随着人口老龄化、过度肥胖、久坐不动等因素的影响，全球2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患病人数持续增加[1]。最新数据显示，2022年全球约有8.28亿成年人糖尿病患者，2050年成年人糖尿病患者预计达到13.1亿人[2]。中国成年人糖尿病患者总人数为1.48亿，占全球总患者人数的17.9%，同时约有3.5亿人处于糖尿病前期[3]。长期高血糖会导致肾病、视网膜病变和神经病变等微血管并发症以及动脉粥样硬化、冠状动脉疾病等大血管并发症，全球用于糖尿病的医疗支出已超过9 660亿美元[4]。由于T2DM致死率和致残率高，患病人群庞大，目前已成为全球公共卫生问题[5]。

肝脏是胰岛素重要的外周靶器官，胰岛素直接刺激肝糖原合成和间接抑制糖异生，从而减少肝葡萄糖的产生（hepatic glucose production，HGP）[6]。己糖激酶（hexokinase，HK）和葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6PC）分别是糖酵解和糖异生过程的限速酶[7]。叉头框蛋白1（forkhead box O1，FOXO1）是一种胰岛素应答转录因子，在禁食状态下，FoxO1被去磷酸化激活并易位到细胞核中，导致G6PC转录水平增加，同时抑制葡萄糖激酶（glucokinase，GK）的表达[8]。病理状态下，肝脏门静脉血流中高浓度葡萄糖触发Kupffer细胞（Kupffer cells，KCs）激活Toll样受体信号通路，通过髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）途径调控核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）活化，释放促炎因子如白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），引发胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）、糖异生和细胞增殖，导致肝细胞代谢紊乱[9]。

青蒿为菊科植物黄花蒿Artemisia annuaL.的地上部分，味苦、辛，性寒，归肝胆经，具有清透虚热、凉血除蒸、解暑、截疟的功效[10]。青蒿素是存在于黄花蒿中的倍半萜内酯类化合物，其衍生物主要包括青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿乙醚和双氢青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）等。研究发现，青蒿琥酯通过抑制NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）/消皮素D（gasdermin D，GSDMD）通路，抑制胰腺β细胞焦亡，从而发挥抗糖尿病的作用[11]；青蒿琥酯通过调控细胞衰老相关蛋白1（sirtuin 1，SIRT1）表达，进而激活NF-κB通路，保护胰腺细胞免受细胞因子诱导的损伤[12]；DHA通过增强内质网应激促进棕榈酸酯诱导的β细胞凋亡[13]。研究证实DHA是所有青蒿素类化合物的活性代谢物，可通过抗氧化、抗炎、调节免疫、自噬、糖脂代谢治疗糖尿病肾病[14]。鉴于现有报道大多聚焦在青蒿素类药物改善糖尿病胰岛素抵抗、保护胰岛细胞方面，鲜有对肝脏糖代谢和炎症的深入研究。故本研究通过建立高糖高脂饲料喂养联合ip链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的T2DM小鼠模型和高浓度胰岛素诱导的肝细胞胰岛素抵抗模型（IR-HepG2），从体内、外实验综合评价DHA药效，并进一步探讨DHA改善肝组织糖代谢紊乱和炎症反应的作用机制。

1 材料

1.1 动物

1.2细胞

人肝癌细胞系HepG2细胞购自中国科学院上海细胞库，用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM高糖完全培养基培养。

1.3 药品与试剂

1.4仪器

2 方法

2.1 T2DM小鼠造模、分组与给药

C57BL/6J小鼠适应性喂养1周后，随机选取10只作为对照组，喂养普通饲料；其余小鼠喂养高糖高脂饲料4周后，禁食（不禁水）12 h，连续3 d ip STZ（40 mg/kg），对照组小鼠ip等体积的0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 4.2～4.4）。造模72 h和1周后，连续2次检测空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）＞11.1 mmol/L即为造模成功。将造模成功的小鼠随机分为模型组、二甲双胍（200 mg/kg）组和DHA低、中、高剂量（30、60、120 mg/kg）组[15]，每组6只。DHA粉末溶于0.5%羧甲基纤维素钠溶液中，研钵研磨至均匀细腻乳白色。各给药组ig相应药物（10 mL/kg），对照组和模型组ig等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液，1次/d，连续给药4周。给药结束后，小鼠摘眼球取血，无菌条件下快速摘取肝脏、胰腺组织，分装于1.5 mL的EP管中，于−80 ℃冰箱保存。

