一、摘要

利用功能磁共振成像（fMRI）中的血氧信号以及光学成像来测量的自发超慢（<0.1Hz）脑活动的系统层面组织，已成为人类和动物模型神经功能研究的一个重要主题。然而，超慢活动（ISA）的神经生理基础仍未得到解决。特别是，ISA 是一个独特的生理过程，还是更快神经活动的低频类似物？在这里，通过对小鼠进行全脑皮层钙 / 血红蛋白成像，我们发现，在这些成像模式中，每种模式下的 ISA 都沿着特定的时空轨迹在皮层中传播，这些轨迹具有状态依赖性（清醒与麻醉状态），并且与 δ（1 - 4Hz）活动的轨迹不同。此外，小鼠层状电生理学研究表明，ISA 通过特定的皮层层次传播，并组织成独特的跨层时间动态，这与更高频率的局部场电位活动不同。这些发现表明，ISA 是一个独特的神经生理过程，并反映在 fMRI 血氧信号中。

二、引言

从人类静息态功能磁共振成像（rs - fMRI）到小鼠光学成像，对自发脑活动的成像揭示了在没有明确输入或输出情况下的长距离关系。自发低频活动的长距离组织最初被视为噪声或伪影而被忽视，如今却得到了广泛研究。血氧水平依赖（BOLD）信号中的自发超慢（<0.1Hz）波动尤其引人关注，因为它们在大型任务相关系统中具有相关性（，因为它们重现了超慢电生理学中的相关性，最后，还因为 BOLD 信号相关性（功能连接；FC）与多种神经精神疾病有关。

然而，尽管 rs - fMRI 作为研究脑功能的一种方法广受欢迎，但 BOLD 信号和超慢脑活动中自发模式背后的生物学机制却尚未得到很好的理解。一种主流观点认为，同步化是连接神经网络的固有属性；因此，高频神经活动自然倾向于在结构连接的大规模网络内实现同步。在这个模型中，超慢现象被视为快速、局部神经活动的广泛总和。特别是 BOLD 信号，被认为反映了对更高频率神经活动的血管低通滤波。然而，将自发 BOLD 信号组织建模为通过已知白质连接同步的低通滤波动作电位的模拟，与测量到的 BOLD 信号相关性仅能达到适度的一致。此外，一个简单的连接 - 同步模型无法轻易解释超慢功能组织中的显著状态变化，比如清醒与睡眠状态的差异。

作为一种替代观点，超慢活动（ISA）的大规模组织可能并非是更高频率活动的广泛总和，而是反映了一个具有自身功能和神经生理原理的独特脑过程）。支持这一观点的是，最近在人类和小鼠中的研究报告称，超慢 BOLD 信号沿着特定的时空轨迹在大脑皮层中缓慢传播。自发 BOLD 信号此前也与局部场电位（LFPs）中的 ISA 相关联。这些发现共同表明，可能存在一个独特的超慢脑过程，它在大脑中动态移动，以建立一种反映在 BOLD 信号中的系统层面的组织。然而，关键问题仍未得到解答。

首先，ISA（超慢活动）的神经生理学特性，特别是它在大脑皮层中的时空轨迹，是否与诸如δ（1 - 4Hz）活动等其他频率的活动有所不同？在神经生理学中，低于δ（或慢）活动的频率很少被研究；因此，为了证明ISA是一个独特的实体，有必要将它与δ活动区分开来。其次，BOLD（血氧水平依赖）信号中的时空轨迹是专门对应超慢神经活动，还是反映了更高频率的时空轨迹？第三，ISA的时间组织是否与行为相关，例如，它是否会随着广泛的行为状态变化而改变？最后，已知诸如γ（>40Hz）、α（8 - 12Hz）和δ等不同的频谱带会穿过大脑皮层的特定层：ISA是否也会穿过特定的大脑皮层层次呢？重要的是，这第四个问题引出了一种可能性，即静息态功能磁共振成像（rs - fMRI）的功能连接（FC）反映了迄今为止未被发现的层状特异性。我们通过对清醒和麻醉状态下的小鼠进行宽视野钙/血红蛋白（Hgb）光学成像和层状电生理学研究，直接测量和分析超慢和更高频率的自发神经活动的时空结构，来探究这些问题。预先说明一下，我们发现小鼠大脑皮层中的自发ISA沿着固定的时空轨迹传播，这些轨迹与更高频率的活动不同。

三、结果

01、功能连接（FC）在不同频率和状态下的稳定性

我们首先在 14 只由 Thy1 启动子控制表达 GCaMP6f 的转基因小鼠中，同时进行了宽视野钙成像和血红蛋白（Hgb）成像（图 1A 和图 S1）。成像在 “静息状态” 下进行：小鼠静止不动，悬挂在黑暗房间的吊床上，眼睛睁开，不施加任何实验条件（见 “实验方法” 部分）。对包括清醒状态（n = 14）、氯胺酮（ket）/ 甲苯噻嗪麻醉状态（n = 14）和右美托咪定（dex）麻醉状态（n = 7）等不同意识状态下的自发活动进行了成像。氯胺酮和右美托咪定通过不同机制诱导麻醉。

图 1. 小鼠皮层自发钙活动宽视野成像中的相关性与时间延迟(A) 使用四个高功率 LED，在 Thy1/GCaMP6 小鼠的背侧皮层表面同时进行钙荧光和血红蛋白（Hgb）吸收成像（见 “实验方法” 部分）。(B) 一个示例滞后相关曲线，由运动和视觉感兴趣区域（ROI）的两个超慢活动（ISA）时间序列计算得出。零滞后相关值定义为功能连接（FC）；对应峰值相关的时间定义为该 ROI 对的时间延迟（TD）。(C) 与（B）相同，但针对 δ 频段活动。有关更长时间尺度上交叉相关性的可视化，请见图 S1。(D) FC 矩阵，展示所有像素之间的相关性，分别针对 δ 和 ISA 频段，以及氯胺酮（ket）（n = 14）、右美托咪定（dex）（n = 7）麻醉状态和清醒状态（n = 14）。FC 矩阵按定义是对称的。矩阵的行和列是来自小鼠皮层背侧表面的单个像素，从前到后排列（关键信息见图 S1）。皮尔逊 r 值大于色条上星号标记的数值具有统计学意义（p < 0.005；见 “实验方法” 部分）。(E) TD 矩阵，代表每对像素之间的时间延迟，矩阵排列方式与（D）相同。TD 矩阵按定义是反对称的。无统计学意义的 TD（p > 0.005；见 “实验方法” 部分）显示为灰色。

