医疗器械生物学评价是保障医疗器械临床使用安全的核心环节，其中体外细胞毒性、皮肤致敏、皮内反应是最基础、最常规的三项试验，用于初步评估医疗器械及其材料对人体细胞、皮肤组织的潜在危害。以下结合国内外最新标准，详细介绍每项试验的标准依据、试验原理、操作方法、结果评价及注意事项，确保内容符合当前最新规范要求。

（一）最新标准依据

目前国内外体外细胞毒性试验的核心最新标准的为：

• 国内标准：GB/T 16886.5-2017《医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验》（现行有效，替代GB/T 16886.5-2003），等同采用ISO 10993-5:2009国际标准，规定了体外细胞毒性试验的通用要求、试验方法及结果评价准则，适用于各类医疗器械及材料的体外细胞毒性筛查与评估。
• 国际标准：ISO 10993-5:2009是全球范围内体外细胞毒性试验的核心参考标准，明确了试验的整体框架、样品制备、细胞选择及试验流程，强调试验方法的科学性与可重复性，国内标准与之完全等同采用，确保试验结果的国际互认性。

补充说明：该标准核心更新要点在于优化了样品浸提液的制备规范，明确了不同类型医疗器械（如固体、液体、多孔材料）的浸提条件，同时强化了细胞培养的质量控制要求，呼应了医疗器械生物学评价中“减少、替代、优化”的3R动物福利原则，优先推荐体外试验替代体内试验（需经验证可提供同等相关信息）。

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（二）试验原理

体外细胞毒性试验通过将医疗器械样品（或其浸提液）与体外培养的哺乳动物细胞接触，观察细胞的形态变化、增殖能力、代谢活性等指标，评估样品对细胞的毒性作用强度。其核心原理是：具有细胞毒性的医疗器械材料或其可沥滤物，会破坏细胞的细胞膜完整性、抑制细胞代谢或增殖，甚至导致细胞死亡，通过定量或定性检测这些细胞反应，可间接判断样品对人体细胞的潜在危害程度，是医疗器械生物相容性评价的早期筛查关键步骤，适用于各类医疗器械的初步安全性评估。

（三）试验方法（核心操作流程）

标准中明确了3类核心试验方法，可根据样品类型（固体、液体、多孔材料）选择合适方法，优先推荐浸提液试验法（定量评估），直接接触法和间接接触法多用于定性筛查，具体流程如下：

1. 试验准备

• 样品制备：按照GB/T 16886.12（等同ISO 10993-12）的要求制备样品，固体样品需裁剪成合适尺寸（避免细胞接触不均），液体样品需过滤除菌，多孔材料需进行适当预处理以去除杂质；所有样品需与临床使用状态一致（如灭菌后的样品需保留灭菌残留的合理范围），同时排除可能干扰试验结果的物质（如具有强烈刺激性的杂质）。
• 浸提液制备（核心步骤）：根据样品特性选择浸提介质（常用细胞培养液、生理盐水或芝麻油，分别对应极性和非极性可沥滤物），设定浸提条件：温度（37±1）℃，浸提时间24±2h，浸提比例（样品质量/浸提介质体积）通常为1g/10mL（可根据样品尺寸、孔隙率调整）；浸提完成后，离心、过滤除菌，获得无菌浸提液，同时制备空白对照（未加样品的浸提介质）、阳性对照（如0.1%十二烷基硫酸钠SDS溶液）、阴性对照（如高密度聚乙烯浸提液），确保对照体系的有效性。
• 细胞培养：选用标准细胞系（如L929小鼠成纤维细胞、HepG2人肝癌细胞），复苏后接种于培养板中，在37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养，至细胞汇合度达到80%-90%（对数生长期），确保细胞活性良好（活性≥90%）；优先选用人源细胞系（如人真皮成纤维细胞），可提高试验结果对人体反应的预测相关性，细胞培养过程需严格遵循无菌操作规范，避免污染影响试验结果。