2.2 观察指标

2.2.1 体质量、血糖监测给药期间，每周检测1次小鼠FBG和体质量。

2.2.2口服葡萄糖耐量实验（oral glucose tolerance test，OGTT）小鼠禁食8 h，ig 20%葡萄糖溶液（2 g/kg），分别于0、15、30、60、120 min检测血糖，并计算曲线下面积（area under curve，AUC）。

2.2.3 胰岛素抵抗指数（homeostatic model assessment for insulin resistance，HOMA-IR）的测定采用ELISA试剂盒检测小鼠血清胰岛素水平，并计算HOMA-IR。

HOMA-IR＝FBG×空腹胰岛素/22.5

2.2.4 肝功能指标检测采用全自动生化分析仪检测小鼠血清中ALT和AST活性。称定小鼠体质量和肝脏质量，计算肝脏指数。

肝脏指数＝肝脏质量/体质量

2.2.5血脂水平和肝脏组织中炎症因子水平的检测采用生化试剂盒检测小鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。称取适量肝脏组织于2 mL EP管中，加入9倍量预冷的PBS缓冲液，60 Hz匀浆2 min（间隔30 s），4 ℃、1 500×g离心10 min，取上清100 μL，按照ELISA试剂盒说明书检测肝脏组织匀浆中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

2.2.6 胰岛、肝脏组织病理学分析取胰腺组织，进行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，观察各组小鼠胰岛细胞数量和形态的病理改变。取肝脏组织，经石蜡包埋或OCT包埋后，通过HE染色观察各组小鼠肝脏组织的病理学改变，通过PAS染色观察各组小鼠肝脏组织糖原合成情况，通过油红O染色观察肝脏脂质堆积情况。

2.2.7 免疫组化法检测肝脏组织F4/80表达取肝脏组织切片，经10%中性福尔马林固定后，脱蜡至水，柠檬酸钠抗原修复液加热修复2次，5 min/次。免疫组化笔画圈，TBS清洗3次，5 min/次。用血清37 ℃封闭1 h，滴加一抗F4/80（1∶500），4 ℃孵育过夜，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，DAB显色45 s，苏木素复染，乙醇梯度脱水，中性树胶封片，晾干后在显微镜下观察F4/80的阳性表达情况。

2.2.8Western blotting检测肝脏组织中糖代谢和炎症信号通路蛋白表达取肝脏组织20 mg，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，匀浆裂解后，12 000 r/min离心10 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入5%脱脂牛奶，室温封闭2 h，分别加入F4/80（1∶2 500）、NF-κB（1∶2 500）、MyD88（1∶2 500）、FOXO1（1∶3 000）、HK2（1∶2 000）、G6PC（1∶2 000）、GAPDH（1∶3 000）、β-actin（1∶3 000）一抗，4 ℃孵育过夜。次日，TBST洗膜6次，每次5 min，加入二抗（1∶5 000），37 ℃孵育2 h，TBST洗涤后显影曝光，采用Image Lab软件分析条带灰度值。

2.3 DHA对IR-HepG2细胞葡萄糖代谢的影响

2.3.1 IR-HepG2细胞模型的建立为考察胰岛素的最佳造模浓度，HepG2细胞以5×104个/孔接种于96孔板中，分别加入含有1×10−5、1×10−6、1×10−7、1×10−8、1×10−9mol/L胰岛素的培养基，对照组加入空白培养基，孵育36 h后，按照试剂盒说明书检测细胞培养上清中葡萄糖含量。为考察胰岛素造模的最佳损伤时间，HepG2细胞以5×104个/孔接种于96孔板中，加入含有1 μmol/L胰岛素的培养基，对照组加入空白培养基，分别孵育12、24、36、48 h，按照试剂盒说明书检测细胞培养上清中葡萄糖含量，并计算葡萄糖消耗量。

葡萄糖消耗量＝对照组葡萄糖含量－模型组葡萄糖含量

2.3.2 IR-HepG2模型稳定性考察按照“2.3.1”项下筛选出的胰岛素最佳造模浓度和损伤时间，建立IR-HepG2细胞模型后，弃去旧培养基，加入不含胰岛素的DMEM完全培养基，继续培养细胞24、36、48、72 h，按照试剂盒说明书检测细胞培养上清中葡萄糖含量，并计算葡萄糖消耗量，考察模型稳定性。