由于钙成像的动力学可测量高达约 5Hz 的神经活动，我们使用功能连接（FC）和时间延迟（TD），将分析重点放在超慢（0.02 - 0.1Hz）和 δ（1 - 4Hz）活动上（图 1B 和 1C）。这两个指标均由时间序列对之间的滞后相关性得出（见 “实验方法” 部分）。FC 是零滞后相关性，TD 是对应峰值相关的时间偏移。时间偏移测量区域之间的先后关系，使我们能够检测自发活动中的时空轨迹。图 1D 和 1E 中的矩阵（维度为像素 × 像素）展示了所有皮层钙时间序列对之间的 FC 和 TD。图 1D 中的 FC 矩阵表明，自发活动的相关结构在一系列频率（ISA 与 δ）和不同意识状态（清醒与 ket/dex 麻醉）下是稳定的。

02、ISA 和 δ 频段中不同的时空轨迹

接下来，我们分析 TD 矩阵（图 1E），以探究超慢和 δ 频段钙活动之间的时空轨迹是否存在差异。每个 TD 矩阵中的蓝色和红色模式分别表示时间上较早和较晚的像素。ISA 和 δ 频段之间，以及麻醉（ket/dex）和清醒状态之间的 TD 矩阵存在显著差异（p <0.001；见 “实验方法” 部分）。相比之下，对于 ISA 和 δ 活动，ket 和 dex 麻醉状态下的 TD 矩阵高度相似（无统计学差异）。因此，ISA 和 δ 频段之间以及清醒与麻醉状态之间的时空轨迹存在显著差异。时间尺度也有所不同，ISA 的时间尺度范围为 ±0.5 秒，而 δ 活动的时间尺度范围为 ±10 毫秒。GCaMP6 的 TD 矩阵在不同实验时段和小鼠之间具有高度重复性；可靠性的完整分析见图 S2。

为了进一步理解自发活动中的时空轨迹，我们计算了滞后投影（图2A中的图像1 - 6），它是TD矩阵（图1E中的图像1 - 6）的行均值。滞后投影描述了平均而言，每个像素相较于皮层其他部分是时间上较早（蓝色）还是较晚（红色）。因此，图2A的图像1表明，在氯胺酮麻醉下，平均而言，前部的δ活动比后部的δ活动领先约100毫秒，这与先前关于麻醉和睡眠状态下δ活动从前向后传播的报告一致。相比之下，后部的ISA比前部的ISA领先约0.5秒（图2A中的图像2）。右美托咪定麻醉（图2A中的图像3和4）产生了高度相似的结果。在清醒状态下，δ和ISA分别呈现从后向前和从前向后的时空轨迹，且时间尺度也非常不同（图2A中的图像3和4）。总之，图2A表明，通过GCaMP6荧光测量的自发ISA和δ活动以不同速度沿不同轨迹传播。此外，ISA和δ活动在清醒与麻醉状态下的传播方向也有所变化。

图 2. 自发时空轨迹在不同频率和意识状态下存在系统性差异(A) GCaMP6（钙）滞后投影图，展示每个像素与皮层其他部分之间的平均延迟。在清醒和麻醉状态下，超慢活动和 δ 活动的移动方向和速度均不同。(B) 总血红蛋白（Total Hgb）滞后图，绘制方式与 (A) 相同，时间尺度匹配。(C) GCaMP6 活动的格兰杰因果分析。通过在 (A1 - A4) 面板中确定最大延迟区域，定义了视觉皮层和运动皮层中的两个感兴趣区域（ROI）；坐标见 “实验方法” 部分。(D) 对 (C) 中两个 ROI 在清醒状态（粉色）和氯胺酮麻醉状态（绿色）下进行频率与相位分析。对右美托咪定麻醉的分析得出了非常相似的结果（图 S3）。误差条表示基于多只小鼠计算得出的 95% 置信区间。

03、血氧信号中的时空轨迹重现了 ISA，但非 δ 活动

为探究血氧水平依赖（BOLD）活动与超慢及 δ 频段钙活动的对比情况，我们用血红蛋白（Hgb）信号重复了图 2A 中的分析（图 2B）。总血红蛋白和钙（GCaMP6）的超慢活动（ISA）滞后投影高度相似（图 2A 和 2B 中的图像 2、4 和 6），这与先前关于超慢神经活动与血液动力学信号对应关系的报告相符。然而，δ 频段的总血红蛋白滞后投影与 δ 频段钙信号不匹配（图 2A 和 2B 中的图像 1、3 和 5），且不具有可重复性（图 S2）。对氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的分析也得出了一致的结果（图 S1）。因此，血红蛋白与钙的时空轨迹对应关系仅限于超慢频率。

04、ISA 和 δ 活动中的反向方向性及状态反转

图 2A 中的时间延迟（TD）分析表明，ISA 和 δ 频段钙信号沿小鼠皮层的前后轴反向传播，且 ISA 和 δ 活动的轨迹在清醒和麻醉状态之间会发生方向反转。为验证这一观点，我们分析了运动皮层和视觉皮层中两个感兴趣区域（ROI）之间的格兰杰因果关系（GC）。视觉和运动 ROI 是通过识别清醒和麻醉状态下最大滞后差异区域来定义的，用于量化沿皮层前后轴的方向性。图 2C 展示了经滤波后的视觉和运动钙时间序列在 δ 和 ISA 频段的 GC。GC 结果显示，其格兰杰因果关系在统计上显著，且与图 2A 中的滞后投影方向相同。因此，GC 分析表明，ISA 和 δ 活动沿皮层前后轴反向传播，且这两个频段的方向性在清醒和氯胺酮 / 右美托咪定麻醉状态之间发生反转。

接下来，我们计算了视觉和运动 ROI 之间在 0.02 - 5.12Hz 频率范围内，以双八度为间隔的相位延迟（见 “实验方法” 部分）（图 2C），以寻找 ISA 和 δ 方向性之间的频谱转变点。结果（图 2D）表明，在清醒和氯胺酮麻醉状态下（右美托咪定麻醉情况类似；图 S3），相位偏移在 0.02 - 0.32Hz 和 1 - 5Hz 范围内保持稳定，在约 0.64Hz 处出现明显的方向性转变。这些结果与超慢相位偏移是 δ 相位关系的低通滤波版本这一假设不一致，因为该假设会产生线性的相位 - 频率关系。

为将图 2D 背后的概念扩展到整个皮层，我们对经双八度频率区间滤波后的钙信号计算了全皮层 TD 矩阵（如同图 1E）。然后，我们使用秩次相关计算了所有 TD 矩阵对之间的相似性（图 3）。此计算比较了不同双八度频率区间内钙活动的时空轨迹。在氯胺酮麻醉和清醒状态下（图 3A 和 3B），明显出现两个高相关区域，分别在 0.02 - 0.32Hz 范围和 0.64 - 5Hz 范围。因此，全皮层分析揭示出在 0.02 - 5.12Hz 范围内，仅存在两个时空轨迹的频谱区域，转变点约在 0.64Hz。此外，超慢和 δ 频段的 TD 矩阵呈负相关，表明在超慢和 δ 频率范围内，活动大致沿相反方向移动。

