 1 秒）前侧和后侧杏仁核组的荧光反应（以 AUC 表示），并与进食前的基线水平进行了比较。我们观察到后侧杏仁核 GACh3.0 活性的基线 AUC 值在进食期间显著增加（图 3K；0.2771 ± 0.09131；p = 0.0037）。与 GCaMP 数据一致，我们观察到进食期间杏仁核中 GACh3.0 的平均 AUC 分数显著增加（图 3L；9.056 ± 2.730；p = 0.0214），这表明向杏仁核的信号增强与进食行为相关。

在进行这些实验的同时，我们还独立评估了禁食和再进食试验后的 Fos 表达情况。实验小鼠经历了一个典型的 24 小时禁食期后，可自由进食。40 分钟后，处死动物并采集组织，进行固定和处理，以检测 Fos 表达（图 4A）。随后，对 Fos 表达情况进行了分析。沿基底外侧杏仁核（BLA）的前后轴对其进行了评估，并与未进食的对照动物进行比较以量化差异（图 4B、C）。与通过活体成像记录的实时神经元反应一致，在禁食-再进食期后，BLA 中的 Fos 被上调。

图 4.1 进食后，杏仁外侧核（BLA）的活动增强。A，进食和行为时间线示意图。B，沿腹背轴（A-P 轴）BLA 内 Fos 表达的定量测量。C，进食或禁食动物 BLA 内 Fos+表达的免疫组织化学确认（比例尺，200 微米）。

综合来看，这些数据表明，在进食过程中，兴奋性杏仁核基底外侧区（BLA）神经元的活动以及 BLA 区胆碱能神经元的释放均呈动态增加。鉴于 BLA 与胆碱能背侧脑桥（DBB）之间存在功能连接，这些数据支持这样一种模型，即胆碱能 DBB 投射至 BLA 可激活 BLA 内的细胞，从而调节食欲抑制。

04.激活胆碱能的 DBB（背侧被盖区）至 BLA（杏仁核基底外侧核）的投射可减少食物摄入量

先前的研究表明，胆碱能背侧黑质（DBB）激活会减少食物摄入量，并且在进食后杏仁核内检测到了乙酰胆碱（ACh）水平的升高。鉴于我们发现胆碱能 DBB 神经元与基底外侧杏仁核（BLA）存在功能连接，进食期间 BLA 内检测到了 ACh 的释放，并且 BLA 本身也会因进食而被激活，我们接下来探究胆碱能 DBB→BLA 回路是否可直接调节食欲抑制。为此，我们将表达条件性光敏感通道蛋白 2（ChR2）的腺相关病毒（AAV）靶向注射到 Chat-Cre 小鼠的 DBB 中（图 5A），并在 BLA 双侧植入光纤以光刺激胆碱能 DBB 终端。对照组小鼠则注射条件性绿色荧光蛋白（GFP）AAV，并在 BLA 双侧植入光纤。由于通过光纤光度测量记录发现后侧 BLA 在进食时被强烈激活（图 3），我们将光纤刺激植入物定位在 BLA 的更后侧区域（ML，±3.35；AP，−1.60；DV，−5.30）。恢复后，将光遗传学小鼠禁食过夜，随后进行 2 小时的光刺激，并记录其食物摄入量（图 5B）。与光刺激的 GFP 对照组相比，表达 ChR2 的光刺激小鼠的食物摄入量减少了近 40%，这与 DBB→BLA 连接在进食中的作用一致（图 5C；未配对 t 检验，p = 0.0114）。

