朱萌  陈禹州  区锦钊  李曌  黄沙  胡骁骅  鞠晓燕  田野  牛忠伟

作者单位：中国科学院理化技术研究所 中国科学院光化学转换与功能材料重点实验室，北京 100190； 解放军总医院医学创新研究部创伤修复与组织再生研究中心，北京 100048；北京积水潭医院烧伤科，北京 100035

摘要

目的  探讨水溶性壳聚糖凝胶敷料对糖尿病小鼠感染创面愈合的作用及机制。

方法  采用实验研究方法。将水溶性壳聚糖（含或不含）与聚乙烯醇及明胶混合，采用循环冻融的方法制备水溶性壳聚糖凝胶敷料和无水溶性壳聚糖凝胶敷料。大体观察第1次冻融前后2种敷料流动性情况，并比较2种敷料最终形成状态的外观差异。取细胞株L929和HaCaT，分别按照随机数字表法（分组方法下同）分为无水溶性壳聚糖敷料组（以下简称无水溶性壳聚糖组）和水溶性壳聚糖凝胶敷料组（以下简称水溶性壳聚糖组），分别加入相应类型的凝胶敷料培养24 h，采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测细胞增殖活力。取兔血红细胞悬液，分为生理盐水组、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）组、无水溶性壳聚糖组和水溶性壳聚糖组，分别作相应处理后孵育1 h，采用酶标仪检测红细胞的溶血程度。取24只11~14周龄、雌性db/db小鼠，在其背部制作全层皮肤缺损创面并在创面处滴剂金黄色葡萄球菌（MRSA）液72 h，然后将小鼠分为空白对照组、磺胺嘧啶银水胶敷料组（以下简称磺胺嘧啶银组）、无水溶性壳聚糖组、水溶性壳聚糖组，分别作相应处理。伤后1、7、14、21 d，大体观察创面颜色、渗出及愈合情况。伤后7、14、21 d，采用Image J图像分析软件测量4组创面面积并计算创面愈合率。伤后14 d，统计创面中MRSA浓度反映其感染情况。伤后21 d，采用苏木精-伊红染色对创面进行组织学分析；采用免疫荧光法检测创面中细胞CD31表达，反映新生血管情况。取Raw264.7细胞，分为空白对照组、白细胞介素4（IL-4）组、γ干扰素+内毒素/脂多糖（LPS）组和水溶性壳聚糖溶液组，分别作相应处理。培养48 h，采用流式细胞仪检测水溶性壳聚糖组与空白对照组、IL-4组细胞CD206阳性细胞百分率以及水溶性壳聚糖组与空白对照组、γ干扰素+LPS组细胞CD86阳性细胞百分率，反映巨噬细胞极化情况。取Raw264.7细胞，分为空白对照组、IL-4组、γ干扰素+LPS组、无水溶性壳聚糖组以及水溶性壳聚糖组，分别作相应处理。培养48 h，采用流式细胞仪检测无水溶性壳聚糖组、水溶性壳聚糖组、空白对照组、IL-4组细胞的CD206阳性细胞百分率以及无水溶性壳聚糖组、水溶性壳聚糖组、空白对照组、γ干扰素+LPS组的CD86阳性细胞百分率。以上细胞实验样本数均为3，动物实验样本数均为6。对数据行独立样本t检验、单因素方差分析、重复测量方差分析、LSD检验及 Dunnetts T3检验。