图 3. 不同频率和意识状态下全皮层钙信号 TD 和 FC 矩阵的比较(A - C) 每个矩阵元素表示一对 TD 矩阵之间的秩次相关，对双八度频率区间内钙活动的时空轨迹进行定量比较。(A) 和 (B) 分别为氯胺酮麻醉（A）和清醒（B）状态下，不同频率区间 TD 矩阵之间的秩次相关。(C) 麻醉状态 TD 矩阵与清醒状态 TD 矩阵之间的秩次相关。(D - F) 与 (A) - (C) 分析相同，但应用于 FC 矩阵，对双八度频率区间内钙活动的相关结构进行定量比较。注意 (A) - (C) 与 (D) - (F) 色条刻度的差异。对右美托咪定麻醉的分析得出非常相似的结果（图 S3）

同样的方法也可以量化清醒和氯胺酮麻醉状态之间方向性的反转情况（图 3C）。超慢频段的 TD 矩阵在清醒和氯胺酮麻醉状态下呈负相关，δ 频段的 TD 矩阵也是如此，这表明了不同状态之间方向性的反转。此外，清醒状态下的 ISA 方向性与氯胺酮麻醉状态下的 δ 方向性相似，而清醒状态下的 δ 方向性与氯胺酮麻醉状态下的 ISA 方向性相似（图 2A）。右美托咪定麻醉也产生类似结果（图 S3）。因此，在同一状态下（麻醉或清醒；图 3A 和 3B），ISA 和 δ 活动沿相反方向传播，并且每个频段的活动在不同状态之间大致反转方向（图 3C）。类似于图 3A - 3C 的相位延迟矩阵分析得出几乎相同的结果（图 S3）。

最后，我们用全皮层 FC 矩阵（如同图 1D）重复图 3A - 3C 中的分析，以研究 FC 如何随频率和意识状态变化。结果表明，在氯胺酮麻醉（图 3D）和清醒（图 3E）状态下，FC 在 0.02 - 5Hz 范围内都高度稳定（斯皮尔曼等级相关系数 rho 值 > 0.9）。在氯胺酮麻醉和清醒状态之间，FC 通常也很稳定（斯皮尔曼等级相关系数 rho 值 > 0.8；图 3F）。因此，相较于自发活动中频率和状态特异性差异，FC 对这些差异的敏感度低于时空轨迹。

05、超慢时空动态中的层状特异性

接下来，我们通过在小鼠（n = 13）的视觉皮层和运动皮层中插入两个 16 通道深度电极（图 4A），记录宽频谱（0.02 - 100Hz）的局部场电位（LFP），来探索更高频率（>5Hz）以及自发活动的层状结构。由于视觉皮层比运动皮层薄，我们从运动皮层的浅到深的 16 个记录位点以及视觉皮层深度方向的 12 个位点采集数据。选择视觉皮层和运动皮层是为了与我们的成像分析相匹配（图 2C），使我们能够比较光学成像和电生理记录的方向结果。

图4. 自发视觉 - 运动活动中的跨层时间动态在频率和状态上呈现系统性变化

(A) 将16通道深度探头插入运动皮层和视觉皮层。(B) 跨层功能连接（FC）（n = 13）。四个16×12矩阵展示了运动皮层的16个电极（行）与视觉皮层的12个电极（列）之间的相关性；电极按从浅到深排列。皮尔逊r值大于色条上星号标记的数值具有统计学意义（p < 0.001；见 “实验方法” 部分）。(C) 跨层时间延迟（TD）矩阵（n = 13），排列方式与(B)相同。蓝色表示运动皮层领先于视觉皮层；红色表示运动皮层滞后于视觉皮层。无统计学意义的TD（p > 0.001；见 “实验方法” 部分）显示为灰色。(D) 对(B)和(C)结果的示意性表示，突出区域之间最短的延迟。粗线表示信号传递的主要方向。(E) 和 (F) 超慢活动（ISA）相位与δ频段幅度之间的相位 - 幅度耦合（PAC）。示例5分钟时间序列（灰色）展示了ISA相位（E）和δ频段幅度（F）的计算过程，首先进行滤波（蓝色），然后应用希尔伯特变换（红色）。(G) 针对每个时间序列（电极或像素），根据超慢相位对δ频段幅度进行分箱并求平均。清醒和氯胺酮麻醉状态下，电生理学和成像的PAC直方图高度一致（右美托咪定麻醉的PAC分析见图S1）。标签1、2、5和6对应图1和图2中的条件。图S1展示了对应标签3和4的右美托咪定麻醉条件。首先，为确定ISA在局部场电位（LFP）活动中的时空轨迹是否与更高频率不同，我们计算了视觉皮层和运动皮层之间的跨层FC和TD矩阵。ISA和δ频段的结果如图4B和4C所示，这两个图展示了16×12的FC和TD矩阵，描绘了运动皮层和视觉皮层之间的层状关系。很明显，ISA和δ频段的跨层FC和TD结构不仅彼此不同（p < 0.001；见 “实验方法” 部分），在清醒和氯胺酮麻醉状态下也有所不同。此外，如图S4所示，与高达γ频段的更高频率相比，ISA的跨层关系也具有独特性（p < 0.001；见 “实验方法” 部分）。这些结果表明，自发ISA的时空结构不仅与δ活动相比具有独特性，与高达100Hz的典型LFP频段相比同样如此。请注意，图4C仅报告了具有统计学意义的TD（p < 0.01，经邦费罗尼校正；见 “实验方法” 部分）；无统计学意义的结果显示为灰色。

图 4B 和 4C 进一步揭示了 ISA 在哪些皮层层传播，以及清醒和氯胺酮麻醉状态下 ISA 方向性反转的层状基础。在氯胺酮麻醉下（图 4C 中的图像 2），运动皮层 II - V 层的 ISA 领先于视觉皮层 II - IV 层的 ISA（浅蓝色）。相反，氯胺酮麻醉下视觉皮层较深层的 ISA 领先于运动皮层的浅 / 中层（红色）。每个方向信号传递的相对强度可以从相关矩阵中推断出来。对比图 4B 和 4C 中的图像 2，对应红色（视觉到运动）时间偏移的相关性强于对应蓝色（运动到视觉）时间偏移的相关性。因此，在氯胺酮麻醉下的 ISA 中，视觉到运动的方向占主导，这与图 2 中的钙成像和血红蛋白成像结果一致。同样的推理表明，在清醒状态下情况相反：在超慢局部场电位（LFP）中，运动到视觉的方向占主导（图 4B 和 4C 中的图像 4），这也与钙成像和血红蛋白成像结果相符。