2.3.3 DHA和3-BrPA对HepG2细胞存活率的影响HepG2细胞以5×104个/孔接种于96孔板中，分别加入不同浓度（6.25、12.50、25.00、50.00、75.00、100.00、150.00、200.00 μmol/L）的DHA或不同浓度（20、40、50、60、70、80 μmol/L）的3-BrPA，对照组加入不含药物的培养基，孵育12 h后，采用CCK-8法测定各组吸光度（A）值，并计算细胞存活率。

细胞存活率＝(A实验－A空白)/(A对照－A空白)

2.3.4 DHA和3-BrPA干预对HepG2细胞葡萄糖消耗的影响HepG2细胞以5×104个/mL接种于12孔板中，待细胞贴壁后，设置对照组、模型组、二甲双胍（2 mmol/L）组和DHA（1.25、2.50、5.00 μmol/L）组。除对照组外，其余各组加入含有1 μmol/L胰岛素的培养基处理36 h建立IR-HepG2细胞模型，在造模24 h时，加入二甲双胍或DHA干预12 h，对照组加入空白培养基。按照试剂盒说明书检测细胞培养上清中葡萄糖含量，并计算葡萄糖消耗量。

HepG2细胞以5×104个/mL接种于12孔板中，待细胞贴壁后，设置对照组、模型组、3-BrPA（60 μmol/L）组、DHA（2.5 μmol/L）组和3-BrPA＋DHA组。除对照组外，其余各组加入含有1 μmol/L胰岛素的培养基处理36 h建立IR-HepG2细胞模型，在造模24 h时，加入3-BrPA或DHA继续干预12 h，对照组加入空白培养基。按照试剂盒说明书检测细胞培养上清中葡萄糖含量，并计算葡萄糖消耗量。

2.4 统计学分析

采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析，数据以

表示。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），以LSD检验方法进行组间两两比较，最后用Graphpad Prism 9软件绘图。

3 结果

3.1 DHA对T2DM小鼠体质量和糖代谢的影响

如图1-A、B所示，与对照组比较，模型组小鼠体质量显著降低（P＜0.05、0.01），FBG显著升高（P＜0.001）；与模型组比较，给药4周后DHA高剂量组小鼠体质量显著升高（P＜0.05），二甲双胍和DHA中、高剂量组FBG显著降低（P＜0.05、0.01），表明DHA能够降低T2DM小鼠体质量和FBG。如图1-C、D所示，与对照组比较，模型组小鼠AUC面积显著增加（P＜0.001）；与模型组比较，各给药组小鼠AUC面积均显著减少（P＜0.05、0.01），表明DHA可改善T2DM小鼠糖耐量损伤，维持血糖平衡。

3.2 DHA对T2DM小鼠肝功能、肝脏指数和HOMA-IR的影响

如图2-A、B所示，与对照组比较，模型组小鼠血清中ALT、AST活性和肝脏指数显著升高（P＜0.01、0.001）；与模型组比较，DHA高剂量组小鼠血清中ALT活性和肝脏指数显著降低（P＜0.05），DHA中、高剂量组小鼠血清中AST活性显著降低（P＜0.05），表明DHA对T2DM小鼠具有肝保护作用。如图2-C、D所示，与对照组比较，模型组小鼠肝脏指数和HOMA-IR显著升高（P＜0.001）；与模型组比较，DHA高剂量组小鼠肝脏指数显著降低（P＜0.05），二甲双胍组和DHA中、高剂量组HOMA-IR显著降低（P＜0.01、0.001），表明DHA对T2DM小鼠具有抗IR作用。

3.3 DHA对T2DM小鼠血脂水平的影响

如图3所示，与对照组比较，模型组小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平显著升高（P＜0.001），HDL-C水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠血清中TG水平显著降低（P＜0.05、0.001），二甲双胍组和DHA中、高剂量组小鼠血清中HDL-C水平显著升高（P＜0.05、0.01），表明DHA可改善T2DM小鼠TG、HDL-C水平异常。

3.4 DHA对T2DM小鼠胰岛组织病理变化的影响

如图4所示，对照组小鼠胰岛细胞边界清晰，无萎缩；与对照组比较，模型组小鼠胰岛β细胞破坏严重，细胞结构紊乱，腺泡间脂肪细胞浸润，胰岛面积显著减少（P＜0.001）；与模型组比较，各给药组小鼠胰岛细胞胰腺腺泡增生和空泡现象减少，其中二甲双胍组和DHA中、高剂量组小鼠胰岛面积显著增加（P＜0.01、0.001），表明DHA可通过改善胰岛β细胞形态，增大胰岛面积，减少T2DM小鼠胰岛组织损伤。