结果  2种凝胶敷料在进行循环冻融前都具有一定的流动性，冻融1次后其均形成半固态凝胶。2种敷料最终形成状态均基本呈稳定的半透明片状，透明度差异不大。培养24 h，水溶性壳聚糖组L929和HaCaT的细胞增殖活力均明显高于无水溶性壳聚糖组（t值分别为6.37、7.50，P<0.01）。孵育1 h，水溶性壳聚糖组红细胞溶血程度明显低于Triton X-100组（P<0.01），而与生理盐水组及无水溶性壳聚糖组相比无显著性差异（P>0.05）。伤后1 d，创面情况均相似。伤后7 d，空白对照组与无水溶性壳聚糖组小鼠创面内部淡黄色渗出物较多，磺胺嘧啶银组与水溶性壳聚糖组创面观察到少量渗出；水溶性壳聚糖组创面愈合率明显低于磺胺嘧啶银组（P<0.01），而与空白对照组、无水溶性壳聚糖组相近（P>0.05）。伤后14 d，空白对照组与无水溶性壳聚糖组创面干燥结痂，无明显上皮覆盖；磺胺嘧啶银组痂皮脱落，创面可见脓性渗出物；水溶性壳聚糖组创面基底呈淡红色，创面可观察到明显上皮覆盖。伤后14 d，水溶性壳聚糖组小鼠创面愈合率显著高于其他3组（P<0.01）。伤后21 d，水溶性壳聚糖组小鼠创面已完全闭合，其他3组创面均未完全愈合；水溶性壳聚糖组创面愈合率显著高于其他3组（P<0.01）。伤后14 d，水溶性壳聚糖组创面的菌浓度明显低于空白对照组（P<0.01），但与无水溶性壳聚糖组创面和磺胺嘧啶银组相近（P>0.05）。伤后21 d组织学分析显示，空白对照组创面堆积大量渗出物并形成痂皮，新生上皮缺损严重；无水溶性壳聚糖组的表皮亦有大面积缺损；磺胺嘧啶银组虽有薄层痂皮覆盖创面，但尚未形成完整排列的致密新生表皮；而水溶性壳聚糖组不仅创面被新生表皮完全覆盖，且新生上皮基底细胞排列规整。伤后21 d，水溶性壳聚糖组小鼠创面中CD31阳性百分率为（2.19±0.35）%，明显高于空白对照组的（0.18±0.05）%、无水溶性壳聚糖组的（0.23±0.06）%以及磺胺嘧啶银组的（0.62±0.25）%，P<0.01。培养48 h，水溶性壳聚糖组Raw264.7的CD206阳性细胞百分率明显高于空白对照组（P<0.01），而与IL-4组相近（P>0.05）；水溶性壳聚糖溶液组Raw264.7的CD86阳性细胞百分率明显高于空白对照组（P<0.05），但明显低于γ干扰素+LPS组（P<0.01）。培养48 h，水溶性壳聚糖组Raw264.7的CD206阳性细胞百分率低于IL-4组（P<0.01），但明显高于空白对照组与无水溶性壳聚糖组（P<0.01或P<0.05）；水溶性壳聚糖组CD86阳性细胞百分率与空白对照组、无水溶性壳聚糖组相近（P>0.05），但明显低于γ干扰素+LPS组（P<0.01）。

结论  水溶性壳聚糖能够刺激Raw264.7向具有抗炎修复作用的M2表型极化；形成的水溶性壳聚糖凝胶敷料生物安全性好，较无水溶性壳聚糖凝胶敷料能诱导更高水平的巨噬细胞M2极化，因此可以提升MRSA感染的db/db小鼠创面的修复效果，并促进创面快速愈合。

