先知死后知生

李小宝两岁多的时候有一天忽然跑来问他娘：“妈妈，你会死吗？”

他娘先吓了一大跳，然后镇定地回答：“会的。人都会死的。”

见李小宝啥也没说去玩别的了，他娘松了口气，想这孩子准是从故事中听到了谁谁死了才好奇地问问。

那天晚上，要睡觉了，他娘发现李小宝独自缩在被子后面，小屁股撅在外面，一动不动。

“你干吗呢？”李小宝趴在那儿，埋着头不动：“我在哭呢。”

“为什么呀？”他娘赶紧把他抱在怀里，李小宝哭着说：“妈妈，我不要你死。”

他娘马上说：“妈会陪你长大，上小学、上大学，看着你实现梦想，妈不会死呢。”

李小宝非常喜欢卡尔维诺写的《意大利童话》，百听不厌。有一次他让他娘朗读之前，忽然指着封面上卡尔维诺的照片问：

“他死了吧？”

当得到肯定的回答之后，他又问：“那他为什么还老讲故事呢？他假装死吧？”

“不。他死了。他写了书，人们读他的书就常会记起他，他好像没有死一样。”

李小宝听了马上去拿了笔和本塞给他娘：“那你也写一本书吧。”

他娘起初没理会，“好吧，我们写什么呢？”

“写个故事吧。”李小宝说完就开始瞎编自己的故事，看着他娘认真记下他讲的故事，他满意地笑了，然后说出一句让他娘不知所措的问话：“你不会死了吧？”

见他娘说不出话来，他平静地说：“人都会死的吧？”

“对。但我会一直陪着你的，陪你长大。一直爱你。”他娘用同样的平静回答他，

“你知道我爱你吗？”

“我知道。我早就知道。”

看着李小宝安心的样子，他娘释然了，也许是阅读带来的力量。

读莎士比亚

李小宝上小学三年级，近来他迷上了莎士比亚，他读莎士比亚，但他其实不知道莎士比亚是谁，在他心里，莎士比亚只是他喜欢的一个七年级男孩霍林（《星期三的战争》中的人物）被迫阅读的“冗长”而“乏味”的作品，但最后他们都爱上了莎士比亚。孩子不像我们大人，他们没有被莎士比亚吓住，李小宝后来很认真地说：“我现在知道莎士比亚是好的戏剧。”

这句朴素的评价反映了孩子对“大书”有着天然的亲近，虽然他们刚开始从那里学来的只是一句骂人的话，比如三年级的李小宝和七年级的霍林首先从莎士比亚习得并不断运用的是：“愿西南的恶风把你们吹得浑身起水疱”……

起初李小宝从书架上挑了《星期三的战争》让他爹读，他爹说：“这个你能自己看，读别的。”其实他爹有点私心，睡前阅读总是读儿童文学什么的实在很难坚持，必须有些“童叟共赏”的书掺和着，像前一阵子读《金银岛》，李小宝不用央求，他爹就会主动说：“我再给你读一段。”那叫一个欲罢不能！这次他爹还想找这么一本书来读，捎带着满足大人的爱好。但李小宝坚持说：“这是我的睡前故事，得我决定读什么书！”他爹当然得让步。

好在《星期三的战争》带给一家大小的愉悦感受丝毫不减，不仅如此，听完霍林的故事李小宝宣布：“下一个睡前故事我要听莎士比亚。”

说实话他爹都没怎么正经读过莎士比亚，莎士比亚对于大人是书架上端正站立的“大书”！孩子可不管这么多，他要读，而且和霍林的阅读顺序一致，李小宝先点了《暴风雨》。

当晚听了一幕，李小宝还不过瘾，他说要带两本莎士比亚到学校去，他爹没太当真，那天放学回家，李小宝说读完了三个剧本，还没等他爹起疑，他继续说：“你猜那磅肉是怎么解决的？”幸好高中课本里有《威尼斯商人》节选，不然可能还不知道小宝说的是“哪磅肉”呢。“那个法官真是够聪明的，她说当初只说了是一磅肉，没说要一滴血，所以不能有一滴血，你就可以割去一磅肉！”孩子眼里闪着兴奋火花，在大人眼里的“大书”带给他的是单纯的故事的快乐。