图 5. 光遗传学激活基底外侧杏仁核（BLA）中背侧被盖区（DBB）胆碱能末梢可抑制食欲。A，DBB 中 ChR2 表达及 BLA 中光纤植入/刺激策略。B，DBB 胆碱能纤维在 BLA 终末场刺激及相应食物摄入量测量的时间线和策略图示。C，ChR2 动物（实验组）与 GFP 动物（对照组）的食物摄入总量（以克为单位）。使用独立样本非配对 t 检验计算统计学显著性。误差线表示标准误，N = 12，GFP 对照组，0.982 ± 0.117 克；ChR2 动物，0.550 ± 0.092 克；p = 0.0114。D，DBB 中 ChR2 表达及 DBB 中光纤植入/刺激和 BLA 中药物插管策略。E，DBB 细胞体刺激和 BLA 药物插管及相应食物摄入量测量的时间线和策略图示。F，不同条件下（基线（未刺激）、刺激+溶剂、刺激+药物）单个 ChR2（实验组）小鼠的食物摄入总量（以克为单位）。统计学显著性通过重复测量的双因素方差分析（ANOVA）结合邦费罗尼多重比较检验计算得出。误差线代表标准误。N = 5。ChR2 动物：基线时，0.278 ± 0.034 克；刺激时，0.152 ± 0.028 克；刺激+药物输注时，0.274 ± 0.016 克。基线与刺激相比，p = 0.0044；基线与刺激+药物输注相比，p ≥ 0.999；刺激与刺激+药物输注相比，p = 0.0057。G，GFP（对照）动物在所有条件下的总食物摄入量（以克为单位）。统计学显著性通过重复测量的双因素方差分析（ANOVA）结合邦费罗尼多重比较检验计算得出。误差线代表标准误。N = 5。GFP 对照组：基线时，0.272 ± 0.020 克；刺激时，0.248 ± 0.017 克；刺激+药物输注时，0.218 ± 0.041 克。基线与刺激相比，p ≥ 0.9999；基线与刺激+药物输注相比，p = 0.3602；刺激与刺激+药物输注相比，p ≥ 0.9999。H，ChR2 组与对照组在所有条件下的总食物摄入量比较。统计学显著性通过重复测量的双因素方差分析（ANOVA）结合图基多重比较检验计算得出。误差线代表标准误。n = 5。对于 ChR2 动物：基线与刺激相比，p = 0.0034；基线与刺激加药物输注相比，p = 0.9916；刺激与刺激加药物输注相比，p = 0.0044。对于 GFP 对照组：基线与刺激相比，p = 0.9022；基线与刺激加药物输注相比，p = 0.2459；刺激与刺激加药物输注相比，p = 0.4487。I，刺激期间 ChR2 组与对照组的平均食物摄入量。使用独立样本 t 检验计算统计学显著性。误差线表示标准误。对于 GFP 对照组：0.248 ± 0.017 克。对于 ChR2 动物：0.152 ± 0.028 克，p = 0.0196。

蓝斑杏仁核（BLA）是几个胆碱能背侧黑质（DBB）靶点之一，它们可能同时调节食欲。为了测试仅 BLA 在胆碱能 DBB 调节食欲中的必要性，我们将光遗传学激活胆碱能 DBB 与 BLA 的药理学抑制相结合。换句话说，通过光遗传学激活 DBB 胆碱能细胞体，同时抑制 BLA 中的胆碱能受体，我们选择性地抑制了胆碱能信号向 BLA 的传递，同时激活了 DBB 胆碱能神经元及其非 BLA 侧支。因此，如果 BLA 是 DBB 胆碱能食欲抑制的主要效应器，那么抑制这一节点将阻断胆碱能 DBB 激活的食欲抑制作用。为此，我们将表达条件性 ChR2-EYFP 或条件性 GFP 的腺相关病毒（AAV）靶向到 Chat-Cre 动物的 DBB，并在 DBB 双侧植入光纤以激活 DBB 细胞体（图 5D）。同时，在 BLA 后部双侧植入导管，以便在进食试验期间输注胆碱能受体拮抗剂。恢复后，双植入小鼠禁食过夜，次日给予 1 小时进食时间。第一周，记录禁食动物的基线食物摄入量，期间未进行任何光遗传学或药理学操作。第二周，在 ChR2 小鼠和 GFP 小鼠接受光遗传学刺激的同时，进行溶媒对照灌注，记录食物摄入量。如预期，用溶媒对照灌注刺激 ChR2 小鼠的 DBB 细胞体，与 GFP 对照组相比，在 1 小时进食期内显著减少了食物摄入量。第三周，对小鼠进行光遗传学刺激的同时，向 BLA 灌注广谱乙酰胆碱受体拮抗剂（含美加明和阿托品的混合液）（图 5E）。向 BLA 灌注乙酰胆碱受体拮抗剂后，光遗传学驱动的食物摄入量减少被消除，进食行为恢复正常，与基线、未刺激的对照组相比，食物摄入量无显著差异（图 5F、H）。此外，未接受刺激的 GFP 对照组在使用乙酰胆碱受体阻滞剂后，食物摄入量也无显著变化。这表明仅对基底外侧杏仁核（BLA）的胆碱能抑制作用不会影响饥饿动物的进食行为（图 5G、H）。

