在探索基于行为任务的大规模脑功能时，清醒啮齿动物功能性磁共振成像正成为一种前景广阔的无创脑成像模块。以往的研究通常在扫描过程中使用镇静剂或预先使用麻醉剂（如异氟烷）来减少动物的运动，但这可能干扰啮齿类动物“清醒”状态下的真实脑功能。本研究建立了一套无需初始麻醉的、经过长期训练的清醒小鼠功能性磁共振成像-瞳孔测量范式/装置。为验证该清醒小鼠功能性磁共振成像平台，研究人员通过诱发血氧水平依赖性功能磁共振成像信号，成功识别了视觉皮层、背外侧膝状体核和上丘的脑区激活。此外，研究还检测了扫描过程中的瞳孔信号波动，结果显示经过5至8周的间歇性训练后，小鼠瞳孔扩张程度有所降低。因此，结合实时瞳孔测量的清醒小鼠功能性磁共振成像技术，为研究完全清醒状态的小鼠提供了一种纵向功能成像工具。

一、介绍

自20世纪90年代末以来，动物模型已开始应用于清醒状态下的功能性磁共振成像研究。在过去的二十年中，多种生物技术（如光遗传学、转基因技术、药理调控等）已与清醒动物功能性磁共振成像相结合，用于功能与行为研究。然而，由于扫描过程中未监测的应激水平及运动相关的图像伪影，解读清醒状态下获取的功能性磁共振成像信号仍存在挑战。为减少这些干扰效应，研究者们引入了多种适应训练方案和运动约束装置。特别是在实现更优的磁共振匀场效果并将动物安全固定于扫描设备的过程中，许多成像方案仍采用短时预扫描麻醉或镇静处理。我们在补充材料表1中汇总了自2000年以来的小动物清醒功能性磁共振成像研究。尽管动物体内麻醉剂可在等待期后从循环系统中清除，但其对神经血管耦合产生的长期全局性影响尚未完全明确。因此，建立无麻醉的清醒动物功能性磁共振成像平台仍需进一步优化。

随着清醒动物功能性磁共振成像研究的不断深入，定制化的约束装置及纵向训练流程已被设计出来，以规避动物应激和运动伪影等干扰因素。传统训练方案的时长从初期的10分钟逐步延长至后续阶段的60-90分钟，持续周期为7-10天（见补充材料表1）。除心率和呼吸频率监测外，先前研究曾通过测量血浆皮质酮来评估训练期间的应激水平，但实时扫描诱发的抑制状态或无助感尚未得到充分探究。目前学界已明确，最大限度地减轻扫描过程中清醒啮齿动物的应激效应是开展功能与行为研究的关键环节。

既往清醒啮齿动物功能性磁共振成像研究展示了转基因小鼠模型独特的功能成像能力。例如，有研究通过功能性磁共振成像绘制自闭症疾病模型小鼠的脑功能图谱，识别白质异常并根据行为学结果评估药物治疗效果。另有研究将光遗传学功能磁共振成像应用于不同转基因小鼠品系，以探索星形胶质细胞的动态特征。值得注意的是，瞳孔测量作为一种能反映唤醒水平变化、警觉状态、情绪波动及皮层状态的无创指标，已在人类与动物的功能性磁共振成像研究中得到应用。特别重要的是，多项研究已证实鱼类和人类的瞳孔尺寸与应激反应存在关联，同时瞳孔变化也与认知注意需求相关。目前仍需建立同步测量清醒小鼠功能性磁共振成像信号与瞳孔动力学的技术平台，以进一步解读不同瞳孔动态谱背后的大脑全局功能基础。

本研究旨在建立一个功能性磁共振成像-瞳孔测量平台，用于探索清醒小鼠的脑功能。我们设计了为期8周的间歇性训练方案，使头部固定的小鼠在实验台和磁体腔内逐步适应，从而实现纵向脑功能成像。为验证该清醒小鼠功能性磁共振成像平台，研究人员通过视觉刺激绘制了视觉系统的诱发血氧水平依赖信号响应图谱，证明了在扫描过程中同步实施清醒小鼠功能性磁共振成像与瞳孔测量的可行性。

二、材料与方法

01.实验动物

本研究所有实验程序均获得国家主管机构批准并遵循相关指导原则开展。实验采用九只雄性C57BL/6小鼠，其中两只因训练期间头座损坏被排除。动物自10-15周龄开始，在12小时明暗循环条件下单独适应性饲养，自由获取食物饮水。

