引言：中链羧酸盐的生物合成机制与挑战

中链羧酸盐（MCCs）是指碳链长度为6-12个碳原子的直链脂肪族羧酸，在精细化工领域具有广泛应用价值，包括人工香料、橡胶化学品、清漆干燥剂、树脂、增塑剂和药物制剂等。传统MCCs生产依赖于化石资源或植物源碳源，通过醛类或长链脂肪酸氧化实现。然而，利用可再生资源通过微生物链 elongation 技术实现可持续生产已成为新兴替代方案。微生物生产不仅能够从废弃物中回收资源，还可利用现有厌氧消化设备而无需重大改造，使得生物源MCCs在精细化学品和运输燃料市场具有巨大潜力。

在众多MCCs中，n-己酸（n-己酸盐，C₆）因其可通过Kolbe电解转化为更长链烃类而备受关注，具有生产"drop-in"燃料的潜力。已知的n-己酸生产菌株包括Megasphaera elsdenii、Caproiciproducens spp.和Clostridium kluyveri，这些细菌通常通过反向β-氧化（r-BOX，也称为RBO）途径产生n-己酸。然而，由于这些菌株的基因组信息无法明确区分n-丁酸盐（C₄）、n-己酸盐和n-辛酸盐的合成机制，导致中链羧酸的生产机制尚不完全清楚。

碳链延伸机制的系统解析

Megasphaera hexanoica能够以糖类作为电子供体选择性生产MCCs。研究发现，当添加丙酸盐（C₃）时，该菌株能够形成奇数碳羧酸，如n-戊酸盐（C₅）和n-庚酸盐（C₇）。同样，添加偶数碳羧酸盐（如乙酸和n-丁酸盐）可诱导n-己酸 production。当n-丁酸盐与果糖（各0.1 M）共同补充时，n-己酸产量达到6.34 g L^-1。

值得注意的是，在乙酸和n-丁酸盐共同补充条件下，n-己酸浓度最终增至10.63 g L^-1，生产力达到0.43 g L h^-1。n-丁酸盐被优先消耗（6.3 g L^-1），而乙酸盐似乎被部分消耗（1.3 g L^-1），使其在相对稳定的浓度下持续存在。当仅添加乙酸盐与果糖时，n-己酸产量从0.88 g L^-1显著增加至4.37 g L^-1，表明乙酸盐在链延伸过程中作为电子受体的有效作用。

令人惊讶的是，当外源添加n-己酸时，M. hexanoica能够将补充的MCCs进一步延伸两个碳原子生成n-辛酸盐（C₈），最终浓度达到1.15 g L^-1。与Clostridium kluyveri在优化条件下通常生产0.3-0.5 g L^-1 n-辛酸盐相比，M. hexanoica在纯培养系统中表现出更高的C₈生产效率。

通过添加¹³C标记的n-丁酸盐和未标记果糖进行同位素示踪实验，发现¹³C标记的n-丁酸盐被整合到n-己酸中，而¹³C标记同位素位于n-己酸碳链的3、4、5和6位，从羧基开始计算。n-己酸的第一和第二个碳原子为碳-12（¹²C），来源于未标记的电子供体果糖。这表明M. hexanoica中的n-己酸生产遵循链延伸规则，每次从羧酸盐的1号位同时添加两个碳原子。

n-己酸生物合成途径的基因鉴定与功能验证

通过基因组分析和转录组学研究，团队鉴定了M. hexanoica中与n-己酸合成相关的关键基因。研究发现该菌株基因组中含有8个乙酸CoA转移酶（ACT，EC 2.8.3.8），能够将短链羧酸盐转化为短链酰基-CoA，这一数量是其最近缘物种Megasphaera elsdenii的两倍。