听读加上阅读，李小宝读完了大部分莎士比亚，他爹娘也和他一起完成莎士比亚扫盲。

关键词：消毒；专利；申请量；申请人

DOI：10.16640/ki.37-1222/t.2017.05.020

为了提高包装物品的安全性，保证包装物品的质量，将包装件进行合理的消毒是必要的。通过对包裹材料或贮器的消毒方面专利的相关分析，了解该领域的发展状况。

1 包裹材料或贮器消毒技术概况

本文涉及在包装前或包装过程中对包裹材料或贮器消毒的专利文献。其中消毒按消毒方式又可以划分为用加热方式、用辐照、用液体或气体，目前用液体或气体对包裹材料或贮器消毒的专利申请量较大。

包裹材料或贮器消毒的专利申请量上，以在日本的申请量最多，其中以利乐公司在该技术上的申请量远远大于其他申请人的申请量。因此本文将以利乐公司为切入点，对包裹材料或贮器消毒技术的发展进行分析研究。

2 利乐公司的技术演进

（1）用加热方式对包裹材料或贮器消毒的技术路线。利乐公司最早采用的是以高压蒸汽处理以纤维为基料的容器，在容器的临界温度时通过改变分别用于加热或冷却容器的传热介质。传热介质从容器传递热能或将热能传递到容器的试剂，适宜的传热介质包括例如水（液相）、蒸汽和空气。但是这种消毒方式对包装容器的材料结构存在限制。

随后利乐公司采用加热化学灭菌剂来实现对包装容器的灭菌，解决现有包装容器灭菌方法消耗大量灭菌剂、难以全面灭菌、易破坏容器的问题。

近几年，正确灭菌包装材料是在过氧化物浴中，对于在加热室内部气体混合物中过氧化氢浓度的精确控制是决定性的。如果浓度太低，应用于包装材料的过氧化氢蒸发得太快，存在未充分灭菌的风险。另一方面，如果浓度过高，应用于包装材料的过氧化氢蒸发得太快，存在过多的过氧化物残留在离开加热室的包装材料上的风险，为了解决这些问题，利乐公司主要是采用一种用于测量可氧化物质浓度的设备（如CN200810147117）来达到对开口纸瓶的灭菌。

（2）用辐照方式对包裹材料或贮器消毒的技术路线。用辐照对包裹材料或贮器消毒就是将容器密封，使容器受到能量水平能够使电子穿透容器的电子辐照，在容器内产生臭氧，并在密封的容器内保留所产生的臭氧，以便消毒容器的方法。

包装片材因电子通过会产生“异味”的味觉，因此利乐公司在专利CN02805128中就提供了一种采用辐照给包装片材杀菌的方法，即将低压电子束分别引导至包装片材的相对表面上，电子束均具有至多100千电子伏的能量，辐射装置包括两个用于产生低压电子束的产生装置，装置中还至少包括一个屏蔽元件，用于屏蔽围绕所述产生电子束的产生装置的区域。

至2012年，在辐射消毒方面，利乐公司主要的研究方向变为电子束装置，其中申请号为CN201280030018的申请就是关于一种电子束装置，通过装置提高消毒效果。

（3）用液体或气体方式对包裹材料或贮器消毒的技术路线。用液体或气体对包裹材料或容器消毒，通常是和加热消毒材料相结合的消毒方式，在90年代初，利乐公司就有相关申请CN90108853，具体为一种产生含过氧化氢气态灭菌流体的方法。确定空气流的均匀气化温度的方法是，在气化前，通过与具有大质量（热容） 和大热交换表面积的加热元件进行热交换而将空气加热，该加热元件通过有控制地供给其能量而保持所要求的高温，该加热元件在间歇注入液态过氧化氢之间中止气化期间，借助贮存在该加热元件中的热量得到加热，其装置较复杂。而对于带材的灭菌利乐公司则采用了较简单的措施，例如申请号为CN00108229的专利。至2014年，利乐公司直接研发将包装材料制成密封包装和消毒为一体的机器，其中有申请号为CN201280048826的专利申请，这个专利申请主要是关于一种包装机器。