2. 试验操作（以最常用的浸提液试验法为例）

• 细胞接种：将对数生长期的细胞消化、计数，调整细胞浓度至1×10⁵-5×10⁵个/mL，接种于96孔培养板，每孔100μL，培养24h，使细胞贴壁生长。
• 样品接触：吸弃培养板中的旧培养液，分别加入样品浸提液、空白对照、阳性对照、阴性对照，每孔100μL，每个组别设置3-6个平行孔，避免单一孔的误差影响结果。
• 培养孵育：将培养板置于37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱中，孵育24h、48h、72h（根据试验需求选择孵育时间，常规为24h或48h），期间每日观察细胞形态变化。
• 毒性检测：常用检测方法有两种，可根据试验需求选择：
• MTT法（代谢活性检测）：孵育结束后，每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，继续孵育4h，吸弃上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜（DMSO），振荡10min，使甲臜结晶充分溶解，用酶标仪在570nm波长处测定吸光度（OD值），计算细胞存活率（样品组OD值/空白对照组OD值×100%），量化评估细胞毒性强度，该方法可反映细胞的代谢活性，是目前最常用的定量检测方法。
• 中性红摄取法（NRU法，膜损伤检测）：通过检测细胞对中性红染料的摄取能力，评估细胞膜完整性，操作流程与MTT法类似，孵育结束后加入中性红溶液，孵育后洗涤、萃取，测定吸光度，计算细胞活性，适用于评估样品对细胞膜的损伤作用。

3. 结果评价

按照GB/T 16886.5-2017标准，根据细胞存活率或形态变化，将体外细胞毒性分为6级，具体如下：

注：医疗器械常规要求细胞毒性≤2级（中度及以下），若超过2级，需进一步开展毒理学研究，分析毒性来源（如可沥滤物成分），并优化材料配方或生产工艺；对于体外试验结果为阳性（活性≤50%）的样品，可考虑进一步开展体内试验验证刺激反应类型。

（四）注意事项

• 浸提条件需严格遵循标准，温度、时间、浸提比例的偏差会导致可沥滤物提取不充分或过度，影响试验结果准确性；对于医疗器械浸提液，需延长接触时间（37℃培养不少于18-24h），确保低浓度刺激物能被有效检测。
• 细胞培养过程需严格无菌，避免污染（细菌、真菌）导致细胞死亡，干扰毒性判断；同时需保证细胞处于对数生长期，活性良好，否则会影响试验重复性。
• 阳性对照、阴性对照、空白对照需同时设置，若阳性对照无明显毒性、阴性对照有明显毒性，试验结果无效，需重新开展试验；对照体系的OD值需符合接受准则（如阴性对照平均OD值≥0.7且<3.0，标准差≤20%）。
• 若样品本身具有颜色或荧光，会干扰吸光度检测，需提前进行脱色处理，或选择其他检测方法（如台盼蓝染色法），避免非特异性干扰；对于可能与MTT发生相互作用的样品，需设置特殊对照，校正非特异性光密度值。

（一）最新标准依据

皮肤致敏试验的最新标准已完成更新，核心依据为：

• 国内标准：GB/T 16886.10-2024《医疗器械生物学评价 第10部分：皮肤致敏试验》（现行有效，2024年8月23日发布，2025年9月1日实施），替代GB/T 16886.10-2017，等同采用ISO 10993-10:2021国际标准，核心更新在于更名为“皮肤致敏试验”，强化豚鼠最大剂量法（GPMT）的首选地位，明确局部淋巴结试验（LLNA）作为替代方法的适用条件，同时新增化学表征优先原则，要求通过材料化学分析初步排除致敏物，减少动物试验用量，更贴合3R动物福利原则。
• 国际标准：ISO 10993-10:2021是全球皮肤致敏试验的核心规范，明确了体内、体外两种试验路径，强调试验设计的科学性和结果的准确性，国内标准与之完全等同，确保试验结果的国际互认性，同时引用ISO 10993-1、ISO 10993-2、ISO 10993-12等相关标准，形成完整的试验体系。