因此，基于时间延迟（TD），我们发现氯胺酮麻醉下的 ISA 倾向于从视觉皮层深层（V 和 VI 层）传播到运动皮层柱的大部分区域（I - V 层）。在清醒状态下，ISA 倾向于从运动皮层的 I - V 层传播到视觉皮层的 I - IV 层；然而，运动皮层与视觉皮层之间最短的时间延迟出现在运动皮层 V 层与视觉皮层 I - IV 层之间（图 4C 和 4D 中的图像 4）。假设最短的 TD 反映了最直接的关系，我们得出结论，在清醒和氯胺酮麻醉状态下，ISA 倾向于从深层（V 和 VI 层）发出，并在较浅层（I - IV 层）接收，总结于图 4D（面板 2 和 4）。

其他频段计算出的 FC 和 TD 矩阵也可以进行类似分析（图 S4）。例如，自发的 δ 活动在视觉皮层和运动皮层之间从深层向浅层移动，并且在清醒和氯胺酮麻醉状态下方向相反（图 4D），这与我们的钙成像结果一致。与 ISA 一样，δ 活动的方向反转意味着对持续双向信号的重新加权，但 δ 活动的方向与 ISA 相反（图 4D，面板 1 和 3）。高于 δ 频段的频率在清醒和氯胺酮麻醉状态下未观察到方向反转（图 S4）。对右美托咪定麻醉的分析得出与氯胺酮麻醉非常相似的结果。最后，使用电流源密度时间序列计算 FC 和 TD 矩阵，重现了使用 LFP 观察到的结果（图 S5）。

06、自发 ISA 对 δ 活动的调制

最后，尽管 ISA 和 δ 具有不同的时空轨迹，但先前基于任务的研究表明 ISA 相位与 δ 幅度之间存在跨频率相互作用。为探究这种情况是否自发发生，我们计算了 ISA 相位与 δ 幅度之间的相位 - 幅度耦合（PAC）（图 4E - 4G）。在我们的电生理记录中，对所有电极以及钙成像中的所有像素分别计算了 PAC。在这两种情况下，ISA 相位与 δ 幅度之间都存在稳健且具有统计学意义（p <0.001；见 “实验方法” 部分）的关系，并且这种关系的相位在清醒和氯胺酮麻醉状态之间发生变化。右美托咪定麻醉得出非常相似的结果（图 S1）。

四、讨论

综上所述，我们发现小鼠大脑皮层特定层之间的自发超慢脑活动遵循一致的时空轨迹；自发 ISA 的时空和跨层组织与 δ 活动以及高达 100Hz 的局部场电位（LFP）均不同。此外，ISA 的传播方向取决于大脑的状态（清醒与麻醉）。在每种状态下，ISA 时空轨迹的方向和拓扑结构在血红蛋白成像、钙成像和电生理学中是一致的。综合来看，这些结果支持这样一种观点，即存在一种独特的超慢神经生理过程，其时间结构依赖于状态。此外，血氧信号与超慢脑活动的时空动态和层状组织具有特定的对应关系。

01、对超慢神经生理学的意义

局部场电位（LFP）中的超慢波动已被观察了数十年，但关于大空间尺度上的极低频脑活动应被理解为局部高频事件的简单总和，还是存在与更快更精细尺度活动不同的 ISA 新兴组织原则，仍存在争议。先前已有报道称 ISA 与较高频率之间存在相似的相关结构（FC），并以此认为 ISA 代表了更快现象的宽泛、缓慢的总和。

在本研究中，我们同样观察到宽视野钙成像的相关结构在 0.02 - 5Hz 范围内是稳定的；然而，我们对时空轨迹的分析清晰地揭示了 ISA 与较高频段之间的区别。通过钙成像发现，与 ISA 最接近的典型频段 ——δ 频段活动的全皮层时空轨迹，在清醒和麻醉状态下与 ISA 的时空动态有显著差异。此外，通过电生理学测量，在小鼠视觉皮层和运动皮层之间计算得出的 ISA 跨层时空结构，与 δ 频段以及高达 100Hz 的较高频率 LFP 均不同。未来能够进行全频谱活动宽视野测量的技术，可能会更详细地揭示 ISA 与较高频率之间的差异，但目前的研究已清楚地表明，ISA 的时空动态与较高频率并不一致

ISA 具有不同于较高频率的自身功能和神经生理特性，这一原则是科学家所提出概念的低频扩展。他们已证明，慢 δ 振荡是一种独特的脑过程，它通过特定的皮层层次）以及皮层 - 丘脑环路移动，并参与记忆巩固。本研究阐述了 ISA 的一些类似特性：与较高频率相比，ISA 的时空动态是独特的，并且 ISA 至少在视觉皮层和运动皮层之间倾向于从皮层深层向浅层传播（图 4）。低频自发活动从深层传播与先前的研究结果一致。此外，ISA 的时空组织似乎与大脑状态相关（见 “状态依赖性”）。然而，关于 ISA 的独特特性仍存在一些问题：例如，本文所确立的皮层关系并不排除皮层下连接的作用（就像 δ 活动涉及皮层 - 皮层以及皮层 - 丘脑连接一样）。未来的研究还必须解决超慢现象的起源问题，递归多突触连接、阈下活动以及神经胶质代谢信号都可能发挥作用。最后，目前对 ISA 中一致时空轨迹的观察不应被误解为 “信息流”；相反，更有可能的是 ISA 塑造或调节大脑中较高频率的信息处理，这一假设必须在未来的研究中加以验证。

02、对 BOLD 成像的意义

静息态功能磁共振成像（rs - fMRI）通常被解释为代表神经活动的广泛总结，其假设是 BOLD 信号反映了对较高频率神经活动的血管低通滤波。我们表明，血氧信号中的超慢时空轨迹与通过钙成像（图 2）和电生理学（图 4）得出的 ISA 时空动态具体相符。由于神经生理学测量将超慢时空动态与较高频率区分开来，我们得出结论，自发 BOLD 信号的组织具体归因于一种超慢脑过程。此外，我们发现自发 ISA 在视觉皮层和运动皮层之间从皮层深层向浅层传播（图 4），这意味着长距离 BOLD 信号关系反映了一种此前未被充分认识的层状特异性程度。这些结果为解释 rs - fMRI 中长距离关系的神经生理学奠定了更广泛的基础。