3 包裹材料或贮器消毒技术展望

从利乐公司在包裹材料或贮器消毒方面的专利申请可以看出，包装行业正在从机械化程度低的时代过渡到机械化程度高的时代，包裹材料或贮器的消毒不再是在容器成型前或后消毒，其更是在容器或包装过程中的一个小步骤，而且消毒也更趋于安全、便捷。因此包裹材料或贮器消毒将来的发展趋势是对整个包装装置的研究以及对于消毒装置在包装装置中的设置和控制的研究，未来的产品加工与包装过程不仅更一体化，自动化，也将更可靠、更安全、更符合人类健康的发展需求。

参考文献：

[1]利乐拉瓦尔集团及财务有限公司.从包装材料的幅材生产食品的密封包装的包装机器和方法 CN103842258 A，2012（08）29.

[2]利乐拉瓦尔集团及财务有限公司.在包装机上对带材进行灭菌处理的装置和该包装机 CN1272444 A，2000（04）30.

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[4]利乐拉瓦尔集团及财务有限公司.电子束装置和制造所述电子束装置的方法 CN103620696 A，2012（06）27.

[5]利乐拉瓦尔集团及财务有限公司.照射物体的方法和装置 CN101557832 A，2007（11）12.

[6]利乐拉瓦尔集团及财务有限公司.消毒密封容器的方法 CN1233221 A，1997（09）19.

关键词：大树杜鹃；极小种群；濒危植物

中图分类号：Q948

文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2016）21-0065-03

1 引言

杜鹃花是世界名花之一，在植物分类上属杜鹃花科杜鹃花属（Rhododendron）植物。全世界已知的杜鹃花属种类共967种，广泛分布于亚洲、欧洲、美洲，主要产于东亚、东南亚[1]。我国是杜鹃花的重要产地，在全世界的杜鹃花属种中，中国拥有561种杜鹃花，占全世界总数的58.01%，其中，420种是我国特有种，约占国产种类的74.87%[2，3]。因此我国素有“杜鹃花王国”之称，云南更是杜鹃花群芳荟萃之乡，是杜鹃花属植物的分布中心和发祥地，共有243种杜鹃花分布，其中大树杜鹃（Rhododendron protistum var.giganteum （Forr.ex Tagg） Chamberlain）被誉为“杜鹃花王”。

大树杜鹃为杜鹃花科（Ericaceae）杜鹃属（Rhododendron）常绿树种，是翘首杜鹃（Rhododendron protistum Balf.f. et Forrest）的变种[4]，与原变种的区别是这一变种叶背面全面被毛，毛被淡肉桂色，疏松，不脱落。大树杜鹃在中国分布于高黎贡山一带海拔2100～3300 m的混交林中[5，6]，数量为3000株左右，主要分布于腾冲县。因其生长缓慢，更新困难，数量较少，目前已被世界自然保护同盟（International Union for Conservationof Nature，IUCN）将其列为极危物种，云南省极小种群物种拯救保护规划纲要（2010～2020年）将其列为极小种群物种进行保护[7]，针对大树杜鹃的保护迫在眉睫。

2 大树杜鹃的发现

早在20世纪初，云南的杜鹃花就被欧洲一些国家所注意，多次引种我国杜鹃和其他植物进行栽培。1919年，英国人在云南腾冲高黎贡山区，率先发现了杜鹃花树王。他们采集了大树杜鹃的花和果实标本，并取样带走了一段树干。据记载这株树的树干径围2.6 m，株高25 m，树龄280年，至今树干圆盘状的木材标本仍展览在英国伦敦大英博物馆里。1926年，英国人傅礼士（G. Forrest）和塔吉（Tagg）将大树杜鹃定名为Rhododendron protistum，并在爱丁堡皇家植物园刊物上做为新种发表。大树杜鹃在异国他乡声名鹊起。