（二）试验原理

皮肤致敏是指医疗器械材料及其可沥滤物接触皮肤后，诱发的免疫系统介导的迟发型超敏反应（Ⅳ型超敏反应），试验核心原理是：将样品（或其浸提液）反复接触动物皮肤（或体外皮肤模型），观察皮肤是否出现红斑、水肿等过敏反应，或通过检测免疫细胞活性（如淋巴细胞增殖），评估样品的致敏潜能。该试验模拟人体长期接触医疗器械的场景，预测样品对人体皮肤的致敏风险，尤其适用于与人体皮肤直接、长期接触的医疗器械（如敷料、导管、皮肤贴剂等），其核心是检测T细胞介导的免疫应答反应，灵敏度是关键评价指标之一。

（三）试验方法（核心两种路径，优先体内试验，体外试验为替代方案）

GB/T 16886.10-2024明确两种试验路径，体内试验以豚鼠最大剂量法（GPMT）为首选，体外试验以局部淋巴结试验（LLNA）为主要替代方法，具体操作流程如下：

路径1：体内试验（豚鼠最大剂量法，GPMT，首选方法）

该方法是灵敏度最高的动物致敏试验模型，核心流程分为预试验和主试验，具体如下：

1. 试验准备

• 动物选择：选用健康的白色豚鼠（体重300-500g，雌雄各半或单一性别），每组至少10只，同时设置对照组（阴性对照：无致敏性材料，如生理盐水；阳性对照：已知致敏物，如2,4-二硝基氯苯DNCB）；动物需适应环境3-5d，确保无皮肤疾病、无免疫异常，严格遵循动物福利要求，减少动物痛苦，符合GB/T 16886.2（等同ISO 10993-2）的动物福利规范。
• 样品制备：按照GB/T 16886.12要求制备样品浸提液（浸提介质、条件与体外细胞毒性试验一致），固体样品可直接裁剪成合适尺寸（与皮肤接触面积匹配），液体样品可直接使用（需过滤除菌）；预试验需制备梯度浓度的浸提液，用于确定主试验的适宜浓度。
• 皮肤预处理：试验前24h，将豚鼠背部脊柱两侧皮肤脱毛（脱毛面积每侧约2cm×3cm），脱毛后检查皮肤，确保无损伤、无红斑、无水肿，避免皮肤损伤影响试验结果判读；激发阶段可采用10%十二烷基硫酸钠（SDS）预处理皮肤，增强皮肤通透性，提高试验灵敏度。

2. 预试验（关键步骤）

目的：确定主试验中不产生刺激毒性但能诱发敏感性的最高样品浓度，避免因浓度过高导致皮肤刺激，干扰致敏反应判断。

方法：选取至少3只豚鼠，在脱毛部位贴敷不同梯度浓度的样品浸提液（或样品），封闭接触24h，去除样品后，观察24h、48h皮肤反应，选择在诱导阶段仅引起轻度红斑（Magnusson-Kligman评分1级）、且激发阶段不干扰结果判读的浓度作为主试验浓度。

3. 主试验操作（核心三步：诱导-激发-观察）

1. 诱导阶段（致敏阶段）：将预试验确定的适宜浓度样品浸提液（或样品）与弗氏完全佐剂（FCA）乳化（增强免疫应答，提高弱致敏物的检出率），在豚鼠背部脱毛区进行皮内注射（肩胛区），每点注射0.1mL，共注射4-6点；注射后7d、14d，重复注射1次（加强致敏），期间观察动物皮肤有无异常反应，同时记录动物的一般状态（饮食、活动等）。
2. 激发阶段：诱导结束后14d，在豚鼠腹部脱毛区（未进行诱导注射的部位）贴敷样品浸提液（或样品），封闭接触24h，对照组同步贴敷阴性对照、阳性对照，操作与诱导阶段一致。
3. 观察记录：去除样品后，分别在24h、48h、72h观察并记录皮肤反应（红斑、水肿），采用Magnusson-Kligman分级标准进行评分，同时记录反应出现的时间、持续时间及消退情况；若试验组动物出现反应的数量多于对照组，但反应强度未超过对照组，需在首次激发后1-2周进行再次激发，明确致敏反应。

