体内神经活动的钙成像对于理解神经系统的机制和功能是一种不可或缺的方法。先进成像工具的开发以及各种基因编码的钙指示剂使我们能够同时记录不同神经群体的活动。在此，我们介绍一种使用双色光纤光度法获取小鼠中两个离散神经群体神经活动的实验方案。我们描述了通过立体定向手术注射病毒构建体和植入光纤、钙信号采集以及数据分析的步骤。我们还描述了将脑电图和肌电图记录与双色光纤光度法分析相结合的方法。

东莞富临医疗科技有限公司是 Doric Lenses 中国代理商，为中国客户供应 Doric Lenses 光电生理产品与实验室从0到1搭建。

一、介绍

理解慢波睡眠（SWS）唤醒的潜在机制对于揭示动物睡眠与感觉反应之间复杂的相互作用至关重要。传统上，丘脑以向皮层传递感觉信息而闻名，在慢波睡眠期间其功能会降低。然而，动物能够响应外部感觉刺激迅速从慢波睡眠过渡到清醒状态，这暗示着存在控制这种现象的专门神经回路。下面描述的方案侧重于同时记录丘脑内侧背核中 GRIK4 细胞的神经元活动及其来自中脑区域 CaMK2 细胞的输入。为方便起见，我们将来自中脑的 CaMK2 细胞称为 A 细胞类型，将丘脑内侧背核中的 GRIK4 细胞称为 B 细胞类型。然而，该方案也可适用于可视化同一脑区中两种不同细胞类型的钙瞬变。所有实验均使用野生型 C57BL/6J 系雄性小鼠或 GRIK4-cre 转基因雄性小鼠。在病毒注射步骤开始时，年龄范围为 6 至 8 周。动物在 12 小时光照/黑暗周期（上午 8 点至晚上 8 点开灯）中饲养，自由获取食物和水。在后期确认钙活动之前，小鼠群养（每笼 4 - 5 只小鼠）。

二、准备

01.制备含 GECI 的病毒载体

时间：手术开始前 1 小时

准备一篮冰块、PBS 溶液和病毒分装液。

将病毒管从冷冻室（-80°C）取出，放入装有冰块的篮子中，带到操作现场。等待病毒溶液完全解冻。

如有必要，用 PBS 溶液将病毒溶液稀释至所需滴度。通常，每毫升约 10^12 个病毒颗粒是实现病毒表达的最佳浓度。这种病毒溶液将靶向细胞 B 类群并表达钙水平指示剂。

将两种病毒按 1:1 的比例混合。病毒溶液将靶向细胞类型 A 群体并表达特定钙指示剂。

关键：清晰标记两种病毒溶液以避免混淆。

关键：首次使用某种病毒时，建议稀释原始溶液以测试最佳浓度（不同病毒株和脑区可能表达模式不同，需选择最佳滴度）。

注意：两种 CRE 系统不保证转基因的特异性表达。从同一脑区记录两种细胞活动时，需确认基因无共表达。

02.准备手术工具和立体定位装置

时间：手术开始前一天

收集所有必需工具（剪刀、镊子、注射器、针头）并进行高压灭菌。灭菌工具可避免术后感染。在病毒注射和光纤套管植入前均需灭菌。

布置立体定位手术台（图 1A）。

关键：光纤套管植入后炎症可能导致套管脱落。

图 1. 注射（A）立体定位手术的设置和所需工具。（B）头部固定在立体定位框架中的麻醉小鼠。（C）头-尾方向切开以接近颅骨表面。（D）清洁颅骨表面。（E）确定前囟点。（F）确定人字点。（G）颅骨表面左侧。（H）颅骨表面右侧。（I）在丘脑 MD 上方的颅骨表面做标记。（J）在丘脑 MD 上方钻孔。（K）在 MN 上方的颅骨表面做标记。（L）在第二个目标脑区 MN 上方钻孔。