在国内，国人开始关注大树杜鹃，是在60年后的1981年。1981年，中国科学院昆明植物研究所专家冯国楣通过查阅关于傅礼士的资料，在三次实地调查后，终于进入大塘，在海拔2400 m的密林深处找到了大树杜鹃。其中一株树龄在500年以上，高28 m，基径3.07 m，树冠61 m2，被植物学界公认为“世界大树杜鹃王”[8]。据冯国楣记载，大树杜鹃叶片革质，呈椭圆形或倒披针形。总状伞形花序，序着花20～24朵，整个花序构成直径达25 cm的花团。花呈水红色，花冠漏斗状钟形，单花直径6～8 cm，基部有8个深色蜜腺囊，雄蕊16枝，不等长，花药暗紫色，子房16室，花柱长3.5～5 cm，淡绿白色，无毛。在大树杜鹃种群内还有厚朴（Magnolia officinalis）、木莲（Manglietia）、含笑（Michelia）、樟（Cinnamomum）、楠（Phoebe）等树种伴生。之后大树杜鹃也引起了当地林业单位的重视。1982年4月，腾冲县林业局、林业学会组织了10人的考察队，对腾冲县界头公社大塘大队、大河头生产队以北的高黎贡山，海拔2100～2400 m的火草地、平岔一带进行考察。在调查中发现大树杜鹃40余株，胸径在1 m以上的有12株。其中，发现一株特大大树杜鹃，树高25 m，地面基部直径达3.07 m，离地面20 cm处分成两大主干，胸径分别为1.57 m和1.11 m[9，10]。

为应对越来越严重的环境，掌握大树杜鹃的分布情况和数量信息等科学资料，2009年5～11月，高黎贡山保山管理局腾冲分局大塘管理站分别于5月及11月在辖区内又进行了40 d的野外调查。调查结果显示：大树杜鹃集中分布在大塘火草地及南部茨竹河辖区中山湿性常绿阔叶林中海拔2340～2600 m的沟谷两侧，少数沿沟谷上升到2780 m，共发现大树杜鹃1437株（火草地1325株、占92.2%，茨竹河112株、占7.8%），两个分布地点之间的直线距离近11 km。前人的这一系列发现，都为今后大树杜鹃的研究和保护提供了珍贵的基础资料。

3 大树杜鹃的资源状况

大树杜鹃目前主要分布在高黎贡山国家级自然保护区大塘管理站西坡的大河头和茨竹河。但不仅限于腾冲县，泸水县、福贡县和贡山县也有极少量分布，物种总数量为3000株左右[5，7，11]。其主要分布地高黎贡山山区海拔2340～2600 m，年平均气温11 ℃，最热月平均气温约16 ℃，极端最高温约27.8 ℃，最冷月平均气温约3.50 ℃，极端最低温在0 ℃以下；年均降水量约2000 mm，干湿季分明，雨季（5～10月）集中年降水量的85%，其中7～9月雨量尤多，旱季（11月至次年4月）雨量较少，属典型的亚热带季风气候[12]。该区域年平均相对湿度在80%以上，土壤为黄棕壤，中等厚度。整体生境多为多雨高湿，气候温凉，土壤疏松排水良好的地段。由于特殊的地质历史和上述独特的自然环境，高黎贡山山区成为杜鹃花科植物的主要分布区，云南所产10属中有9属在高黎贡山有分布（只有当年枯（Arctous ruber）1属1种未见在高黎贡山地区分布），共产187种（包括亚种、变种），分别占中国总种数的约34%及云南种数的49%。高黎贡山地区杜鹃花科植物种类最多的是杜鹃属（Rhododendron），计140种（变种），占该属云南种数的45%[13]。