路径2：体外试验（局部淋巴结试验，LLNA，替代方法）

适用于无法开展体内动物试验（如伦理限制）或样品不适宜体内试验的场景，核心是检测样品对淋巴结淋巴细胞的增殖作用，反映免疫致敏潜能，具体流程如下：

1. 动物选择：选用健康小鼠（体重20-25g），每组至少5只，设置阴性对照、阳性对照。
2. 样品接触：将样品浸提液（梯度浓度）涂抹于小鼠耳郭内侧，每日1次，连续3d，每次涂抹量一致（约20μL）。
3. 淋巴细胞增殖检测：末次涂抹后3d，处死小鼠，取耳后淋巴结，制备淋巴细胞悬液，加入3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR），孵育后检测放射性强度（CPM值），计算刺激指数（SI=样品组CPM值/阴性对照组CPM值）。
4. 结果判断：SI≥3时，判定为阳性（具有致敏性）；SI<3时，判定为阴性（无致敏性），该方法可定量评估致敏强度，且无需观察皮肤反应，更符合动物福利要求，但需验证其与体内试验结果的相关性。

4. 结果评价（体内试验核心评价标准）

采用Magnusson-Kligman分级标准（0-3级），量化激发后24h、48h、72h的红斑与水肿程度，结合致敏率（出现致敏反应的动物数/总动物数×100%），判断样品致敏性，具体分级如下：

• 0级：无反应，皮肤无红斑、无水肿，与正常皮肤一致；
• 1级：散在红斑，皮肤轻微发红，无水肿；
• 2级：中度融合红斑，皮肤明显发红，伴有轻微水肿；
• 3级：重度红斑伴水肿，皮肤严重发红、肿胀，可能出现水疱、糜烂。

评价结论：

• 阴性：对照组动物评分<1级，试验组所有动物评分<1级，致敏率为0；
• 弱阳性：试验组致敏率10%-30%，或少数动物出现1级反应；
• 阳性：试验组致敏率≥30%，或多数动物出现2级及以上反应；
• 强阳性：试验组致敏率≥60%，或多数动物出现3级反应（水疱、糜烂）。

注：医疗器械常规要求无致敏性（阴性），若为弱阳性及以上，需进一步分析致敏成分，优化材料或开展人体斑贴试验验证（附录E提供人体皮肤刺激试验相关信息），确保临床使用安全；同时需结合化学表征结果，排除已知致敏物，减少试验误差。

（四）注意事项

• 动物皮肤预处理后，需确保皮肤无损伤，若有损伤需更换动物，避免皮肤损伤被误判为致敏反应；激发阶段的皮肤预处理（如SDS处理）需控制浓度和时间，避免过度刺激影响结果。
• 样品浸提液的浓度需严格遵循预试验确定的适宜浓度，浓度过高可能导致皮肤刺激，浓度过低可能无法诱发致敏反应，影响试验灵敏度；浸提液需新鲜制备，避免可沥滤物降解或变质。
• 观察时间需严格遵循24h、48h、72h，部分样品的致敏反应可能延迟出现，需延长观察至7d，确保无遗漏；同时记录动物的一般状态，若出现体重下降、活动异常等情况，需及时排查原因。
• 体外LLNA试验需严格控制放射性物质的使用和处理，避免环境污染和人员伤害；同时需保证淋巴细胞悬液的制备质量，避免细胞死亡影响增殖检测结果。
• 试验需遵循GLP（良好实验室规范）或ISO/IEC 17025要求，确保试验过程可追溯、结果可重复；同时遵守动物福利相关规则，优化试验设计，减少动物用量。