转录组结果显示，act_567和act_347基因表现出相对较高的差异表达，这两个基因在酶功能和系统发育分类方面相似，预测它们参与MCCs和酰基-CoA之间的CoA分子转移。通过在大肠杆菌中构建线性代谢途径，研究人员评估了act基因的底物特异性。该途径涉及两个酶，能够将酰基-CoA分子转化为相应的醇类。实验结果表明，act_567、act_347和act_348在n-己酸、n-庚酸盐和n-辛酸盐转化方面表现优于其他ACTs，其中act_567表现出最高性能，甚至在n-辛醇生产方面也表现优异。

除ACTs外，转录组结果还显示与r-BOX途径相关的基因高度表达，包括硫解酶（THL）、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶（HBD）、烯酰-CoA水合酶/巴豆酸酶（CRT）、丁酰-CoA脱氢酶Etf复合物（BCDH/Etf αβ）和酰基-CoA脱氢酶（ACDH）。与n-己酸生产者M. elsdenii和C. kluyveri拥有两个以上硫解酶不同，M. hexanoica基因组中仅观察到一个硫解酶（thl_1583）。

thl_1583的转录在n-己酸生产指数期（AB9）表现出第三高的表达水平，即使在非n-己酸生产条件下（N9和N19），其表达水平也高于其他基因。然而，在n-己酸生产条件下18小时后，thl_1583的表达显著降低，导致n-己酸产量下降。

M. hexanoica基因组中包含两对hbd和crt基因：hbd、crt、crt_613、hbd_2207、crt_2206和hbd_2534。其中hbd_2207和crt_2206彼此相邻，在n-己酸生产指数期（AB9）分别表现出第二和第八高的表达水平。相比之下，crt_613和hbd_2534在所有条件下都保持低表达水平。

四个acdh基因由于高度相似性而难以明确区分，这些基因位于基因组的不同位置：acdh_56、acdh_612、acdh_2230和acdh_2251。其中acdh_2230与BCDHs密切相关，被称为bcdh_2230。特别值得注意的是，acdh_2251和bcdh_2230在n-己酸生产指数期（AB9）的转录组中分别表现出第六和第十五高的表达水平。

基于这些发现，研究团队选择了act_567、thl_1583、hbd_2207、crt_2206、bcdh_2230和acdh_2251作为M. hexanoica中n-己酸生产的关键基因，同时还包括了作为辅酶的etf αβ亚基。

β-酮硫解酶的关键作用与结构特征

研究人员构建了八种基因工程大肠杆菌菌株，测试这些候选基因的功能。实验发现，含有thl_1583、hbd_2207、crt_2206、acdh_2251和act_567的第一种质粒组合产生了最高的n-己酸产量，浓度达到1.25 g L^-1，尽管缺乏etf αβ亚基。同时，含有ter基因的菌株也生产n-己酸，但速率低于含有acdh_2251的菌株。将bcdh_2230与etf αβ组合使用时，n-己酸产量降低且偏差最大。

为了进一步验证硫解酶的重要性，研究团队比较了来自不同细菌的五种硫解酶的活性。选择Clostridium kluyveri的THL（CkTHL）作为模型n-己酸生产者；选择Ralstonia eutropha的BktB（ReBktB），因其与聚羟基烷酸酯生产相关并能够实现n-己醇或n-辛醇生产；包含来自大肠杆菌的AtoB（EcAtoB），已在合成生物学中广泛用于n-丁酸盐或n-丁醇生产；以及来自C. acetobutylicum的THL（CaTHL），是最可行的n-丁醇生产菌株。

实验结果表明，含有MhTHL的菌株比含有其他硫解酶基因的菌株产生更多的n-己酸，最终浓度达到1.25 g L^-1。正如预期的那样，含有EcAtoB或CaTHL的菌株不生产n-己酸，表明这些酶不能利用丁酰-CoA作为酰基供体。ReBktB处理产生的n-己酸浓度约为MhTHL的三分之一（0.36 g L^-1）。含有CkTHL的菌株产生与MhTHL相似水平（约0.9 g L^-1）的n-己酸。因此，MhTHL在表征的硫解酶中表现出最佳的C₆延伸性能。