大树杜鹃在高黎贡山国家级自然保护区主要分布于沟谷两侧，植被类型为中山湿性常绿阔叶林，群落外貌上层木以常绿树为主，同时也有少量干季换叶的树种混杂，林冠参差不齐。主要群落类型包括青冈-南亚含笑群落、薄片青冈群落与旱冬瓜群落等，壳斗科（Fagaceae）、樟科（Lauraceae）、木兰科（Magnoliaceae）、山茶科（Theaceae）、金缕梅科（Hamamelidaceae）、杜鹃花科（Ericaceae）植物是乔木层主要优势树种，主要伴生植物包括曼青冈（Cyclobalanopsis oxyodon）、薄片青冈（Cyclobalanopsis lamellosa）、毛脉青冈（Cyclobalanopsis tomentosinervis）、南亚含笑（Michelia doltsopa）、红花木莲（Manglietia insignis）、印度木荷（Schima khasiana）、滇西红花荷（Rhodoleia forrestii）、黄心树（Machilus gamblei）、红梗润楠（Machilus rufipes）、云南柃（Eurya yunnanensis）、清香木姜子（Litsea mollis）、山柿子果（Lindera longipedunculata）、角柄厚皮香（Ternstroemia biangulipes）等[14]。

4 大树杜鹃的濒危原因

一般认为造成物种濒危的原因主要来自两方面：一为物种的内部因素，包括遗传力、生殖力、生活力、适应力的衰竭等，是物种本身的生物学特性和对环境的适应能力的体现，它们是威胁植物生长繁衍导致其稀有濒危的重要原因；二为外部因素，指外界干扰对物种繁育造成的影响，包括自然因素和人为因素等。自然因素是指地质史上由于陆地的隆起和下沉、冰期和后冰后干热期的交替等造成的大规模的气候变迁，往往使许多植物灭绝。部分得以存活的种类也因环境的变化成为稀有种类， 如银杏、苏铁（Cycas revoluta）等。人为因素是人类活动所引起的使植物生存受到威胁的灾害[15]。

大树杜鹃十分集中地分布在高黎贡山自然保护区，相比我国其他濒危植物来说，外界干扰的影响很小，它的濒危主要由于自身原因。大致可分为以下几方面。

4.1 种群分布局限性强，拓殖途径狭窄

大树杜鹃分布集中于高黎贡山山区海拔2340～2600 m的原始森林中，邻近山体鲜有分布，地理分布范围十分狭窄，具有很强的局限性和特殊性。现有的人工繁育和引种栽培技术表明，大树杜鹃幼苗建成与人工繁育对外界生态因子的需要极其苟刻，昆明植物研究所在1984年曾经引种过200多株大树杜鹃，仅存活下来几株，但至今也没有开花。此外，大树杜鹃的种子很小，靠风力和重力传播，生长和繁育的生态幅范围狭窄。这些都造成大树杜鹃仅在适宜的小生境中生长、繁育，导致大树杜鹃种群增加和更新困难。

4.2 环境因子影响显著，群落更新困难

在室内试验中，大树杜鹃的种子萌发率较高（86%～88%），但对环境的依赖显著，其年生长量仅为6.6 cm/年，营养生长的缓慢直接导致了生殖生长的的延长，而在生长过程中大树杜鹃耐寒能力较弱，不耐-1 ℃的低温，温度在-1 ℃时，大树杜鹃叶芽变为棕色，-2 ℃时，植株死亡[5]。同时，大树杜鹃的生境中凋落物厚度大，靠风力和重力传播的种子很难散布到有效的土壤基质层。这些都导致，大树杜鹃群落中成年植株较多，幼苗幼树较少，形成更新结构不稳定的衰退型种群，限制了物种的自然更新。