关键词：敷料， 水胶体；壳聚糖；感染；皮肤；慢性创面；创面修复

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24只健康无特殊病原体级11~14周龄、体重50~80 g、雌性db/db小鼠由斯贝福（北京）实验动物科技有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2019-0010。小鼠Fb株L929、人永生化KC株HaCaT、小鼠单核巨噬细胞株Raw264.7购于北京索莱宝科技有限公司。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）ATCC43300购于美国模式培养物集存库。水溶性壳聚糖由本研究团队在前期预实验中制备。聚乙烯醇、DMEM高糖细胞培养基、胎牛血清、兔重组CD31多克隆一抗、Alexa Fluor^TM 594标记的山羊抗兔IgG多克隆二抗购于上海赛默飞世尔科技（中国）有限公司，细胞计数试剂盒8（CCK-8）购于日本同仁化学研究所（上海），青霉素链霉素混合液、抗凝兔全血、聚乙二醇对异辛基苯基醚（Triton X-100）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、含有4'， 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂、γ干扰素、IL-4购于北京索莱宝科技有限公司，金黄色葡萄球菌显色培养基购于广东环凯微生物科技有限公司，异硫氰酸荧光素（FITC）标记的大鼠抗小鼠CD86单克隆抗体及藻青蛋白标记的大鼠抗小鼠CD206单克隆抗体购于北京达科为生物技术有限公司。DQ5UV型纯水机购于美国密理博公司，RCT basic型恒温磁力搅拌器购于德国艾卡公司，FD-A10N型台式冷冻干燥机购于冠森生物科技（上海）有限公司，Pannoramic 250 FLASH Ⅲ型数字全景扫描仪购于匈牙利3DHISTECH公司，N-C2-SIM型激光共聚焦-结构照明超分辨荧光显微镜（以下简称荧光显微镜）购于尼康仪器（上海）有限公司。

水溶性壳聚糖凝胶敷料由质量分数10%的聚乙烯醇溶液、质量分数5%的明胶溶液与水溶性壳聚糖溶液（256 μg/mL）以1∶1∶2的体积混合并通过循环冻融方式制备而成。上述溶液均以生理盐水为溶剂配制。同时，将前述0.5 mL混合溶液平铺于12孔细胞培养板（以下简称12孔板）中，再进行循环冻融可获得直径为2 cm的片状凝胶敷料，用于后续动物实验。无水溶性壳聚糖凝胶敷料的制备原料成份、配比及程序均同前，但不含水溶性壳聚糖。大体观察第1次冻融前后2种敷料流动性情况，并比较2种敷料最终形成状态的外观差异。

1.3.1 细胞增殖活力

取细胞株L929和HaCaT，分别用含有10%胎牛血清、1%青霉素链霉素混合液的DMEM高糖培养基调整细胞浓度为2×10⁴个/mL，接种于12孔板中，每孔1 mL。细胞贴壁后弃去原培养基，按照随机数字表法（分组方法下同）分别将2种细胞分为无水溶性壳聚糖敷料组（以下简称无水溶性壳聚糖组）和水溶性壳聚糖凝胶敷料组（以下简称水溶性壳聚糖组），每组3孔，分别加入1.2中制作的相应凝胶敷料。各组细胞常规培养24 h后，按照试剂盒说明书采用CCK-8试剂盒检测细胞450 nm处的吸光度值，反映细胞增殖活力。

1.3.2 溶血实验

取体积分数5%兔血红细胞悬液（生理盐水配制）加入12孔板中， 每孔1mL，分为生理盐水组、Triton X-100组、无水溶性壳聚糖组和水溶性壳聚糖组，每组3孔。生理盐水组另加入1mL生理盐水，Triton X-100组加入1 mL用生理盐水配制的终体积分数0.1%的Triton X-100溶液，无水溶性壳聚糖组和水溶性壳聚糖组分别加入1.2中制备的相应凝胶敷料。然后置于37 ℃摇床中孵育1 h，在4 ℃、1000×g离心条件下10 min。将上清液转移至96孔板，采用酶标仪测定540 nm处吸光度值，反映红细胞破裂程度即溶血程度。

本研究中实验动物符合国家和中国科学院理化技术研究所动物伦理委员会的有关规定。

1.4.1 感染创面模型建立与分组处理

取小鼠称重，使用体积分数的4%水合氯醛按照0.01 mL/g剂量进行麻醉。然后对小鼠背部进行剃毛并制造直径约为20 mm、充分覆盖背部的圆形全层皮肤缺损创面，同时避免伤及肌肉组织。对创面滴加50 μL浓度为10⁸ CFU/mL过夜培养于TSB中的MRSA菌液，然后将小鼠放回笼中，单笼饲养72 h。然后将小鼠随机分为空白对照组、磺胺嘧啶银水胶敷料组（以下简称磺胺嘧啶银组）、无水溶性壳聚糖组、水溶性壳聚糖组，每组为6只。其中，空白对照组创面不做任何处理；磺胺嘧啶银组创面覆盖磺胺嘧啶银水胶敷料；无水溶性壳聚糖组和水溶性壳聚糖组创面分别覆盖1.2中制备的相应片状凝胶敷料。