我们的发现也与当前对血氧信号动态及其与脑功能状态关系的研究相关。绝大多数 rs - fMRI 动态文献都集中在超慢零滞后相关结构随时间的变化上。我们的结果从超慢时空轨迹的角度探讨动态，并表明这些轨迹在清醒和麻醉状态之间比零滞后相关矩阵更加不稳定（图 2 和图 3）。因此，rs - fMRI 的动态组织及其与脑状态的关系可能在时空轨迹上比在相关结构变化上更根本地体现出来。

03、ISA 与 δ 活动之间的关系

尽管 ISA 和 δ 的时空组织截然不同，但本研究的两项发现表明，这两个频谱范围的自发活动在功能上仍然存在联系。首先，ISA 和 δ 在小鼠背侧皮层的前后轴上大致沿相反方向传播（图 2E）。我们之前曾观察到在人类海马体和大脑皮层之间，δ 和 ISA 沿相反方向传播，并假设这是皮层 - 海马体通信的一个特征。我们目前在小鼠中的研究结果表明，相反，δ 和 ISA 的反向传播更为普遍。这种反向传播的一个可能功能是传递慢（δ）前馈和更慢（ISA）反馈影响，类似于在视觉任务中视觉皮层中 γ 和 α 活动所观察到的情况，尽管前馈和反馈的概念必须扩展以解释自发活动。

其次，在钙成像和电生理记录中，ISA 的相位与 δ 频段活动的幅度相关联（这种相位关系在不同意识状态下略有变化；图 4 和图 S1）。先前的研究也表明，在执行任务期间，ISA 会调制高于 δ 频段的频率幅度。基于此，我们推测自发活动可能按频率进行分层组织，使得 ISA 调制较高频率的功率。

04、状态依赖性

我们发现，在清醒和麻醉状态下，无论是 δ 活动还是 ISA，其时空轨迹的主导方向都会发生反转（图 2、图 3 和图 4）。而在较高频率下则未观察到这种方向性的反转（图 S4 和图 S5）。因此，我们假设低频活动的时间结构，尤其是其在皮层中的传播方向，在控制或标记大脑功能状态方面起着特殊作用。补充实验进一步支持了这一结论，该实验表明，在右美托咪定麻醉期间给予右美托咪定逆转剂（阿替美唑），不仅能迅速使右美托咪定麻醉的小鼠恢复清醒，还能恢复清醒状态下的 ISA 和 δ 活动模式（图 S1、图 S3 和图 S5）。未来有必要开展更多研究，考察更广泛的药理试剂和生理状态，以确定不同条件下低频活动模式的共性与差异，包括动物自由活动状态与静止睁眼静息状态之间可能存在的差异。

最后，我们的层状电生理学研究结果还表明，从机制上讲，ISA 和 δ 活动中主导传播方向的反转是通过改变不同跨层关系中双向信号的相对权重来实现的（图 4D）。这种重新加权的基础需要进一步研究，但很自然会想到神经调节可能在清醒与麻醉状态之间的方向性转变中发挥作用。

五、实验模型与实验对象详情

实验动物

以下描述的所有实验程序均已获得华盛顿大学动物研究委员会批准，符合美国实验动物评估和认可委员会（AAALAC）的指导方针。成像研究使用的是从杰克逊实验室（JAX 品系：C57BL/6J - Tg (Thy1 - GCaMP6f) GP5.5Dkim；库存编号：024276）获取的，在小鼠 Thy1 启动子控制下表达 GCaMP6f 的转基因小鼠。使用正向引物 5′ - CATCAGTGCAGCAGAGCTTC - 3′和反向引物 5′ - CAGCGTATCCACATAGCGTA - 3′通过聚合酶链反应（PCR）来确认 GCaMP6/Thy1 转基因基因型。图 S1 展示了 GCaMP6 荧光的组织学情况。电生理学研究使用的是 C57Bl6/J 小鼠（杰克逊实验室；库存编号：664）。所有小鼠均为雄性，年龄在 12 至 16 周，体重 28 - 36 克，饲养在专用小鼠饲养设施的标准笼子中，光照 / 黑暗周期为 12 小时 / 12 小时。

六、方法详情

01、光学成像的动物准备

本研究中使用了 14 只 GCaMP6 小鼠（12 - 16 周龄，28 - 36 克）进行成像。对转基因 GCaMP6 小鼠的研究仅用于光学钙成像目的，除此之外，它们在表型上是正常的。使用异氟烷（诱导浓度 3%，维持浓度 1%，流量 0.5 升 / 分钟）对小鼠进行麻醉，然后将其放置在立体定位仪中。接着剃去小鼠头部毛发，沿中线切开以暴露颅骨。使用温度可控的加热垫将小鼠体温维持在 37°C。使用牙科粘固剂将由有机玻璃制成且带有预钻孔的慢性颅骨窗固定在颅骨上。

02、电生理实验动物准备

本实验使用 13 只 C57Bl6/J 小鼠获取电生理记录。在手术前 4 小时，给小鼠皮下注射地塞米松（20 微升，4 毫克 / 毫升），并在手术前即刻腹腔注射甘露醇（150 微升，20% 甘露醇）。使用异氟烷麻醉小鼠（诱导浓度 3%，维持浓度 1.5%）。麻醉后，进行局部利多卡因麻醉，剃除头皮毛发，沿头皮中线切开并将头皮牵开，去除骨膜。根据图 2C 所示格兰杰因果分析得出的立体定位坐标，在运动区和视觉区上方进行两个直径 1 毫米的颅骨切除术（运动皮层：前囟左侧 1.5 毫米，前囟前方 1.6 毫米；视觉皮层：前囟左侧 2.6 毫米，前囟后方 3.0 毫米）。在右半球进行第三个颅骨切除术（前囟右侧 2.3 毫米，前囟前方 0.9 毫米），并放置一根永久接地线，用 C&B Metabond 牙科粘固剂固定。使用牙科粘固剂将带有螺纹的定制固定块连接到颅骨上（以便在记录过程中固定头部）。左半球的颅骨切除部位覆盖有自愈合硅聚合物，可使硅电极无损穿过。手术结束时，给小鼠皮下注射丁丙诺啡用于止痛，并且在进行任何记录之前，让小鼠恢复 5 天。