5 大树杜鹃的保护策略

综上所述，大树杜鹃能够在当地环境中恢复稳定的自然更新，但不能适应改变的环境条件，如低温会很大程度上限制大树杜鹃的生长、繁育，所以，保护策略应以就地保护为主，异地保护并用，具体策略如下。

5.1 对残存种群就地保护

对珍稀颜危植物的保护，目前认为最关键而又最有效的措施就是就地保护，即保护现有种群及其生境[16]。从大尺度来说，就地保护是以各种类型自然保护区（包括风景名胜区、森林公园）的方式， 将有价值的自然生态系统和野生生物生境，或将植物多样性丰富、具有珍稀濒危植物分布的区域保护起来。我国目前属于自然保护和生物多样性保护的主要区域有3种类型：自然保护区、森林公园、风景名胜区。大树杜鹃种群集中分布于高黎贡山国家级自然保护区的核心区，因此，对大树杜鹃种群的保护首先就是对高黎贡山自然保护区的保护，确保现有的群居和生境得到保护和提升，减少人为干扰和破坏。特别值得注意的是近年来国家对国家级自然保护区开展生态旅游苑⒌牟椒ブ鸩郊涌欤大树杜鹃作为高黎贡山自然保护区的核心保护植物资源，极具旅游价值，这是保护大树杜鹃的机遇也是挑战，应在未来的工作中把重点放在处理好保护与开发的关系，在开发生态旅游的同时，做好濒危植物资源的保护，杜绝破坏性的开发。

5.2 就地展开适当的人为干扰促进群落更新

从生物特性上来说，大树杜鹃在自然生境中的大树杜鹃开花、结实正常，自然结实量大，室内试验条件下种子萌发率也较高，这说明大树杜鹃本身可以完成自我更新，但在自然环境中，光照条件、凋落物厚度等显著影响着种子的出苗率。所以，应该适当的在原有生境中展开人为干扰促进群落的更新，如清除凋落物、灌木、草本保证种子的能接触到有效的土壤基质层；扩大幼树、幼苗集中分布区的林窗面积，保证光照条件，促进幼龄树苗的更新。

5.3 异地保护，开展驯化繁殖

大树杜鹃由于种群环境独特，又多处于过熟年龄，繁殖能力低下，加之人们对大树杜鹃的繁殖方法知之甚少，因此应加大大树杜鹃人工繁殖技术的研究，通过采取种子采集、人工育苗的保护措施，扩大种群数量。另外，大树杜鹃具有很高的观赏价值，人工驯化繁殖若取得成功，可为该种迁地保护和增添我国园艺树种打下基础。

参考文献：

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[3]黄增良.努力开发杜鹃花[J].广东园林，1999（1）：42～44.

[4]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志.第57卷第2册.杜鹃花科[M].北京：科学出版社，1994：50～51.

[5]张长芹.大树杜鹃Rhododendron protistum var.giganteum和蓝果杜鹃Rhododendron cyanocarpum的濒危原因研究[J].自然资源学报，1998，13（3）：276～278.

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[8]冯国楣.大树杜鹃采集记[J].植物杂志，1981（5）：31.

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[12]段森华，何耀华.滇西北生物、文化多样性保护与经济社会可持续协调发展研究[M].昆明：云南科技出版社，2009.

[13]中国科学院昆明植物研究所.云南植物志（第4卷）[M].北京：科学出版社，1986：336～602.

[14]吴富勤.极小种群野生植物大树杜鹃的保护生物学研究[D].昆明：云南大学，2015.