这些数据表明，蓝斑杏仁核（BLA）对于去甲肾上腺素能背侧被盖区（DBB）胆碱能激活所导致的摄食量减少是必需的，并且仅激活 DBB 胆碱能投射至 BLA 即足以减少摄食量。所有病毒注射部位和光纤植入部位均在事后进行了定位，以验证靶向的准确性（图 6）。重要的是，激活该回路并未导致焦虑减轻或运动行为改变，这一点通过旷场实验和高架十字迷宫实验得以证实（图 7）。因此，选择性激活后侧 BLA 中来自 DBB 的胆碱能输入会导致摄食量减少。综上所述，这些数据表明 DBB→BLA 回路具有抑制食欲的作用，并且确定 BLA 是 DBB 胆碱能信号在调节摄食量方面的下游效应器。

图 6. 光纤和导管植入位置验证。A，GFP 与 ChR2 动物中植入 BLA 区域用于胆碱能末梢场刺激的光纤位置在艾伦脑图谱上的映射。B，GFP 与 ChR2 动物中植入 DBB 区域用于细胞体刺激的光纤位置在艾伦脑图谱上的映射。C，免疫组织化学显示 GFP 与 ChR2 动物中植入 DBB 区域用于细胞体刺激的光纤位置及 ChR2+表达。D，GFP 与 ChR2 动物中植入 BLA 区域用于刺激的药物导管位置在艾伦脑图谱上的映射。E，GFP 与 ChR2 动物中植入 BLA 区域用于药物混合液输注的药物导管位置在艾伦脑图谱上的映射。

图 7. 杏仁核胆碱能释放不影响运动。A，旷场实验刺激方案的时间线。B，旷场实验分为 3 - 5 分钟的阶段：刺激前阶段、刺激阶段和刺激后阶段。动物通过植入的光纤向杏仁核基底外侧核（BLA）施加蓝光。记录并绘制所有阶段的移动距离。C，高架十字迷宫实验刺激方案的时间线。D，高架十字迷宫实验分为 3 - 5 分钟的阶段：刺激前阶段、刺激阶段和刺激后阶段。动物通过植入的光纤向杏仁核基底外侧核（BLA）施加蓝光。记录并绘制所有阶段的移动距离。

四、讨论

进食是一种由多个汇聚神经回路调节的关键稳态机制。尽管下丘脑在稳态进食方面已得到广泛研究，但稳态进食机制和奖赏进食机制常常相互重叠。在此，我们发现胆碱能背侧脑桥核（DBB）神经元向基底外侧杏仁核（BLA）投射，BLA 是参与情绪调节和效价处理的主要边缘系统节点。通过病毒示踪技术，我们确定 BLA 是胆碱能 DBB 的主要下游投射位点之一。为了测量 DBB 胆碱释放的电生理效应，我们在 BLA 神经元上进行记录，同时在胆碱能 DBB 神经元的 ChR2+纤维中诱发 ACh 的突触释放。我们发现，BLA 中的大多数神经元通过快速起效的烟碱型受体对 DBB 胆碱能输入作出反应，从而在 BLA 神经元中引发兴奋性反应。然而，我们也观察到一小部分记录的 BLA 神经元通过胆碱能信号传导产生较慢的抑制性反应。有趣的是，我们还通过 GCaMP 信号传导和光纤光度测定法观察到，BLA（基底外侧杏仁核）的活动与食物摄入直接相关，进食的开始导致后侧 BLA 活动增强。同样，我们发现获取食物后杏仁核内的乙酰胆碱水平升高，这表明食物摄入和食物获取与乙酰胆碱的释放之间存在紧密联系。重要的是，杏仁核内乙酰胆碱释放的总体净效应进食期间，胆碱能激活导致食物摄入量减少，且 DBB 胆碱能激活的食欲抑制作用依赖于基底外侧杏仁核（BLA）。总之，这些结果支持这样一种模型，即 DBB 胆碱能投射至 BLA 调节 BLA 神经元的活动，并驱动食欲抑制。

基底前脑胆碱能系统与多种行为相关，包括注意力、感觉处理、奖赏，以及最近发现的抑制食欲。我们已经确定，背侧被盖区胆碱能系统神经元向多个脑区投射，包括视觉皮层、海马体、嗅球，以及最显著的是杏仁核的基底外侧核（BLA）。背侧被盖区（DBB）和 BLA 在处理感觉刺激方面都发挥着重要作用，BLA 是一种广为人知的情绪调节器，能够将外部感觉信息与价值判断相结合。此外，BLA 还因在恐惧和焦虑中的作用而闻名，BLA 内的胆碱能信号传导会影响记忆巩固。由于食欲调节受价值判断和感觉线索的共同影响，近期研究已将 BLA 指定为食欲调节的一个节点。在此，我们进一步证明 DBB 是向 BLA 提供胆碱能输入的一个重要来源，这种连接能够调节进食行为。