（一）最新标准依据

皮内反应试验属于刺激试验的重要组成部分，最新核心标准依据为：

• 国内标准：GB/T 16886.23-2023《医疗器械生物学评价 第23部分：刺激试验》（现行有效，2023年11月27日发布，2024年12月1日实施），等同采用ISO 10993-23:2021国际标准，该标准专门涵盖皮内（皮肤内）途径的动物刺激试验，明确了试验的具体要求、操作流程及结果评价，替代了原标准中分散的皮内反应相关内容，核心更新在于强化了试验材料的排除原则，优化了试验步骤和结果评价体系，同时强调体外替代试验的优先性（经验证可提供同等信息时），贴合3R动物福利原则。
• 国际标准：ISO 10993-23:2021明确皮内反应试验是评估医疗器械材料直接注入皮肤组织后刺激反应的核心方法，适用于与人体皮肤、黏膜直接接触，或可能进入皮肤组织的医疗器械（如注射类器械、植入类器械、皮肤缝合线等），国内标准与之完全等同，确保试验结果的科学性和国际互认性，同时引用ISO 10993-1、ISO 10993-2等相关标准，形成完整的刺激试验体系。

（二）试验原理

皮内反应试验通过将医疗器械样品浸提液（或样品本身）直接注入动物皮内，观察注射部位及周围组织的炎症反应（如红斑、水肿、硬结、坏死等），评估样品对皮肤真皮层及皮下组织的刺激强度。其核心原理是：具有刺激性的样品或其可沥滤物，会刺激皮肤真皮层的炎症细胞（如中性粒细胞、巨噬细胞）浸润，引发局部炎症反应，反应强度与样品的刺激性呈正相关。该试验模拟样品意外进入人体皮内（如注射、植入）的场景，预测样品对人体皮下组织的潜在刺激风险，是注射类、植入类医疗器械的必做试验之一，与皮肤致敏试验的核心区别的是，皮内反应主要评估非免疫介导的局部炎症刺激，而非免疫致敏反应。

（三）试验方法（核心操作流程）

1. 试验准备

• 动物选择：选用健康的新西兰白兔（体重2.0-3.0kg），每组至少3只，同时设置对照组（阴性对照：生理盐水；阳性对照：0.1%SDS溶液）；动物需适应环境3-5d，确保无皮肤疾病、无免疫异常，严格遵循GB/T 16886.2（等同ISO 10993-2）的动物福利要求，减少动物痛苦，避免使用具有免疫缺陷的动物。
• 样品制备：按照GB/T 16886.12要求制备样品浸提液（浸提介质：生理盐水或细胞培养液，浸提条件：37±1℃，24±2h，浸提比例1g/10mL），过滤除菌后备用；固体样品需制成混悬液（与生理盐水混合，超声分散均匀），液体样品可直接稀释至适宜浓度；需排除可能干扰试验结果的试验材料（如具有强烈刺激性、腐蚀性的物质），避免此类物质导致的假阳性反应。
• 皮肤预处理：试验前24h，将白兔背部脊柱两侧皮肤脱毛（脱毛面积每侧约5cm×5cm），脱毛后检查皮肤，确保无损伤、无红斑、无水肿，避免皮肤损伤影响试验结果判读；脱毛后用生理盐水清洁皮肤，自然晾干，避免残留清洁剂刺激皮肤。

2. 试验操作

1. 注射操作：用1mL注射器，在白兔背部脱毛区选取对称的注射点（每侧至少5个点，样品组、阴性对照组、阳性对照组各5个点，间距≥1cm），每个注射点皮内注射0.1mL样品浸提液（或混悬液、液体样品），对照组同步注射阴性对照、阳性对照，注射时确保针头进入皮内（避免注入皮下脂肪层），注射后皮肤会形成一个小丘疹（直径约3-5mm），若丘疹立即消失，说明注射部位不当，需重新注射。
2. 观察记录：注射后，分别在24h、48h、72h观察并记录每个注射点的反应，重点观察红斑、水肿、硬结、坏死、溃疡等情况，采用标准评分体系（0-4级）进行评分，同时记录反应出现的时间、持续时间及消退情况；必要时可延长观察至7d，确保无延迟性刺激反应。