1.4.2 创面愈合情况及愈合率

伤后5 d内每日换药，后续隔天换药。伤后1、7、14、21 d，大体观察创面颜色、渗出及愈合情况。伤后7、14、21 d，采用Image J图像分析软件测量4组创面愈合面积并计算愈合率，创面愈合率=（伤后1 d创面面积-治疗后相应时间点创面面积）÷伤后1 d创面面积×100%。

1.4.3 创面中菌浓度

伤后14 d，采用一次性棉拭子对小鼠创面中心位置的菌群进行取样，并将其浸泡在1 mL生理盐水中，取0.1 mL该采样溶液均匀涂布在金黄色葡萄球菌显色培养基上，在37 ℃培养箱中倒置培养24 h后统计MRSA浓度（CFU/mL）。

1.4.4 组织学分析

伤后21 d处死小鼠，切取创面组织并固定、脱水、包埋、切片（厚度为4 µm）。部分切片进行常规HE染色，然后用数字全景扫描仪进行扫描，并在NDP图像分析软件（日本滨松光子学株式会社）上观察并截取1.25倍和2.5倍镜下图片，对其进行测量、分析。

1.4.5 新生血管情况

取1.4.4中的石蜡切片，按照常规免疫荧光染色法进行染色，其中一抗为兔重组CD31多克隆抗体（稀释比1∶400）、二抗为Alexa Fluor^TM 594标记的山羊抗兔IgG多克隆二抗（稀释比1∶1000），细胞核染色采用DAPI进行。40倍荧光显微镜下获取图像，其中蓝色荧光用来标记细胞核，红色荧光用来标记新生血管。

1.5.1 水溶性壳聚糖溶液对巨噬细胞极化的影响

在12孔板中每孔接种2×10⁴个Raw264.7细胞。分为空白对照组、IL-4组、γ干扰素+内毒素/脂多糖（LPS）组和水溶性壳聚糖溶液组，每组3孔。各组培养基分别为Raw264.7专用培养基、含有终浓度2 ng/mL IL-4的条件培养基以及含有终浓度128 μg/mL水溶性壳聚糖的条件培养基。常规培养48 h，采用藻青蛋白标记的CD206或FITC标记的CD86对细胞进行染色，通过流式细胞仪收集1×10⁴个活细胞并进行荧光强度分析。比较水溶性壳聚糖组与空白对照组、IL-4组细胞的CD206阳性细胞百分率；比较水溶性壳聚糖组与空白对照组、γ干扰素+LPS组细胞的CD86阳性细胞百分率。

1.5.2 凝胶敷料对巨噬细胞极化的影响

取Raw264.7细胞，分为空白对照组、IL-4组、γ干扰素+LPS组、无水溶性壳聚糖组以及水溶性壳聚糖组，同1.5.1对细胞进行处理，其中无水溶性壳聚糖组以及水溶性壳聚糖组添加1.2中制备的对应凝胶敷料。常规培养48 h，采用同1.5.1方法检测无水溶性壳聚糖组、水溶性壳聚糖组、空白对照组、IL-4组细胞的CD206阳性细胞百分率以及无水溶性壳聚糖组、水溶性壳聚糖组、空白对照组、γ干扰素+LPS组的CD86阳性细胞百分率。

采用SPSS 26.0软件进行数据整理和分析。符合正态分布的计量资料数据，均以表示。单时间点多组组间总体比较采用单因素方差分析，两两比价采用独立样本t检验。多时间点多组组间总体比较采用两因素重复测量方差分析；方差若齐，两两比较采用LSD检验（软件自动略去统计量值），不齐则采用Dunnetts T3比较。P<0.05为差异有统计学意义。