上皮细胞用什么染色温故知新｜水通道蛋白3在人羊膜上皮细胞中的表达及调控

新闻资讯2026-04-23 16:05:37

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本文发表于《中华围产医学杂志》2013年第5期

引用格式：马小燕,沈奇,王晶晶,等. 水通道蛋白3在人羊膜上皮细胞中的表达及调控[J]. 中华围产医学杂志,2013,16(05)：288-293.DOI:10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2013.05.007

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马小燕沈奇王晶晶谢爱兰朱雪琼

基金项目:浙江省中医药重点研究计划(2010ZZ009);温州市科技合作计划项目(H20100067)

作者单位:325027 温州医学院附属第二医院妇产科

通信作者:朱雪琼,Email:zjwzzxq@163.com

【摘　要】

目的研究丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)/ 细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK)信号转导通路对人羊膜上皮细胞中水通道蛋白3(aquaporin,AQP3)表达的调控作用。

方法选择2011年1月至11月,在温州医学院附属第二医院产科分娩的不明原因羊水过少和羊水量正常的足月单胎妊娠产妇各10例,均为剖宫产分娩。原代培养羊膜上皮细胞,并用ERK1/2 抑制剂U0126进行处理。浓度为0、5、10、20 和40 μmol/L 的 U0126分别作用12h;再选取使磷酸化 ERK1/2表达水平最低的浓度为最佳浓度,作用于细胞0、2、6、12和24h。采用免疫细胞化学染色检测 AQP3蛋白定位,Western印迹检测总ERK1/2、磷酸化ERK1/2和AQP3蛋白表达水平。统计学方法采用t检验和方差分析。

结果 (1)羊水过少组磷酸化 ERK1/2和 AQP3的表达均低于羊水量正常组(ERK1/2:2.46±0.25与3.46±0.33;AQP3:1.56± 0.10与2.34±0.18,t=9.243和13.292,P<0.01)。(2)羊水过少组中 U0126不同浓度组间比较,总 ERK1/2表达差异无统计学意义(F=0.365,P>0.05);5、10、20、40μmol/L组磷酸化 ERK1/2和 AQP3表达均低于0μmol/L 组(磷酸化ERK1/2:0.96±0.16、1.12±0.13、0.98±0.17、1.02±0.26 与 2.46±0.25;AQP3:1.10±0.09、1.12±0.08、1.13±0.06、1.11±0.06与1.56±0.10,P<0.05);但5μmol/L 组与 10、20和 40μmol/L 组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。羊水过少组 U0126 作用的最佳浓度为 5μmol/L。该浓度作用 2h 组磷酸化 ERK1/2 和AQP3表达均低于0h组(磷酸化 ERK1/2:1.27±0.29与2.55±0.12;AQP3:1.44±0.12与2.15±0.09,P<0.05),但2h组与6、12和24h组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。最佳作用时间为2h。(3)羊水量正常组和羊水过少组产妇的羊膜上皮细胞中,胞浆及胞膜均有 AQP3蛋白阳性染色,但主要位于胞浆。U0126作用后,AQP3蛋白在羊膜上皮细胞中定位无明显改变。

结论 U0126可抑制羊水过少者的羊膜上皮细胞 ERK1/2磷酸化及 AQP3蛋白表达,提示 MAPK/ERK1/2信号转导通路可能对羊膜上皮细胞中 AQP3蛋白表达起调控作用,从而影响羊水量的平衡。

【关键词】水通道蛋白质3;细胞外信号调节 MAP激酶类;羊膜;上皮细胞;羊水过少

羊水过少是妊娠晚期的常见并发症,可导致围产儿病率及死亡率升高[1],但目前尚无有效的预防和治疗措施。近年研究发现,羊水量平衡与胎盘胎膜中水通道蛋白 (aquaporin,AQP)表达相关[2]。Wang等[3]首先在人足月妊娠的羊膜上皮细胞中发现 AQP3蛋白表达。本课题组前期研究发现,不明原因羊水过少产妇羊膜中 AQP3蛋白的表达明显低于羊水量正常的产妇[4],但其调节机制尚未明确。