结构生物学揭示的机制创新

为了确定为什么MhTHL修饰的大肠杆菌菌株能够产生n-己酸，研究团队使用其C88S变体晶体在己酰辅酶A溶液中浸泡，以1.64 ?分辨率评估了MhTHL的结构。MhTHL的单体结构包含三个特定结构域：N-结构域（残基1-117和252-272）、C-末端结构域（残基273-393）和环结构域（残基118-251）。MhTHL表现出典型的II型生物合成硫解酶折叠，在环结构域中具有四聚化基序（残基123-142）。

尽管晶体在己酰-CoA中浸泡，但在观察到的mF_o-DF_c电子密度图中，去酰化的CoA分子与MhTHL结合。根据酶促Claisen缩合的催化机制，共价催化剂C88和第二亲核试剂C382的S-to-O取代基朝向CoA分子的硫醇基团。实验X射线衍射数据显示，在C88S和G384的主链N原子之间存在显著的羧酸盐离子电子密度。

通过将MhTHL结构叠加到众所周知的硫解酶（如EcAtoB、ReBktB、CaTHL和CkTHL）的晶体结构上，研究人员发现了它们的结构差异。整体结构相对相同，α碳RMS距离分别为0.50、0.62、0.53和0.46。MhTHL中C88S氧原子的定位不同于其他硫解酶中相应半胱氨酸的硫原子，Oγ-Cβ-Cα-N二面角旋转约-37°。

MhTHL中的酰基部分结合口袋主要由疏水残基组成，如V56、L87、G147、L148和V351。MhTHL中的L87和V351以及CkTHL中相应的L87和V352比EcAtoB和CaTHL中的缬氨酸和异亮氨酸残基更大程度地调节口袋大小。就ReBktB而言，该蛋白在这些位置含有Leu89和Ile352，使口袋比CaTHL大但小于CkTHL和MhTHL。这对应于平台菌株SK-1中改变硫解酶的n-己酸生产结果。

基于这些结果，研究团队确定了MhTHL中的Leu87和Val351残基作为利用酰基-CoA分子作为酰基供体的关键残基。为了阐明这些残基是否对n-己酸生产重要，研究人员生成了MhThl^L87V、MhThl^V351I和MhThl^L87V/V351I突变基因，并在大肠杆菌SK-1细胞中异源表达，比较它们的n-己酸生产性能。所有突变体都表现出降低的n-己酸产量，表明这些残基参与了3-酮己酰-CoA的生产。值得注意的是，MhTHL^L87V/V351I显示出显著降低的己酸产量（0.04 g L^-1），与野生型MhTHL相比。因此，研究人员提出MhTHL中的Leu87和Val351残基是决定生物合成硫解酶底物特异性的关键结构特征，为M. hexanoica提供了生产n-己酸的能力。

技术应用与未来展望

本研究通过使用M. hexanoica基因建立n-己酸生产途径，解决了关于链延伸机制的问题。虽然n-己酸通常通过组合单个酶的代谢级联生产，但M. hexanoica中的r-BOX途径似乎比其他野生型细菌更复杂。

研究发现，在M. hexanoica中，n-己酸更可能通过ACT将CoA从己酰-CoA转移到乙酸盐而释放，而不是通过ACH直接水解。ACTs的这种机制与r-BOX途径的CoA回收策略一致，可能有助于维持代谢通量和氧化还原平衡。ACTs也在其他链延伸细菌中得到研究，如Clostridium tyrobutyricum和Ruminococcaceae bacterium CPB6。

通过比较结构分析发现，ACT_567在活性位点具有独特的环结构，这与来自C. tyrobutyricum和Ruminococcaceae CPB6的相应ACTs不同。这些不同的构象需要进一步研究来探索。