利用 CRACM 和电生理学方法，我们发现背侧脑桥核（DBB）胆碱能输入对基底外侧杏仁核（BLA）的反应是异质性的。值得注意的是，我们发现 DBB 胆碱能信号通过烟碱型受体激活 BLA 神经元的子集，但通过毒蕈碱型受体抑制 BLA 神经元的较小部分。此外，BLA 内大多数对胆碱能信号有反应的神经元同时表现出两种类型的反应，即通过烟碱型和毒蕈碱型突触进行信号传导。因此，DBB 对 BLA 的胆碱能输入可能激活一些抑制食欲的细胞，抑制驱动食欲的细胞，以及/或者以更组合或复杂的方式调节其他 BLA 细胞。事实上，最近的研究表明，动物的稳态状态可以影响 BLA 内的神经网络。有可能乙酰胆碱（ACh）能够以剂量和/或状态依赖的方式独特地修改神经回路，从而激活或抑制下游目标。综上所述，DBB 胆碱能驱动对 BLA 的作用可能导致进食行为动态的调节，但控制这种作用的确切信号机制仍有待阐明。有趣的是，最近的研究发现，在奖励获取任务中，乙酰胆碱（ACh）的释放对杏仁核起着重要作用。通过纤维光度测定胆碱能释放，我们观察到在基底外侧杏仁核（BLA）的不同解剖区域对食物摄入的反应存在差异。例如，后部 BLA 的胆碱能信号在食物摄入时表现出最大的激活增加。同样，在进食开始时，后部 BLA 的 ACh 释放量更高。这一发现得到了先前研究的支持，这些研究表明 BLA 中存在不同解剖位置和基因定义的神经元群，其中前部 BLA 促进食欲行为，而后部 BLA 抑制食欲。其他近期研究还提出 BLA 内存在分层的信号处理模型，其中兴奋性细胞对厌恶或愉悦刺激的反应因在 BLA 内的解剖位置不同而有所差异。总的来说，这些先前的研究以及我们目前的结果表明，杏仁核在对食物摄入的反应中，其细胞反应在空间分布和功能上均存在差异。

利用光遗传学技术，我们发现光遗传学激活胆碱能背侧脑桥（DBB）至杏仁核基底外侧核（BLA）的投射可调节食欲抑制。值得注意的是，这些观察结果并未受到运动或焦虑变化的影响，这一点通过高架十字迷宫（EPM）和开放场实验（OFA）得到了证实。在对 DBB 细胞体进行光遗传学刺激期间，向 BLA 内灌注乙酰胆碱受体拮抗剂表明，BLA 对 DBB 激活所导致的食欲抑制是必需的。有趣的是，我们的电生理学研究结果表明，胆碱能 DBB 输入对 BLA 具有双向调节作用，而我们的光纤光度测定数据则显示，在进食开始时，乙酰胆碱释放增加与后 BLA 活动增强相关。尽管由于乙酰胆碱受体表达的差异，乙酰胆碱可能对 BLA 活动具有细胞类型特异性影响，但由于大多数 DBB→BLA 突触似乎通过烟碱型受体传递信号，因此进食时 BLA 会受到净兴奋作用，从而导致 BLA 神经元活动增加，这一点通过使用光纤光度测定的群体钙成像得到了证实。因此，通过光遗传学激活 DBB→BLA 神经末梢来人为地促使 BLA 中乙酰胆碱释放，也可能通过烟碱样作用来诱导强烈的食欲抑制。或许在进食开始时，乙酰胆碱会以一种预期性稳态的形式释放，以防止过度进食。这可以解释在我们的光纤光度测量记录中，进食期间 BLA 内乙酰胆碱释放量增加以及随后 BLA 激活的情况。因此，激活 DBB→BLA 神经元可能会模拟这种状态，在饥饿动物中抑制进食行为。

总之，我们发现了一种此前未知的神经回路机制，即来自背侧被盖区（DBB）到基底外侧杏仁核（BLA）的乙酰胆碱（ACh）释放会抑制进食行为。基底外侧杏仁核的亚区是否选择性地表达不同的胆碱能受体亚型，以及这些细胞群在摄食和内稳态中是否发挥不同的功能作用，仍有待确定。此外，在这些特定细胞群中进行功能缺失研究，可能会揭示基底外侧杏仁核在调节摄食方面的必要性。DBB→BLA 胆碱能信号传导为研究其在感觉处理和进食等动机行为中的作用提供了一个合理的候选脑回路，值得进一步探究。

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