Bell等[5]研究发现,在高渗条件下,丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases,MAPK)信号转导通路可调节小鼠胚胎 AQP3蛋白的表达,从而导致小鼠胚胎凋亡。U0126是细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)1 和 2 的抑制剂。Ji等[6]研究发现,U0126可抑制紫外线照射,导致皮肤角质细胞中AQP3蛋白丢失。这些研究提示 MAPK/ERK1/2信号转导通路可调节细胞 AQP3蛋白的表达,因此推测 MAPK/ERK1/2信号转导通路对人羊膜上皮细胞中 AQP3蛋白的表达有调控作用。本研究通过观察 U0126对人羊膜上皮细胞中总 ERK1/2、磷酸化 ERK1/2和 AQP3蛋白表达的影响,探索调控AQP3蛋白表达的信号转导通路,为临床有效治疗羊水过少提供实验依据和新思路。

资料与方法

一、资料来源

1.研究对象:选择2011年1月至11月,在温州医学院附属第二医院产科经剖宫产分娩的不明原因羊水过少和羊水量正常的足月单胎妊娠产妇各10例,年龄24~28岁,均为社会因素剖宫产,无催产素引产史,无药物服用史,无过期妊娠、胎儿生长受限、胎儿畸形、胎盘功能减退、胎儿缺氧及其他可能会影响羊水量的合并症和并发症。本研究经本院伦理委员会批准,所有研究对象均签署知情同意书。

2.羊水量正常与羊水过少的诊断标准:剖宫产术前 B超测量羊水指数,以脐水平线和腹白线为标志将子宫分为4个象限,测量各象限羊水池的最大垂直径线,4个象限测量值之和即为羊水指数。羊水指数8~18cm 为羊水量正常,≤5cm 为羊水过少。剖宫产术中进一步核实,300~2000ml为羊水量正常,<300ml为羊水过少[4]。剔除术中羊水总量和术前羊水指数不符合的病例。

二、研究方法

1.标本收集:剖宫产胎盘娩出后10min内,在无菌状态下取2cm×2cm 羊膜组织,用无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)和无血清培养基反复冲洗。

2.人羊膜上皮细胞原代培养:将冲洗干净的羊膜组织置于含100IU/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的培养基中浸泡20min,用眼科剪将其剪碎为1mm×1 mm×1 mm,加入无乙二胺四乙酸的0.25%胰蛋白酶消化液 37 ℃ 消化 60 min,用含10%胎牛血清的完全培养基终止消化,吹打数分钟后收集消化液,1500r/min离心20 min(离心半径149mm),弃上清,再重悬沉淀,800r/min 离心6min(离心半径149mm),弃上清,收获细胞,取小部分爬片鉴定为人羊膜上皮细胞后,沉淀中加入完全培养基,制成密度为1×105 个/ml的细胞悬液,取2ml接种于培养皿中,置于37℃、饱和湿度、5%CO2 的培养箱中,隔天换液,5~7d以 1∶2 传代1次。U0126作用前将密度为 5×105 个/ml的细胞接种于6孔培养板,细胞融合度达到90%以上后进行检测。

3.U0126的配制及分组:(1)U0126不同浓度分组:先用溶剂二甲基亚砜 (dimethyl sulfoxide, DMSO) 溶解U0126(美国Cell Signaling Technology公司),再用完全培养基配制 U0126浓度为5、10、20和40μmol/L,分别作用于羊膜上皮细胞 12 h,并设 0 μmol/L组(仅有培养基,无U0126,无 DMSO)作为对照。为了检测溶剂DMSO 是否会对蛋白表达产生干扰,另设 DMSO组(仅有DMSO,无U0126,无培养基)与 U0126浓度0μmol/L 组比较。(2)U0126不同作用时间分组:上述不同浓度 U0126作用于羊膜上皮细胞12h后,检测磷酸化 ERK1/2 的表达水平,选取使磷酸化 ERK1/2表达水平最低的 U0126浓度为最佳浓度,作用于细胞0、2、6、12、24h。