02.行为适应与训练

研究采用3D打印头座及定制训练箱对动物进行适应性训练。简言之，在功能性磁共振成像实验前对动物实施为期5-8周的间歇性习惯化训练。训练流程包括：使小鼠在训练箱内保持舒适自然姿态；通过头座将小鼠固定在训练箱中；让小鼠接触14.1T扫描仪孔洞内的扫描噪音；记录瞳孔动态的缓慢波动；持续训练直至成像或训练期间基本无排泄行为。仅表现良好的小鼠可进入下一阶段成像。

小鼠首先在实验者戴手套的手中进行约每次5分钟的操作训练，直至出现理毛行为。随后通过头座固定于训练箱。训练时长从每日10-15分钟逐步增加至60分钟，训练间隔安排1-2天休息。训练时间递增方案为：初始阶段每周10-15分钟，后续每2-3周延长至20-30分钟，3-4周延长至30-40分钟，4-5周延长至40-50分钟，5-8周延长至50-60分钟。通过监测小鼠体态与运动评估训练效果。采用红外摄像头持续记录瞳孔动态。术后一周，小鼠先在扫描仪内无头座固定的训练箱适应约2周，随后在扫描序列运行状态下通过头座固定于磁共振扫描仪内。每阶段训练间隔休息1-2天，实际磁共振成像实验前持续训练至少5周。训练间隔期多次给予蔗糖水补充。最后一次训练结束后，动物在14.1T磁共振扫描仪中接受24小时成像。

03.头座植入手术

小鼠采用异氟烷麻醉，通过足趾或耳部夹捏反射消失确认麻醉深度。采用温控加热垫维持体温。眼部涂抹眼膏防止干燥。随后通过耳杆和齿杆将小鼠固定于立体定位仪，剃毛消毒后暴露颅骨，仔细清除软组织并使用37.5%磷酸凝胶处理15秒。根据制造商建议预处理颅骨表面，使用牙科水泥将头座固定于颅骨上方。剩余切口区域缝合消毒，术后立即给予镇痛药和抗生素。动物在加热毯上恢复15-30分钟后放回原笼。术后连续观察至少5天，第一周每日监测伤口愈合情况。

04.视觉刺激范式与瞳孔直径记录

为研究清醒小鼠视觉刺激下的血氧水平依赖响应，采用定制LED矩阵系统进行视觉刺激，该系统由平面回波成像序列触发并通过Master 9系统控制。每个成像序列采用4秒开启-16秒关闭的组块设计，共10个周期。系统内同时控制光照亮度与闪烁频率。为监测胸廓运动，在动物腹部下方放置压力传感器，其运动效应通过生理信号采集系统检测。

采用定制铜屏蔽磁共振兼容摄像头监测头部运动并采集瞳孔测量视频。摄像头固定于自制可调节支架上。在小鼠眼睛旁放置可移动红外LED灯用于瞳孔记录。

05.磁共振成像

磁共振成像采用布鲁克Avance III系统进行，该系统配备14.1特斯拉超导磁体及直径12厘米的梯度线圈，可提供100高斯/厘米的梯度场强和150微秒的上升时间。成像使用覆盖小鼠全脑的定制表面收发线圈。功能扫描采用二维平面回波成像序列，具体参数为：重复时间1秒，回波时间8毫秒，视野12×12毫米，采集矩阵40×40，24层，分辨率0.3×0.3×0.5立方毫米，总采集时间210个重复时间周期。解剖图像采用与功能扫描相同几何参数的快速弛豫增强序列获取，具体参数为：重复时间2.5秒，回波时间7毫秒，视野12×12毫米，采集矩阵96×96，24层，平面分辨率0.125平方毫米，层厚0.5毫米，快速弛豫增强因子6，重复采集4次。磁场均匀性通过快速映射扫描进行校正，使用训练良好的小鼠进行匀场调整，并将其作为其他小鼠成像的参考基准。多阶匀场与定位调整耗时约17分钟。

06.数据分析

所有功能磁共振成像数据均使用功能神经影像分析软件包进行处理。预处理步骤包括：运动校正；与解剖图像的空间配准；基于脑掩模的分割处理；采用0.2毫米全宽半高高斯核的空间平滑；图像标准化；以及基于体素的线性回归分析计算血氧水平依赖统计图谱。最后一步采用血流动力学响应函数模型，该模型将持续时间参数与峰幅参数进行卷积处理，通常将基函数幅值设定为1。