三、逐步方法详情

01.含病毒注射的 GECI

时间：每只小鼠 2 小时

在丘脑 MD 区域注射针对细胞类型 B（GRIK4 细胞）的基因编码钙指示剂，在中脑区域注射针对细胞类型 A（CaMK2 细胞）的基因编码钙指示剂。

用异氟烷麻醉小鼠：a. 将小鼠置于异氟烷浓度为 3% 的麻醉舱内 3-5 分钟，直至完全麻醉。

注意：若小鼠尾部受夹无反应，则表明其已完全麻醉。

固定小鼠头部：a. 用软膏覆盖眼睛以防止干燥。

注意：通过左右轻拉尾巴确认头部是否固定。

关键：手术全程保持异氟烷浓度在 1.0-1.5%。

准备颅骨表面：去除头顶毛发并消毒，沿头尾方向切开皮肤（约 1 厘米），暴露颅骨（图 1C）。

清洁颅骨：用棉签彻底清除结缔组织，使颅缝清晰可见（图 1D）。

注意：可用乙醇辅助清洁（挥发后颅缝更明显）。

安装注射器：将注射器固定于支架。

操作控制软件：打开软件以控制电动立体定位框架并进行手术操作。a. 定位前囟点并校准（图 1E）。关键：缓慢降低针尖，避免弯曲（建议步长 50 μm）。

平衡颅骨表面：a. 调整后囟点坐标，确保与前囟点的左右偏差 ≤ 0.1 mm（图 1F）。

注意：颅骨倾斜会导致深层脑区定位偏差。

校准左右平衡：a. 确认两侧颅骨表面高度差 ≤ 0.05 mm（图 1G、1H）。

输入目标坐标：设定丘脑 MD 区坐标（AP: -1.50 mm, ML: +0.35 mm, DV: -0.5 mm），标记目标区域（图 1I）。

钻孔操作：轻柔旋转钻头至穿透颅骨（图 1J）。

设定 MN 区坐标：输入 MN 区坐标（AP: -4.44 mm, ML: +1.16 mm, DV: -0.5 mm），标记颅骨表面（图 1K）。

清理骨屑：钻孔后清除骨屑（图 1L）。

检查针头状态：测试 PBS 溶液释放（100 nL 和 50 nL 液滴应完整）。

注意：液滴异常可能提示针头堵塞或损坏。

加载病毒溶液：将病毒溶液装入注射器，针尖定位至丘脑 MD 区钻孔中心（总注射量 300 nL）。

注意：装载量需略高于计划注射量。

启动注射程序：选择预置序列文件并启动注射流程

注意：检查针头是否正确/垂直注射。

注意：用户可根据实验目的修改序列文件（.txt 文件）。序列将自动将针头垂直移动到目标脑区。针尖最终 DV 位置为 3.37 毫米。

关键：病毒注射速率设置为每分钟 10-40 纳升以实现最佳扩散（适用于步骤 19）。

注意：注射序列文件包含针头坐标、时间及注射量。针尖每次下降 0.2-0.3 毫米并停留 20 秒，以减少脑组织损伤。

关键：标记注射器液面以确认病毒注入脑内。若出血则暂停操作并清除血液（参见“问题 1”）。

注射完成后保持注射器原位 10 分钟，缓慢拔出。

更换新注射器并重新校准系统。：a. 将针尖移至前囟点并设为基准坐标。

注意：旧注射器需用 70% 乙醇冲洗并超声清洗。

将细胞类型 A 的病毒溶液装入注射器。：a. 针尖定位至钻孔中心上方（AP: -4.44 mm, ML: +1.16 mm, DV: 0 mm），启动注射程序。

注意：装载量需略多于计划体积。针尖最终 DV 为 3.62 mm，总注射量 250 nL。

关键：再次标记液面以确认病毒释放。

注射后等待 10 分钟再拔出注射器：b. 用 70% 酒精冲洗并超声处理针头。

注意：病毒外流可能导致表达量降低（问题 5）。

缝合皮肤并消毒伤口。将小鼠置于单笼并用红外光保温。

02.光纤插芯植入

时间：每只小鼠 1 小时

植入光纤插芯以记录双色信号。可根据实验需求选择不同规格的插芯。

固定小鼠头部。a. 用软膏覆盖眼睛以防干燥。

注意：轻拉尾部确认头部固定。

剃毛消毒后切开顶部皮肤（约 1 cm 直径，图 2A）。

图 2. 植入（A）麻醉后固定头部并去除皮肤的小鼠。（B）清洁后颅骨表面。（C）插入螺钉以固定连接。（D）套管固定器后视图。（E）套管尖端置于目标脑区上方。（F）套管到达目标区域。（G）牙科粘合剂固定套管。（H）二次粘合固定装置。（I）移除固定器后的固化粘合剂。