03、光学成像系统

该系统由四个 LED 提供顺序照明：470 纳米（实测峰值波长 λ = 454 纳米，本研究中称为 454 纳米 LED，LCS - 0470 - 15 - 22，）、530 纳米（实测峰值波长 λ = 523 纳米，LCS - 0530 - 15 - 22）、590 纳米（实测峰值波长 λ = 595 纳米，LCS - 0590 - 10 - 22）和 625 纳米（实测峰值波长 λ = 640 纳米，LCS - 0625 - 03 - 22）。454 纳米 LED 用于激发 GCaMP，523 纳米、595 纳米和 640 纳米 LED 用于多光谱血氧成像。523 纳米 LED 还用作 GCaMP6 荧光的发射参考，以消除荧光信号中任何血液动力学干扰（如下所述）。通过使用多波长合束二向色镜，使 454 纳米和 523 纳米 LED 光路共线。对于图像检测，我们使用了一台冷却的帧转移电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机（iXon 897，Andor Technologies，英国北爱尔兰贝尔法斯特），搭配一个 85 毫米 f/1.4 相机镜头。每个通道的采集帧率为 16.8 赫兹，相机的总帧率约为 67 赫兹。该帧率远高于充分表征假设的 GCaMP6 活动所需的时间分辨率。为了提高帧率并增加信噪比，CCD 以 4×4 像素进行合并，这将输出图像的分辨率从全帧 512×512 像素降低到 128×128 像素。LED 和 CCD 的曝光通过数据采集卡使用 MATLAB进行同步和触发。视野调整为约 1 平方厘米，覆盖了大脑皮层大部分凸面区域，前后范围从嗅球到上丘。得到的像素大小约为 78 微米 ×78 微米。为了尽量减少来自颅骨的镜面反射，我们在 LED 光源和 CCD 镜头前使用了一系列线性偏振器。固定好的小鼠放置在相机的焦平面上。组合的、准直的 LED 单元放置在距离小鼠颅骨约 8 厘米处，根据采集镜头确定的工作距离约为 14 厘米。在 CCD 前放置一个 515 纳米长通滤光片，以滤除 470 纳米的荧光激发光，并在激发源前使用一个 460/60 纳米带通滤光片，进一步减少荧光激发光透过 515 纳米长通滤光片的泄漏。454 纳米、523 纳米、595 纳米和 640 纳米 LED 的脉冲持续时间分别为 20 毫秒、5 毫秒、3 毫秒和 1 毫秒。

04、电生理系统

进行电生理记录时，将小鼠放置在毛毡吊床上，通过固定块将其颅骨固定在一根稳固的杆上。两个 1.5 毫米的 16 通道线性阵列电极（NeuroNexus 型号 A1x16 - 5mm - 100 - 703 - A16，美国密歇根州安阿伯市）连接到独立的显微操作器（David Kopf Instruments，美国加利福尼亚州洛杉矶市）上。电极用 DiI（1,1’ - 二十八烷基 - 3,3,3′,3′ - 四甲基吲哚羰花青高氯酸盐；Sigma - Aldrich，美国密苏里州圣路易斯市）染色，然后在手术立体显微镜（Olympus，日本东京）的直接观察下，通过透明的硅密封剂（可直接观察皮层）插入大脑。通过三种方式确认电极位置：1）通过视觉引导，使最浅的触点刚好位于皮层表面下方；2）监测从噪声 / 空气过渡到大脑时，最浅触点处的电生理信号；3）用 DiI 对电极染色，并通过小鼠大脑的组织切片确认位置（图 4A）。使用高通滤波器截止频率为 0.02Hz 的放大器（Intan RDH2132）记录局部场电位，该放大器通过采集板（OpenEphys）连接到记录计算机，参考线放置在与电极相对的右半球（前囟右侧 2.3 毫米，前囟前方 0.9 毫米）。所有记录均在完全黑暗的房间中进行。对于每只小鼠，先进行清醒状态下的记录，然后在同一实验环节中通过腹腔注射氯胺酮 / 甲苯噻嗪（即不将电极从大脑中取出）。

东莞富临医疗科技有限公司是Open Ephys 和 Intan Technologies 在亚洲的代理商，富临医疗为亚洲客户提供“技术服务”与“电生理产品”

05、清醒状态记录

如电生理系统描述中所述，清醒小鼠的记录（成像和电生理）是将小鼠置于毛毡吊床上并固定头部进行的。成像时将头部固定在光学窗口，电生理记录时则固定在颅骨上。吊床提供了一个黑暗、舒适的环境，同时防止清醒小鼠对其受限制的头部施加扭矩。手术后恢复后，通过两个 20 分钟的训练环节，使小鼠适应吊床装置。以恢复正常行为（如动须、梳理毛发以及头部受限时行走）作为适应的指标。尽管记录过程中未使用加速度计或其他行为测量手段来追踪小鼠在吊床内的运动，但定性观察发现，完成适应方案后，小鼠处于放松状态，肢体运动不频繁。14 只小鼠中有 7 只，在相隔两周的两个不同日子里，每天进行 60 分钟的清醒成像。其余 7 只小鼠在一天内进行 60 分钟的清醒成像。60 分钟的成像过程分为 12 个 5 分钟的时段进行采集。13 只小鼠的清醒电生理记录则连续进行 60 分钟。

06、麻醉状态记录

对于氯胺酮麻醉下的成像和电生理，通过腹腔注射氯胺酮 / 甲苯噻嗪混合液（86.9 毫克 / 千克氯胺酮，13.4 毫克 / 千克甲苯噻嗪）对小鼠进行麻醉。对于右美托咪定麻醉下的成像和电生理，通过腹腔注射右美托咪定（0.5 毫克 / 千克）对小鼠进行麻醉。通过确认动物对后爪捏夹无反应来验证麻醉效果。将动物放置并保持在固态水循环加热垫上，加热垫温度维持在 42°C。14 只小鼠中有 7 只，在相隔两周的两个不同日子里，每天进行 45 分钟的麻醉成像（麻醉效果持续时间）。其余 7 只小鼠在一天内进行 45 分钟的麻醉成像。45 分钟的成像过程分为 9 个 5 分钟的时段进行采集。13 只小鼠的麻醉电生理记录连续进行 45 分钟。我们还收集了通过腹腔注射阿替美唑（0.5 毫克 / 千克）瞬间逆转右美托咪定麻醉的数据。右美托咪定麻醉的逆转（右美逆转）通过小鼠恢复反射以及典型的清醒行为（如动须和梳理毛发）来确认。7 只小鼠在右美逆转条件下各成像 45 分钟；5 只小鼠在右美逆转条件下各进行 45 分钟的电生理记录。