功能图谱中的激活感兴趣区经提取后进行基线漂移校正。平面回波成像图像的基线信号标准化为100，以备后续多试次统计分析。为表征信号变化，使用定制MATLAB脚本对各试次的血氧水平依赖信号时间序列进行平均，并基于刺激前6个重复时间周期的信号强度转换为百分比变化。解剖磁共振图像通过三维配准功能向跨动物模板进行空间标准化，以供后续图像处理。

瞳孔数据预处理方面，所有瞳孔测量视频均通过DeepLabCut工具箱进行裁剪处理。本项目构建了小鼠瞳孔分析网络以从各视频中提取瞳孔尺寸数据。该网络基于来自5只小鼠的27段视频共计5670帧图像训练生成。通过该专用网络，利用四个边界标记点的追踪坐标计算瞳孔直径。

静息状态瞳孔数据被采集并用于统计分析，以监测生理状态。采用单因素方差分析方法评估小鼠在训练第1周、第5周和第8周的瞳孔数据。

三、结果

01.功能性磁共振成像-瞳孔测量训练范式与平台的建立

功能性磁共振成像-瞳孔测量平台及清醒小鼠训练方案的示意图见图1A。与以往基于“模拟扫描仪”的约束系统不同，本研究中动物被固定于自主设计的约束系统内，直接暴露于真实扫描仪噪音中。整个训练与成像阶段均未使用任何麻醉剂。经过5-8周训练后，小鼠已适应约束系统，与短期训练的动物相比，即使未进行头部固定也倾向于保持“成像姿态”。训练周期较长的小鼠胸廓运动明显减弱，这为功能性磁共振成像过程中训练有素的小鼠提供了量化评估指标。

图1：未使用初始麻醉的啮齿动物长期训练清醒功能磁共振成像-瞳孔测量范式与装置。（A）间歇性约束训练方案示意图。（B）视觉刺激范式与同步功能磁共振成像瞳孔记录示意图。（C）全脑功能磁共振成像模式设计图。

采用铜屏蔽红外摄像头记录瞳孔直径，并通过蓝色LED灯矩阵提供视觉刺激。在成像过程中施加闪烁光刺激。分别在诱发状态和静息状态下采集全脑功能磁共振成像数据集。

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02.头部运动评估

对不同训练阶段后小鼠的头部运动进行了计算与比较。基于不同训练阶段获取的三维功能磁共振成像数据集的配准过程，研究人员处理了六个运动参数。从六只小鼠收集了旋转与平移运动的时间进程。训练第1周、第5周和第8周对应的平均平移与旋转位移时间进程如图所示。各运动参数在不同试次间的方差被提取并比较。补充图4展示了不同训练周期后间歇适应期间逐帧位移的估算结果。随着训练方案的推进，小鼠在所有平面上的头部运动均呈现减少趋势。

图2：不同训练周期间歇适应期间的运动参数评估。（A）不同训练周期后平移位移的平均时间进程与旋转角度变化。（B）平移与旋转时间进程的方差分析。

03.静息状态清醒小鼠功能磁共振成像的实时瞳孔动态

在等亮度条件下，记录了小鼠在不同训练阶段暴露于扫描仪噪音时的瞳孔动态变化。图3展示了训练第1周、第5周和第8周原始瞳孔数据的统计比较结果。这些数据表明，动物瞳孔在训练初期呈现扩张状态，随后在训练后期逐渐缩小，提示小鼠在功能磁共振成像过程中进入更为放松的状态。同时，静息状态瞳孔动态随时间的变化趋势以及光暴露诱导的瞳孔收缩反应均被记录，这证实了结合实时瞳孔测量的清醒小鼠功能磁共振成像技术的可行性。

图3：不同训练周期后静息状态瞳孔动态的统计分析。箱线图展示了瞳孔直径的变化情况。

为验证清醒小鼠功能磁共振成像-瞳孔测量平台的可靠性，研究在视觉刺激条件下采集了血氧水平依赖功能磁共振成像信号。视觉通路上的三个主要脑区均显示出显著的血氧水平依赖激活：视觉皮层、上丘以及背外侧膝状体核。从不同动物采集的三个脑区血氧水平依赖信号变化平均时间进程显示，最大信号变化幅度分别为0.72%、2.5%和0.5%。代表性的原始快速弛豫增强序列图像与平面回波成像图像见补充图5。与既往功能磁共振成像研究结果一致，这些响应在不同小鼠间具有可重现性。

图4：视觉刺激下的血氧水平依赖响应。（A）叠加在解剖图像上的代表性彩色编码血氧水平依赖功能磁共振成像图谱，显示视觉通路相关区域内背外侧膝状体核、上丘和视觉皮层的激活情况。（B）视觉刺激下视觉通路相关区域平均血氧水平依赖信号百分比变化，左侧为所有动物的单个试次信号变化，右侧为平均血氧水平依赖信号变化。