另一方面，大肠杆菌天然酰基-CoA硫酯酶中的tesB能够有效催化短链酰基-CoA；最终，硫酯酶具有切割酰基-CoA的混杂活性。因此，其RNA表达应在细胞内精确调控。同样，M. hexanoica中的ACTs通常保持比其他r-BOX基因更低的RNA表达，导致中间体（如3-酮己酰-CoA、巴豆酰-CoA、反式烯酰-CoA等）浓度增加。使用ACTs的羧酸盐生产可能比硫酯酶生产更有效，因为它利用细胞外乙酸盐产生一个乙酰-CoA，将长链酰基-CoA裂解形成羧酸盐和CoA。产生的乙酰-CoA可用作n-己酸生产的前体。

ACTs的CoA转移活性通过在基因工程大肠杆菌中将各种C₃-C₈脂肪酸转化为相应的醇类得到功能验证，这表明成功形成了酰基-CoA中间体。当观察ACTs的底物特异性时，发现两种转移酶（act_1929和act_519）偏爱SCCs C₃和C₄。同时，六种转移酶（act_567、act_347、act_348、act_2371、act_754和act_2459）与更长的底物（如C₆和C₇）反应，五种acts（act_567、act_347、act_348、act_2371和act_2459）将n-辛酸盐转化为n-辛醇。

通常，ACTs根据底物浓度进行可逆反应；高浓度的酰基-CoA产生相应的羧酸盐，容纳细胞外乙酸盐；因此，它们与具有不同底物范围的ACTs合作，将细胞外C₂-C₅羧酸盐与CoA结合，并通过r-BOX释放延伸的羧酸盐。通过这种方式，最终代谢物n-己酸可能与ACTs释放的底物的最大碳长度匹配。这可能解释了为什么细胞外羧酸盐（如乙酸和n-丁酸盐）持续减少，而更长链的羧酸盐（如n-己酸）在发酵实验中积累。

M. hexanoica有四个acdh基因，其中两个表现出明显高于其他的RNA表达。通常，ACDH家族包括五个成员，参与脂肪酸β-氧化；这些是短链（SCAD）、中链（MCAD）、长链（LCAD）和极长链（VLCAD1）酰基-CoA脱氢酶。参与n-丁酸盐代谢的ACDH被称为BCDH，是一种SCAD。在这项研究中，来自M. hexanoica的bcdh_2230与来自M. elsdenii的bcdh相似，具有bcdh的典型特征，携带etf αβ亚基作为辅因子。因此，预计bcdh_2230可容纳含有4-6个碳原子的直链酰基。然而，携带bcdh_2230的大肠杆菌菌株无论是否共表达辅因子都不生产n-己酸。相反，acdh_2251即使不引入辅因子基因也生产了1.25 g L^-1的n-己酸。与反式-2-烯酰-CoA还原酶（ter）相比，acdh_2251表现出约1.4倍增加的n-己酸产量。

反式-2-烯酰-CoA还原酶在大肠杆菌中无需辅因子（如etf αβ）生产MCCs；然而，遗传系统发育与acdh_2251大不相同。此外，acdh_2251在所有条件下保持高RNA表达。因此，acdh_2251直接用于n-己酸生产，并可能与BCDH在偏爱短链酰基-CoA方面发挥作用。然而，acdh_2251如何在没有辅因子的情况下在n-己酸生产中发挥作用仍不清楚。

通过AlphaFold预测模型模拟acdh_2251的结构时，发现acdh_2251似乎与大肠杆菌的天然etf αβ兼容；然而，该机制需要通过深入研究进一步 investigation。

首次尝试通过r-BOX在大肠杆菌中合成生产n-己酸确定了硫解酶是通过缩合乙酰-CoA和丁酰-CoA生产MCC的关键酶。这是通过bktb基因实现的，该基因合成C₄/C₅聚羟基烷酸酯（PHAs），导致n-己酸生产。这使我们假设与r-BOX相关的THLs在蛋白质水平上有所不同。