07、落射荧光和共聚焦成像

用 FatalPlus对小鼠进行深度麻醉，然后经心脏灌注 0.01M 的磷酸盐缓冲液（PBS）。取出大脑，在 4% 多聚甲醛中固定 24 小时，然后转移至 0.2M PBS 中的 30% 蔗糖溶液中。大脑浸透后，在干冰上速冻，使用滑动切片机制作 50μm 厚的冠状切片。切片保存在 0.2M PBS、30% 蔗糖和 30% 乙二醇的混合液中，置于 - 20°C 环境。观察时，将切片在 PBS 中清洗，固定，然后用落射荧光显微镜检查内在的 GCaMP6 荧光。若使用共聚焦显微镜观察，额外的切片在 PBS 中清洗、固定，并用含 4′,6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚（DAPI）的封片剂封片。使用 Nikon A1 - Rsi 倒置共聚焦显微镜，搭配 10 倍物镜采集荧光图像。DAPI 标记的细胞和电极标记物 DiI 分别用 405nm 和 560nm 激光线激发

七、量化与统计分析

01、图像处理

从原始数据中减去在黑暗环境下收集的 1 分钟暗图像的平均基线光照水平代表帧。对所有像素时间序列分别进行去趋势处理，以消除由于光漂白、LED 电流漂移以及颅骨表面不均匀性导致的光照水平变化。如先前所述，结合 523 纳米、595 纳米和 640 纳米 LED 通道的反射率变化，利用修正的比尔 - 朗伯定律提供血氧测量数据。每个对比度下的图像都用高斯滤波器（5×5 像素框，标准差为 1.3 像素）进行平滑处理。

GCaMP6 荧光信号必须针对血管活动和吸收性血红蛋白浓度变化的影响进行校正。虽然血液动力学的影响可能不会完全掩盖发射信号，但会对其产生影响。计算相对荧光变化的常用校正方法包括使用参考波长进行减法和比率测量技术。我们实施了一种比率校正算法（公式 1），以 523 纳米 LED 在 GCaMP6 发射波长处的反射通道作为参考，校正血红蛋白和脱氧血红蛋白对荧光发射的吸收。

（公式 1）

指检测到的荧光发射强度。 描述在发射波长处测量到的反射率变化。将 628 纳米反射通道的一帧图像加载到 Adobe Photoshop CC 2014中，手动将所有非大脑区域涂成白色。再将图像加载回 MATLAB，并用于创建一个二值化的大脑掩码。所有后续分析都在标记为大脑的像素上进行。使用前囟和人字缝的位置，将每只小鼠的图像序列（以及每只小鼠的大脑掩码）仿射变换到一个共同的图谱空间（基于帕西诺斯小鼠图谱）。数据未进行全局信号回归。

02、电生理信号处理

16 通道记录以位于与电极相对的右半球（前囟右侧 2.3 毫米，前囟前方 0.9 毫米）的接地线为参考。为进一步验证 16 个通道覆盖运动皮层深度，12 个通道覆盖视觉皮层深度（图 4A），我们分析了所有通道的频谱内容。我们发现在所有记录中，运动皮层的所有 16 个通道频谱内容非常相似，这表明所有通道可能都在皮层内。相比之下，视觉皮层的 13 - 16 通道的功率远低于 1 - 12 通道，这表明 12 个通道覆盖视觉皮层深度，而 13 - 16 通道位于下方的白质中（因此排除在分析之外）。对数据应用 60Hz 陷波滤波以去除电子噪声（图 S6）。

03、相关性与时间滞后

如图 1B 和 1C 所述，传统的相关性分析涉及计算从一个种子区域提取的时间序列与从其他某个位置（单个像素或感兴趣区域）提取的第二个时间序列之间的皮尔逊相关系数，即：

（公式 2）

其中，和分别是信号和的时间标准差，是积分区间。在此，我们推广了精确时间同步的假设，并计算滞后互相关函数。即：

（公式 3）

其中是滞后时间（以时间单位表示）。在光学和电生理记录中，分别计算记录对（像素对和电极对）之间的滞后相关曲线。取得极值时的值定义了信号和之间的时间滞后（等效于延迟）。的值即为传统的零滞后皮尔逊相关系数。所有时间滞后对和零滞后相关对分别定义了时间延迟（TD）矩阵和功能连接（FC）矩阵。

在成像数据中，16.8Hz 的时间采样密度将经验时间延迟的检测限制在约 60ms；然而，我们对成像得到的滞后互相关曲线应用抛物线插值法，以检测短于时间采样率的时间延迟。在麻醉状态下的 δ 活动以及清醒和麻醉状态下测量的超慢活动中，经验时间延迟矩阵与使用抛物线插值计算的时间延迟矩阵之间具有很强的一致性（测量值之间的皮尔逊相关系数）。例外情况是清醒状态下的 δ 活动，抛物线插值法揭示了一些短时间滞后（图 1E 中为 ±10ms），这些滞后无法通过经验测量得到。关键的是，使用抛物线插值计算的清醒 δ 活动时间延迟是稳定的（图 S2），与文献中使用更高时间采样率获得的先前发现一致，并且与本研究中以 300Hz 采样的电生理结果一致（图 4C）。抛物线插值仅应用于成像数据；由于电生理数据的采集时间采样密度高得多，其时间延迟是通过经验计算得到的。通过直接对 GCaMP6、血红蛋白和电生理（LFP）信号应用零相位滤波（四阶巴特沃斯滤波器），在特定频带上计算 FC 和 TD 矩阵。

04、组水平的 FC 和 TD 矩阵

在成像数据中，对每个 5 分钟运行时段内大脑中的每对像素计算滞后相关性。然后，对每只小鼠在清醒和麻醉时段内的 5 分钟运行时段计算得到的 FC 和 TD 矩阵进行平均。对每个 10 分钟时间段分别计算平均值，使我们能够验证时间和小鼠之间的稳定性（图 S2）。偶尔，清醒成像运行时段的频谱内容会包含睡眠的 δ 特征（图 S6）；这些运行时段会从清醒分析中省略，导致总清醒成像数据收集量损失 5.2%。组水平的 FC 和 TD 矩阵是根据成像两天内每只小鼠的 FC 和 TD 矩阵平均值计算得出的。在电生理数据中计算 FC 和 TD 矩阵时采用了类似的策略。尽管电生理数据是连续采集的，但为了与成像分析匹配，我们将记录分割为 5 分钟的时间段，并在每个时间段内计算 FC 和 TD 矩阵。然后，先在每只小鼠内（清醒和麻醉状态）对时间段进行平均，再在所有小鼠间进行平均，以生成图 4 和图 S2。与成像数据一样，我们还使用 δ 功率从清醒电生理数据中排除可能的睡眠时段（图 S6）。在分析的 13 只小鼠中，由于可能处于睡眠状态，总清醒数据的 8.3% 被省略。

