强烈推荐血细胞形态学专家王霄霞教授的文章：外周血涂片的染色方法及染色结果的判断

瑞氏染色法使细胞着色既有化学亲合作用，又有物理吸附作用。各种细胞由于其所含化学成分不同，对染料的亲合力也不一样，因此，染色后各种细胞呈现出各自的染色特点。如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质。细胞核蛋白、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞胞质为酸性，与碱性染料亚甲蓝或天青结合，染紫蓝色或蓝色，称为嗜碱性物质。中性颗粒呈等电状态与伊红和亚甲蓝均可结合，染淡紫红色，称为嗜中性物质。原始红细胞、早幼红细胞胞质、核仁含较多酸性物质，染成较浓厚的蓝色；中幼红细胞既含酸性物质，又含碱性物质，染成红蓝色或灰红色，完全成熟红细胞，酸性物质彻底消失后，染成粉红色。

瑞氏染料由酸性染料伊红（E）和碱性染料亚甲蓝（M）组成。伊红通常为钠盐，有色部分为阴离子。亚甲蓝(又名美蓝)为四甲基硫革染料，有对醒型和邻醒型两种结构。通常为氯盐，即氯化亚甲蓝，有色部分为阳离子。亚甲蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料（即天青）。将适量伊红、亚甲蓝溶解在甲醇中，即为瑞氏染料。甲醇的作用：一是溶解亚甲蓝和伊红，二是固定细胞形态。

1.瑞氏染液

(1)瑞氏染料：0.1g

(2)甲醇(AR)：60.0ml

瑞氏染料由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成。将瑞氏染料放人清洁干燥研钵里，先加少量甲醇，充分研磨使染料溶解，将已溶解的染料倒人棕色试剂瓶中，未溶解的再加少量甲醇研磨，直至染料完全溶解，甲醉全部用完为止，即为瑞氏染液。配好后放室温，周后即可使用。新配染液效果较差，放置时间越长，染色效果越好。久置应密封，以免甲醉挥发或氧化成甲酸。染液中也可加中性甘油2-3ml，除可防止甲醇过早挥发外，也可使细胞着色清晰。

2. pH6.8磷酸盐缓冲液

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)：0.3g

磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)：0.2g

加少量蒸馏水溶解，再用蒸馏水加至100ml。

1.采血后推制厚薄适宜的血涂片。

2.用蜡笔在血膜两头画线，然后将血涂片平放在染色架上。

3.加瑞氏染液数滴，以覆盖整个血膜为宜，染色约1分钟。

4.滴加约等量的缓冲液与染液混合，室温下染色5~10分钟。

5.用流水冲去染液，待干燥后镜检。

1. pH对细胞染色有影响。由于细胞各种成分均由蛋白质构成，蛋白质均为两性电解质，所带电荷随溶液pH而定。对某一蛋白质而言，如环境pH <pl（pl为该蛋白质的等电点），则该蛋白质带正电荷，即在酸性环境中正电荷增多，易与酸性伊红结合，染色偏红；相反，则易与亚甲蓝结合，染色偏蓝。因细胞着色对氢离子浓度十分敏感，为此，应使用清洁中性的载玻片，稀释染液必须用pH 6.8缓冲液，冲洗片子必须用中性水。

2.未干透的血膜不能染色，否则染色时血膜易脱落。

3.染色时间的长短与染液浓度、染色时温度及血细胞多少有关。染色时间与染液浓度、染色时温度成反比；染色时间与细胞数量成正比。

4.冲洗时不能先倒掉染液，应用流水冲去，以防染料沉淀在血膜上。

5.如血膜上有染料颗粒沉积，可用甲醇溶解，但需立即用水冲掉甲醇，以免脱色。

6.染色过淡，可以复染。复染时应先加缓冲液，创造良好的染色环境，而后加染液，或加染液与缓冲液的混合液，不可先加染液。

7.染色过深可用水冲洗或浸泡水中一定时间，也可用甲醇脱色。

8.染色偏酸或偏碱时，均应更换缓冲液再重染。

9.瑞氏染液的质量好坏除用血涂片实际染色效 果评价外，还可采用吸光度比值(raio of absoption, RA)评价。瑞氏染液的成熟指数以RA =1.3±0.1为宜。

参考文献：尚红, 王毓三, 申子瑜. 全国临床检验操作规程（第4版）[M]. 北京:人民卫生出版社.

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学习卡片 | 血涂片染色不佳的原因及纠正措施