清洁颅骨至结缔组织清除（图 2B）。划痕后植入锚定螺钉（距目标区约 1 cm，图 2C）。

关键：避免穿透颅骨，确保清洁表面（参见问题 2）。

安装注射器支架。

操作软件校准前囟与后囟坐标（步骤 6-8）。

定位丘脑 MD 区（AP: -1.50 mm, ML: +0.35 mm, DV: -0.5 mm）。

钻孔后清洁暴露脑表面，孔径略大于套管直径。

替换为光纤插芯支架并定位（图 2D-2E）。

启动序列至目标坐标（AP: -1.50 mm, ML: +0.35 mm, DV: -3.33 mm）。

关键：出血时暂停并清理。

混合牙科粘合剂（粉末 0.15 mL + 单体 4 滴 + 催化剂 1 滴），覆盖植入区域并固化（图 2G）。

覆盖自凝粘结剂并干燥（图 2H）。

移除固定器（图 2I）。

术后单笼饲养，红外保温（问题 2 处理脱落）。

术后恢复，休息 2 周，口服对乙酰氨基酚（300 mg/kg）镇痛抗炎。

体内数据采集：

组装光纤光度系统（图 3B），使用 465 nm（GCaMP6m）和 560 nm（jRCaMP1a）双通道检测（Doric Lenses）。

关键：记录前光漂白 1 小时降噪。

设置光强 20-75 μW。

连接光纤并记录基线活动。

行为测试中监测运动伪迹（问题 3）。

使用锁相模式记录信号，参考频率避让 60 Hz 谐波，截止频率 12 Hz。

带通滤波（0.1-100 Hz），采样率 ≥40 Hz。

图 3. 利用双色光纤光度法记录两个独立的神经元群体（A）双光度测定记录示意图。（B）双色光度测定系统方案。

03.组织学

时间：2 天

确认探针位置及病毒表达后，方可进行数据分析。

深度麻醉小鼠（5% 异氟烷），处死并断头。取出大脑。

将大脑置于 4% 多聚甲醛溶液中（4°C，24-48 小时）。

用振动切片机切取脑片，收集 MD 和 MN 区域样本。

使用荧光显微镜或共聚焦显微镜对脑组织成像。

确认钙指示剂表达位置及光纤探针植入位置。若表达不足，参考“问题 5”解决。

04.预期结果

本方案通过双色光纤光度法同步检测两类细胞的钙瞬变，拓展了单色技术的应用范围。如图 4 所示，听觉刺激（11 kHz, 1 s, 100 dB）可唤醒慢波睡眠小鼠，并伴随 MD GRIK4 神经元（B 类）和 MN CamKIIα-MD 终端（A 类）的钙活性升高。

图 4. 来自 MD 中 CaMKII 神经元和 MN 神经元突触末梢的双色光纤光度记录的预处理与分析（A）数据预处理流程。（B）原始信号轨迹示例（低通滤波、降采样、移动平均去趋势）。（C）ΔF/F 转换及平滑结果。（D）预处理信号与行为起始标记（紫色竖线）。（E）基于累积和阈值的行为相关信号上升点检测。

定量和统计分析：加载数据至程序并导出 CSV 文件（含时间、GCaMP6m、jRCaMP1a 三列）。

应用 40 Hz 低通滤波器降噪。

降采样至 300 Hz 以优化数据处理。

通过 1 分钟滑动窗口计算 ΔF/F，校正光漂白基线漂移（图 4A-4B）。

使用 Savitzky-Golay 滤波器（1 秒窗口）平滑数据（图 4C）。

对对照信号（GFP/tdTomato）重复上述步骤。

脑电与肌电信号整合分析：在慢波睡眠期间施加听觉刺激（11 kHz, 1 s, 100 dB），同步记录多模态信号。标记刺激时间点与睡眠状态。

关键：慢波睡眠（SWS）特征为高幅低频 EEG 与低 EMG；清醒状态为低幅 EEG 与高 EMG。

提取事件前后 10 秒的光纤信号（图 4D）。

对齐基线（-10 s ~ 0 s 均值归零）。

通过累积和算法计算信号上升潜伏期（阈值：5 倍标准差，图 4E）。

05.局限性

轴突末梢信号易受低荧光强度干扰，建议采用强弱指示剂分级表达策略。

移动平均法适用于短期大幅变化检测，对长期缓慢变化敏感度不足。

未使用等吸收通道（如 405 nm）校正运动伪影，但可通过多通道同步变化识别伪影。

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