05、组水平的相位 - 频率图

在成像数据中，从图 2 所示的视觉和运动感兴趣区域（ROI）中提取时间序列。然后，在每个 5 分钟的可用数据时间段内，将 ROI 时间序列滤波到一个双八度频率区间（从 0.02 - 0.08Hz 到 1.28 - 5.12Hz）。对于每个 5 分钟时间段和每个双八度频率区间，通过对每个时间序列进行希尔伯特变换（如图 4E 所示）并计算中值瞬时相位延迟，来计算运动和视觉时间序列之间的相位关系。然后，如计算 FC 和 TD 矩阵所述，先在各时段内平均这些相位关系，再在所有时段间进行平均。采用相同的策略计算图 S4 的相位延迟矩阵。

06、组水平的格兰杰因果关系（GC）

使用科学家的 GC 工具箱在时域中进行 GC 分析。在成像数据中，从图 2 所示的视觉和运动 ROI 中提取时间序列。然后在麻醉和清醒状态下，将这些时间序列分别滤波到 δ（1 - 4Hz）和 ISA（0.02 - 0.1Hz）频率范围。由于 GC 不适用于对时间段进行平均，我们将每个频段内 5 分钟时间段的时间序列在不同时段和小鼠间进行连接。然后，我们对每个频段内这些连接后的时间序列应用时域 GC 分析，其中自回归模型阶数设置为频率区间中最低频率的 150%（例如，ISA 为 75s，δ 为 1.5s），这是推荐的设置。在每种情况下都发现了具有统计学意义的 GC（）。在一系列模型阶数（频率区间中最低频率的 75% - 175%）下，GC 结果相同。为解决 GC 可能存在的不足，我们还验证了 GC 结果与更简单、更易解释的指标（如相位延迟和时间延迟）一致。

07、电流源密度

局部场电位记录可能会受到公共参考电极和被动容积传导的干扰。减少这些影响对 LFP 数据作用的一种策略是应用电流源密度（CSD）分析，这相当于对时间序列数据计算二阶空间导数。我们使用三点公式来近似二阶空间导数，分别在运动皮层和视觉皮层的线性记录阵列上计算一维 CSD 分布：

（公式 4）其中是电压，是计算的点，是线性阵列上的触点间距。对于带通滤波信号的分析，在进行带通滤波之前计算 CSD。

08、统计显著性

由于目前分析的数据维度较高，需要使用各种非参数方法来评估统计显著性，具体如下：

(1) 图 1D 和图 4B 中 FC 矩阵相关性的统计显著性：使用标准参数方法计算 FC 矩阵中单个相关值的统计显著性，即对转换后的皮尔逊值使用双尾学生分布。然而，由于每个 FC 矩阵中有许多皮尔逊值（从几十到数万），存在多重比较问题。为解决此问题，我们利用这些 FC 矩阵中的相关性并非独立这一事实，对这些矩阵的特征谱应用贝叶斯信息准则的拉普拉斯估计，以确定潜在维度。在此基础上，发现图 1D 中 FC 矩阵的潜在维度为 9。然后，我们对模型阶数应用邦费罗尼校正，以确定的相关值，图 1D 中以星号标记。图 4B 采用相同原则，不过由于实验问题旨在识别层状特异性，我们使用更保守的方法，对层数进行邦费罗尼校正（；图 S4 中的相关矩阵表明层内通道并非独立），使得只有的时间相关性才显示为显著（模型阶数方法仅需进行 9 次多重比较校正）。我们注意到，此计算的目的并非对 FC 提出任何强烈主张（这不是本文重点），而只是为了提供最一致相关值的估计。

(2) 图 1E 和图 4C 中时间延迟的统计阈值：通过在计算滞后相关性之前对滤波后的时间序列进行随机相位置换，为每对成像轨迹 / 记录计算替代时间延迟，从而得到时间延迟的零分布。然后，使用柯尔莫哥洛夫 - 斯米尔诺夫检验，将每对通道之间的时间延迟经验分布（回想一下，TD 是在每个小鼠的 5 分钟时间段内计算的）与零分布进行比较。为解决多重比较问题，对于图 1E 中的 TD 矩阵，我们如上述 (1) 中所述再次计算模型阶数，发现这些 TD 矩阵的模型阶数为 9。然后，我们对模型阶数应用邦费罗尼校正，以确定的时间延迟值，使得不显著的值（数量很少）显示为灰色。对于图 4C，我们采用与上述 (1) 中层状 FC 矩阵相同的更保守方法（）。

(3) 图 1E 中 TD 矩阵的统计差异：如组水平 FC 和 TD 矩阵的计算中所述，组水平 TD 矩阵是通过先在小鼠内，然后在小鼠间对 5 分钟时间段内计算的 TD 矩阵进行平均得到的。为检验组水平 TD 矩阵之间的统计显著性，对 14 只小鼠中每只小鼠的平均 TD 矩阵进行随机置换（在 ISA 与 δ 之间，或清醒与麻醉之间）。然后，我们计算替代组水平 TD 矩阵之间的幅度差异（欧几里得距离）的零分布。基于此零分布，我们得出图 1E 中 TD 矩阵的差异在统计上显著（），无论是在 ISA 与 δ 之间，还是在清醒与麻醉之间。

(4) 图 2A 中滞后投影的统计差异：与上述 (1) 中的策略相同，只是将替代组水平 TD 矩阵转换为滞后投影（通过列均值），以生成替代组水平滞后投影。然后，将零分布计算为滞后投影之间的向量欧几里得距离，将图像视为一维向量（例如，每个脑像素对应一个数字）。基于此零分布，我们得出图 2A 中滞后投影的差异在统计上显著（），无论是在 ISA 与 δ 之间，还是在清醒与麻醉之间。

(5) 图 4B 和 4C 中 FC 和 TD 矩阵的统计差异：与上述 (1) 中概述的方法完全相同，应用于电生理学 FC 和 TD 矩阵。

(6) 图 2D 中的统计方法：阴影区域显示了视觉皮层和运动皮层之间在双八度频率区间内瞬时相位延迟中位数的 95% 置信区间。

(7) 图 4E 和 4F 中相位 - 幅度耦合（PAC）的统计显著性：图 4F 中相位 - 幅度直方图的零假设是均匀分布。因此，我们使用柯尔莫哥洛夫 - 斯米尔诺夫检验，将经验 PAC 直方图与均匀分布进行比较，以检验显著的 PAC，结果值。我们还应用了另一种基于置换的 PAC 检验，使用如卡诺尔蒂等人（2006 年）所述的调制指数。本质上，PAC 可被视为一个圆上的向量，描绘了一对信号之间的首选相位关系；此向量的长度即为调制指数。通过随机置换基础信号，计算替代 PAC 向量及其长度（例如，替代调制指数）。替代调制指数的零分布提供了统计显著性检验。通过此方法，目前观察到的 PAC（成像和电生理学）也具有高度显著性（）。

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