4.免疫细胞化学染色检测 AQP3蛋白定位:细胞爬片后4%甲醛固定10min,0.3%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100,上海碧云天生物技术有限公司)作用20min。3% H2O2 灭活内源性过氧化物酶10min;然后加正常山羊血清封闭 30 min;滴加1∶100稀释的兔抗人 AQP3多克隆抗体(武汉博士德公司)4 ℃孵育过夜;然后滴加生物素标记二抗工作液37℃孵育30min;再滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液37 ℃孵育10min;每步骤之后均用 PBS 漂洗。二氨基联苯胺 (diaminobenzidine,DAB)显色,苏木素复染,中性树胶封片,光镜下观察。以 PBS代替一抗作阴性对照。5.Western印迹检测蛋白表达水平:弃去培养基后用预冷的 PBS缓冲液冲洗细胞2次。每孔加入 RIPA(radio immuno-precipitation assay)裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)70μl,冰上裂解30min,14000r/min 离心 20 min(离心半径97mm),收集上清,-80 ℃储存备用,二喹啉甲酸法测定细胞提取物的蛋白质浓度。取10μg蛋白质于10% 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中电泳后,转至聚偏二氟乙烯 (polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上,于5%脱脂奶粉中封闭2h,然后分别加1∶1000 兔抗人总 ERK1/2 抗体 (美国 Cell Signaling Technology公司)、1∶1000 兔抗人磷酸化 ERK1/2 抗体 (美国 Cell Signaling Technology公司)、1∶300兔抗人 AQP3抗体、1∶1000鼠抗人α-Tubulin抗体(上海碧云天生物技术有限公司)作用,4 ℃摇床过夜。后加入相应的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔或抗鼠IgG (碧云天生物技术有限公司,1∶2000稀释于5%脱脂奶粉)室温1h,再用增强化学发光试剂(美国 Pierce公司)检测阳性信号,利用 AlphaEaseFC 软件 (美国 AlphaInnotech公司)进行灰度扫描,根据扫描结果与α-Tubulin吸光度比值计算蛋白表达水平。每例实验重复3次,取平均值。

三、统计学分析

采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析。各组计量资料均为正态分布,以均数±标准差(x췍±s)表示。羊水量正常组和羊水过少组蛋白表达水平的比较采用t检验。U0126不同浓度组间比较和不同作用时间组间比较均采用方差分析,方差齐性的多组间两两比较采用 LSD法,方差不齐的多组间两两比较采用 Dunnett′sT3法。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、一般情况

羊水量正常组和羊水过少组产妇的年龄、分娩孕周及分娩当日体重比较,差异均无统计学意义,见表1。

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二、2组产妇羊膜上皮细胞中总 ERK1/2、磷酸化 ERK1/2和 AQP3的表达水平

1.无 U0126作用时的蛋白表达:羊水量正常组中 DMSO 组与 U0126 浓度0μmol/L组比较,总·290· 中华围产医学杂志2013年5月第16卷第5期 ChinJPerinatMed,May2013,Vol.16,No.5ERK1/2、磷酸化 ERK1/2和 AQP3表达差异均无统计学意义(P>0.05),说明 DMSO 溶液对蛋白表达没有影响。羊水过少组磷酸化 ERK1/2和 AQP3的表达均低于羊水量正常组,见图1和表2。

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2.不同浓度 U0126作用12h:(1)羊水量正常组:U0126不同浓度组间比较,羊膜上皮细胞中总ERK1/2和 AQP3表达差异均无统计学意义。磷酸化 ERK1/2 表达差异有统计学意义,5、10、20、40μmol/L 组磷酸化 ERK1/2表达均低于0μmol/L组(P<0.05);10μmol/L 组磷酸化 ERK1/2表达显著低于 5 μmol/L 组 (P <0.05),但与 20 和40μmol/L 组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