四、讨论

本研究开发了一套用于同步功能磁共振成像-瞳孔测量的间歇性清醒小鼠训练方案。该方案避免了麻醉剂或镇静剂预处理可能带来的干扰问题，能够结合实时瞳孔测量技术识别大规模脑动力学特征。我们通过视觉刺激验证了该清醒功能磁共振成像平台，成功展示了光照后视觉脑区的激活响应。

与既往清醒啮齿动物功能磁共振成像研究不同，我们系统比较了小鼠在8周训练周期内的瞳孔动态变化。值得注意的是，许多清醒啮齿动物功能磁共振成像研究在扫描前使用了麻醉剂，虽然低剂量吸入麻醉可在停药后快速代谢，但这种麻醉诱导的短暂制动便于动物在磁共振支架中定位及扫描前的匀场调整。然而，麻醉剂的残留效应可能成为潜在的干扰因素。本研究未使用任何麻醉剂，而是将训练周期从1周延长至8周，通过瞳孔直径测量证实了训练有素的小鼠对扫描噪音的耐受性。

瞳孔行为是表征脑状态和反映自主神经系统活动的可靠指标。前期研究表明，瞳孔扩张受交感神经系统调控，与记忆维持、心理努力、生理应激等多种认知操作相关。与训练早期阶段记录的显著瞳孔扩张相比，后期阶段瞳孔直径明显减小。值得注意的是，早期阶段动物间较大的变异可能由不同应激水平引起，但训练第8周时的瞳孔直径变异也显著降低。这种变异减小仅表明训练有素的动物间瞳孔尺寸更具可比性，但并未反映静息状态瞳孔变异性变化。未来研究需对静息期采集的功能磁共振成像与瞳孔动态数据进行相关性分析，以进一步阐明特定试次的瞳孔动态特征。同时，瞳孔尺寸也可作为小鼠睡眠状态的指示指标。结合实时瞳孔测量的功能磁共振成像技术为监测扫描期间小鼠警觉状态提供了有效平台。

为验证清醒小鼠功能磁共振成像-瞳孔测量平台，我们通过视觉刺激绘制了血氧水平依赖功能磁共振成像图谱。与已发表报告一致，激活图谱突显了多个视觉通路相关脑区。但值得注意的是，诱发血氧水平依赖响应强度明显低于使用氯醛糖麻醉动物检测到的响应。清醒小鼠的血氧水平依赖峰值信号变化与清醒人类研究结果更为一致。清醒与麻醉动物间的血氧水平依赖信号差异可能源于麻醉大脑自发性神经元活动受抑制，导致诱发神经元活动耦合的血流动力学响应更强。我们的视觉刺激观察结果与麻醉及清醒小鼠中表征的多个视觉通路相关脑区特征相符。

本研究将间歇训练方案延长至8周。我们观察到头部固定小鼠在训练初期接触扫描噪音时出现快速瞳孔变化，但在后续间歇性暴露中该现象消失。血清皮质酮作为应激水平的直接指标，可精确指导研究者调整分步训练方案，但由于小鼠循环血容量有限，重复采血仍存在困难。因此，唾液、尿液或粪便检测等替代方法可能是监测生理应激的可行方案。

对于清醒小鼠的视觉刺激，保持其眼睛固定注视视觉靶点仍具挑战性。相较于人类功能磁共振成像的眼动追踪系统，我们的实时瞳孔测量提供了替代方案，特别是在检测瞳孔收缩反应时。然而，闪烁视觉刺激仍需进一步优化以提升血氧水平依赖响应效果。此外，鉴于眼睛与摄像头间距离较近，未来行为学研究需更换更长焦距的镜头以构建更优化的视觉刺激范式。

在人类研究中，自闭症、注意缺陷多动障碍和阿尔茨海默病等病理状态与异常瞳孔动态存在关联。结合瞳孔测量与功能磁共振成像有助于深入理解小鼠模型中瞳孔尺寸与潜在神经元活动之间的联系。虽然人类研究也可开展此类工作，但结合实时瞳孔测量的小鼠功能磁共振成像在机制研究和治疗测试方面更具实践价值。

五、结论

综上所述，本研究报道了一种无需麻醉预处理的清醒小鼠功能磁共振成像训练方案，该方案集成了实时瞳孔监测技术。视觉刺激在视觉脑区诱发的血氧水平依赖功能图谱验证了此无药物干预的清醒小鼠功能磁共振成像平台的可靠性。

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