Bonk等人提出了一个合理框架来提高硫解酶的选择性比，定义为C₆与C₄ PHAs的比率。他们观察到，当使用合理选择的突变体时，PHAs的合成高度富集了3HHx（C₆）。突变体M158A产生的C₄/C₆ PHA含量比野生型硫解酶增加了约10倍。同时，Mann和Lutke-Eversloh（2013）生成了包含三个氨基酸（R133G、H156N和G222V）的硫解酶，优化用于溶剂生产。突变菌株延迟了乙醇和n-丁醇的形成；乙醇和n-丁醇滴度分别增加了46%和18%。这些进展展示了链延伸领域中众多研究领域的探索。

在这项研究中，确定了MhTHL的蛋白质结构，证实n-己酸生产与硫解酶中接受底物的口袋大小有关，硫解酶是r-BOX途径中的第一个酶。MhTHL的口袋大小明显大于其他参与n-丁酸盐生产的THLs。口袋大小由两个氨基酸L87和V351调节。因此，这些发现不仅提供了对M. hexanoica中n-己酸生物合成的详细酶学理解，而且为鉴定其他MCC生产菌株提供了有价值的遗传框架。

关键的r-BOX基因，包括thl_1583和控制底物特异性的特定残基，可以作为在环境或工程微生物组中筛选新型MCC生产者的可靠生物标志物。我们提出这些关键残基可用作开放培养中MCC生产的遗传指标，并作为n-己酸生产细菌的选择标记。此外，这些残基的突变体可用于增加羧酸盐大小或n-己酸生产。

尽管已经确定了MhTHL中构成底物结合口袋的关键残基，但可能需要原子分辨率的酰基-CoA结合结构来进行硫解酶的精确特异性工程。酶水解副反应阻碍了这种结构确定。我们预期同时应用使用不可水解底物的共结晶/浸泡方法和具有相对较低水解活性的酶可以实现这种结构的确定，从而有助于硫解酶工程以实现更高的碳缩合。

本研究的技术意义可以扩展到可持续生物源化学品和燃料生产的可行应用。通过M. hexanoica中短链羧酸盐（C₃-C₅）的长度可以选择性控制MCCAs的长度。值得注意的是，乙酸盐的添加促进了将CoA从己酰-CoA转移的代谢途径，从而促进了n-己酸生产和微生物生长。这些特征提供了即使在开放源培养或使用其他链延伸物种的纯培养中提高MCCs产量的策略。

此外，当通过RNA表达观察与n-己酸相关的核心基因时，发现ACTs参与了n-己酸的释放，并且它们的表达相对较低（例如，acts：5082.03 RLE）。值得注意的是，ACTs被提出作为比乙酰-CoA水解酶更有效的酶，因为它们通过将乙酸盐转化为乙酰-CoA来释放n-己酸。这些基因不仅可以有效地用于MCCs，还可以用于有价值化学品的生产。

最终，该研究突出了MhTHL的结构特征，这是合成n-己酸最重要的酶。MhTHL具有相对较大的底物容纳口袋，参与n-己酸生产，两个氨基酸决定了其大小。这些发现使得使用常见分子工具如PCR或qPCR轻松鉴定和区分MCC生产微生物成为可能。这些技术应用将有利于推动生物工业向可持续化学品和能源发展。

当前，利用深度学习算法已经开发了蛋白质结构预测工具，同时积累了经验数据。这些技术进步可以用于我们硫解酶的结构改进，并可用于提高选择性和生产力，同时积累经验数据。此外，结合代谢组学分析可以补充我们的遗传和转录组学发现，提供对己酸合成途径更全面的验证。这种综合方法不仅会增加我们研究的严谨性和可信度，还会提供对链延伸机制更深入的见解。这些未来的研究方向可以拓宽我们对链延伸机制和生物源化学品生产的知识，使我们离不使用化石源化学品的可持续社会更近一步。