3.5 DHA对T2DM小鼠肝脏组织病理变化和炎症反应的影响

如图5所示，HE染色结果显示，对照组小鼠肝细胞呈辐射状分布，结构完整；与对照组比较，模型组小鼠肝细胞肿大，排列紊乱；与模型组比较，各给药组小鼠肝细胞脂滴空泡现象减少，细胞皱缩和坏死减少。PAS染色结果显示，模型组小鼠肝脏中紫色颗粒分布稀疏，颜色较浅，糖原含量减少；与模型组比较，各给药组小鼠肝脏中紫色颗粒增加且分布均匀。油红O染色结果显示，模型组小鼠肝脏中油红O染色深，脂滴聚集较多；与模型组比较，各给药组小鼠肝细胞脂滴分布减少。以上结果表明DHA可减少T2DM小鼠肝细胞损伤，增加肝糖原含量，降低脂质堆积。

如图6-A～C所示，与对照组比较，模型组小鼠肝组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高（P＜0.01、0.001）；与模型组比较，DHA中、高剂量组IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著降低（P＜0.05、0.01、0.001），DHA低剂量组IL-1β、TNF-α水平显著降低（P＜0.01、0.001），二甲双胍组TNF-α水平显著降低（P＜0.01）。如图6-D所示，对照组小鼠肝组织F4/80阳性表达的巨噬细胞数较少，模型组肝组织F4/80阳性表达的巨噬细胞多处聚集；与模型组比较，各给药组小鼠肝组织F4/80阳性表达减少。以上结果表明DHA通过抑制促炎因子表达和巨噬细胞聚集，缓解T2DM小鼠肝脏炎症反应。

3.6 DHA对T2DM小鼠肝组织中糖代谢和炎症信号通路相关蛋白表达的影响

如图7所示，与对照组比较，模型组小鼠肝组织中FOXO1、G6PC蛋白表达水平显著升高（P＜0.001），HK2蛋白表达水平显著降低（P＜0.001）；与模型组比较，各给药组FOXO1、G6PC蛋白表达水平显著降低（P＜0.01、0.001），DHA高剂量组HK2蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。表明DHA通过上调HK2表达促进糖代谢，抑制FOXO1、G6PC表达减少糖异生，进而减少肝脏葡萄糖输出。

如图8所示，与对照组比较，模型组小鼠肝组织中NF-κB、MyD88、F4/80蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，各给药组F4/80蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01），DHA各剂量组MyD88蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01），DHA高剂量组NF-κB蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。表明DHA通过抑制MyD88/NF-κB通路，缓解T2DM小鼠肝脏炎症，进而改善其糖代谢紊乱。

3.7 IR-HepG2细胞模型的建立

如图9-A所示，HepG2细胞分别给予1×10−5、1×10−6、1×10−7、1×10−8、1×10−9mol/L胰岛素处理36 h后，葡萄糖消耗量呈剂量相关性地减少（P＜0.01、0.001）。如图9-B所示，HepG2细胞给予1 μmol/L胰岛素处理36、48 h后，葡萄糖消耗量显著减少（P＜0.01）。如图9-C所示，HepG2细胞给予1 μmol/L胰岛素处理36 h后，更换为不含胰岛素的DMEM完全培养基，继续培养24、36、48 h，葡萄糖消耗量较对照组仍具有显著性差异（P＜0.05、0.01），表明本研究建立的IR-HepG2细胞模型在48 h内具有稳定性。

3.8 DHA及3-BrPA对IR-HepG2细胞模型葡萄糖消耗量的影响

如图10-A所示，DHA浓度≤75.00 μmol/L时，对HepG2细胞存活率无显著影响，故采用小剂量（1.25、2.50、5.00 μmol/L）DHA进行后续研究。如图10-B所示，与模型组比较，二甲双胍组和DHA（2.50、5.00 μmol/L）组葡萄糖消耗量显著增加（P＜0.05、0.01）。如图10-C所示，HepG2细胞给予20～60 μmol/L 3-BrPA干预后，细胞存活率均大于85%，故选择最大剂量60 μmol/L抑制HK2靶点，从而验证药效。如图10-D所示，与模型组比较，加入HK2抑制剂3-BrPA后，葡萄糖消耗量显著减少（P＜0.01）；给予DHA处理后，葡萄糖消耗量显著增加（P＜0.05）；给予3-BrPA和DHA联合处理后，相比于DHA单独处理组，葡萄糖消耗量有所减少，表明DHA促进了葡萄糖消耗。