羊水量正常组 U0126作用的最佳浓度为10μmol/L。(2)羊水过少组:U0126不同浓度组间比较,羊膜上皮细胞中总 ERK1/2 表达差异无统计学意义。磷酸化 ERK1/2和 AQP3表达差异均有统计学意义,5、10、20、40μmol/L 组表达均低于 0μmol/L 组(P<0.05);但5μmol/L组与10、20和40μmol/L组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。羊水过少组 U0126作用的最佳浓度为5μmol/L。见表2。

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3.最佳浓度 U0126作用不同时间:(1)羊水量正常组:10μmol/L U0126作用不同时间组比较,羊膜上皮细胞中总 ERK1/2和 AQP3表达差异均无统计学意义。磷酸化 ERK1/2表达差异有统计学意义,2、6、12和24h组均低于0h组(P<0.05);6h组低于2h组(P<0.05),但与12和24h组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。10μmol/LU0126作用于羊水量正常的羊膜上皮细胞的最佳作用时间为6h。(2)羊水过少组:U0126作用不同时间组比较,羊膜上皮细胞中总 ERK1/2表达差异无统计学意义。磷酸化 ERK1/2 和 AQP3 表达差异均有统计学意义,2、6、12和24h组表达均低于 0h组(P<0.05);但2h组与6、12和24h组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。5μmol/LU0126作用于羊水过少的羊膜上皮细胞的最佳作用时间为2h。见表3。

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三、AQP3蛋白在羊膜上皮细胞中的定位

免疫细胞化学染色显示,羊水量正常组和羊水过少组产妇的羊膜上皮细胞中,胞浆及胞膜均有AQP3蛋白阳性染色,但主要位于胞浆,见图 2。U0126作用后,AQP3蛋白在羊膜上皮细胞中定位无明显改变,见图3。

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讨论

MAPK 属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其磷酸化形式可调节相关基因的表达,参与细胞的生长、发育、分裂及细胞间的功能同步等多种生理过程[7]。在哺乳动物中 ERK1/2、c-Jun氨基末端激酶、p38、ERK3/4和ERK5亚家族与 MAPK 途径有关,而其中对 ERK1/2、JNK、p38的研究较为广泛[8]。

近年来的研究表明,MAPK/ERK1/2信号转导通路参与皮肤角质细胞 AQP3蛋白表达的调节,从而改变皮肤对水的通透性,影响皮肤紫外线损伤后的愈合[6,9]。

目前尚未检索到 MAPK/ERK1/2信号转导通路在羊膜上皮细胞 AQP3蛋白表达调控中作用的相关文献。本研究原代培养足月妊娠的人羊膜上皮细胞,采用免疫细胞化学染色方法,发现 AQP3蛋白表达于羊膜上皮细胞的胞浆和胞膜,主要表达于胞浆。羊水量正常组和羊水过少组的表达定位没有明显差别。本课题组对羊膜组织的前期研究结果显示,羊水过少产妇羊膜中 AQP3蛋白表达明显低于羊水量正常组[4],与本研究原代培养羊膜上皮细胞得到的结果一致,提示羊膜上皮细胞中的 AQP3可能参与了羊水量平衡的调节机制。

本研究结果显示,U0126 作用后,羊水量正常组和羊水过少组总 ERK1/2 的表达水平均无明显变化,但磷酸化 ERK1/2 的表达水平均降低,提示U0126可抑制 ERK1/2的磷酸化。羊水量正常组U0126作用的最佳浓度为10μmol/L,最佳作用时间为6h;羊水过少组 U0126 作用的最佳浓度为5μmol/L,最佳作用时间为 2 h。为后续研究MAPK/ERK1/2信号转导通路在药物治疗羊水过少中的作用奠定了基础。

本研究结果还显示,羊水过少组U0126 作用后,AQP3蛋白表达水平明显降低,其最佳抑制浓度和最佳作用时间与磷酸化ERK1/2一致,提示U0126通过抑制 ERK1/2的磷酸化,下调羊水过少者羊膜上皮细胞中 AQP3蛋白的表达。但羊水量正常组 U0126 作用后,AQP3 蛋白表达无明显改变,提示羊水量正常组羊膜上皮细胞中 AQP3蛋白表达可能还受其他的 MAPK 信号转导通路调节,具体机制尚待进一步研究。