3. 结果评价

按照GB/T 16886.23-2023标准，采用以下评分体系（0-4级），结合平均评分，判断样品的皮内刺激强度，具体如下：

评价方法：计算每组所有注射点的红斑平均评分和水肿平均评分，总平均评分=（红斑平均评分+水肿平均评分）/2，根据总平均评分判断刺激强度：

• 无刺激：总平均评分≤0.5级；
• 轻微刺激：总平均评分0.6-1.9级；
• 中度刺激：总平均评分2.0-3.4级；
• 重度刺激：总平均评分≥3.5级。

注：医疗器械常规要求皮内反应为无刺激或轻微刺激（总平均评分≤1.9级），若为中度及以上刺激，需进一步分析刺激成分，优化材料配方或生产工艺，必要时开展体外替代试验（如RhE模型试验）进一步验证；若体外RhE模型试验结果为非刺激物（活性>50%），可辅助判断样品无明显刺激作用。

（四）注意事项

• 注射时需确保针头进入皮内，避免注入皮下脂肪层（会导致样品扩散，影响局部反应观察）；注射速度需缓慢（0.1mL/10s），避免过快导致皮肤损伤，若注射后丘疹立即消失，需重新注射，确保注射部位准确。
• 样品浸提液需无菌、无杂质，避免细菌污染导致局部炎症，干扰试验结果；混悬液需超声分散均匀，避免颗粒过大导致注射困难或局部刺激异常，同时需保证浸提液的浓度与临床使用状态一致。
• 观察时需避开光照直射，避免光线影响红斑颜色的判断，同时需记录每个注射点的具体反应，避免遗漏；若出现坏死、溃疡，需记录范围和深度，作为后续评价的重要依据。
• 动物需单独饲养，避免相互抓挠注射部位，导致皮肤损伤，干扰试验结果；同时观察动物的一般状态（饮食、活动、体重），若出现异常，需及时排查原因（如样品毒性、感染等），必要时终止试验并重新开展。
• 试验需遵循GLP或ISO/IEC 17025要求，确保试验过程可追溯、结果可重复；同时优先考虑体外替代试验（如RhE模型），经验证可提供同等相关信息时，可替代体内皮内反应试验，减少动物用量，贴合3R动物福利原则。

体外细胞毒性、皮肤致敏、皮内反应是医疗器械生物学评价的常规基础试验，三者分工明确、相互补充，核心总结如下：

• 体外细胞毒性试验：核心评估样品对人体细胞的潜在毒性（代谢抑制、细胞死亡），是早期筛查试验，优先采用浸提液MTT法，标准核心为GB/T 16886.5-2017（等同ISO 10993-5:2009），要求毒性≤2级。
• 皮肤致敏试验：核心评估样品诱发人体皮肤迟发型超敏反应的潜能，首选豚鼠最大剂量法（GPMT），体外LLNA法为替代方案，标准核心为GB/T 16886.10-2024（等同ISO 10993-10:2021），要求无致敏性（阴性）。
• 皮内反应试验：核心评估样品对人体皮下组织的局部刺激反应，属于刺激试验的重要组成部分，标准核心为GB/T 16886.23-2023（等同ISO 10993-23:2021），要求无刺激或轻微刺激（总平均评分≤1.9级）。

共性要求：三项试验均需遵循GB/T 16886.1（等同ISO 10993-1）的风险管理原则，样品制备需符合GB/T 16886.12（等同ISO 10993-12）要求，动物试验需遵循GB/T 16886.2（等同ISO 10993-2）的动物福利原则，试验过程需符合GLP或ISO/IEC 17025要求，确保试验结果的科学性、准确性和可重复性，为医疗器械临床使用安全提供核心数据支撑；同时均强调体外替代试验的优先性，在经验证可提供同等相关信息时，优先采用体外试验替代体内试验，减少动物用量，贴合国际3R动物福利趋势。