在思想上积极向上，能够认真贯彻党的基本方针政策，积极学习政治理论，坚持四项基本原则，遵纪守法，爱岗敬业，具有强烈的责任感和事业心。积极主动学习专业知识，工作态度端正，认真负责，具有良好的思想政治素质、思想品质和职业道德。

在工作态度和勤奋敬业方面，热爱本职工作，能够正确认真的对待每一项工作，能够主动寻找自己的不足并及时学习补充。

在生活中发扬艰苦朴素、勤俭耐劳、乐于助人的优良传统，始终做到老老实实做人，勤勤恳恳做事，团结同事、务实求实、乐观上进，始终保持严谨认真的工作态度和一丝不苟的工作作风。

工作能力及专业知识方面，来公司一年多，主要是去华冶二矿实习。我在二矿实习主要分为三个部门。分别是掘进车间、测量办公室及地质办公室。在掘进车间和测量办公室主要是认识学习，多数时间是在地质办公室实习。在华冶二矿实习期间，在领导和同事们的热心帮助，详细讲解下，也了解和参与了一些具体工作，工作虽琐碎，但是收获很大。主要有以下方面：

负责有关地质技术的组织管理工作:经常深入井下现场，掌握井下地质情况，查明影响生产和建设的地质因素，汇编原始地质编录和钻孔编录，及时汇报各种相关地质情况；保证生产正常接续；收集勘探和采掘工作面的地质资料，及时了解地质情况，面向生产深入现场调查研究，解决出现的问题。

在工作期间，我不错过，不浪费每一次锻炼的机会，加速自身知识的不断更新和自身素质的提高。同时，利用闲余时间向领导及同事请教有关矿山地质及采矿方面的知识，努力使地质和采矿相结合，使自己成为适合矿山工作的地质人员。

一、在实习期间，经常下井，进行坑道编录及生产探矿钻孔的编录和采样。在室内，对井下编录资料进行整理。作为一名地质技术员，我按照生产的需要，按时完成了各项工作。

1、生产探矿：过去的一年中，在地质探矿的基础上为满足开采和继续开拓延伸的需要，为进一步探明或确定矿体形状和质量特征以及储量升级所开掘各种坑探工程和钻探工程。从而为矿山的开采和指导施工提供详细的地质依据。通过生产探矿的设计，原始编录、综合编录、取样等一系列的工作，曾提交了2642中段20-31线、15-07线，车场工程，2582中段斜坡道开拓，035线等生产探矿资料。

2、储量核实：考察过中间沟-断层沟矿区，运用AutoCAD、MAPGIS等软件负责了储量核实工作，并且参与了储量核实报告的编写。在整个考察及储量报告的编写过程中学到了不少东西。

3、深部及探矿：进一步探明边部、深部的小矿体，配合工程师加强探矿。为满足矿山的生产和发展的需求，不断扩大地质储量。

4、根据已有的资料，确定勘探类型及勘探网度，总结以往矿床勘探成果和探采对比的基础上，运用典型矿床经验，根据矿床的规模大小、形态的复杂程度、厚度变化的稳定程度、构造的复杂程度和矿石中有用组分分布均匀程度等地质因素，对矿体勘探的难易程度进行划分。确定合理的勘探类型及勘探网度，能正确地布置地质勘探工程，达到有效的矿产储量，满足矿山开采设计的需要。为矿床合理开发利用提供地质依据。

5、损失贫化：防止采富弃贫；加强施工管理和放矿管理，防止盲目开拓造成矿产资源的损失；准确控制矿体空间分布与矿石质量变化规律，监督各采场出矿的矿石质量和品位，及时掌握生产采掘计划执行情况及采场质量动态，严格控制矿石中的废石混入和出矿品位等，使矿石损失和贫化指标降低到预定水平。

6、2010年八月，参加了锡铁山铅锌矿成矿与找矿前景高层论坛会。

7、协助同事进行数字化矿山模型的建立，矿山数字化软件的引用和应用，将会推动矿山企业技术和管理方式的改变，预计10月底完成。

二、工作中尚存在的问题

从事地质工作以来，深深感受到工作的繁忙、责任的重大；大事、小事压在身上，往往重视了这头，却忽视了那头，有点头轻脚重，没能全方位地进行系统地工作，主要表现在以下几个方面：

①、刚参加工作不久，没有足够的经验，对于矿体复杂的地段理解不够深。

②、理论知识掌握不够扎实，实践能力较差，理论与实践联系不够。

以上问题，虽然对工作的影响不是很大，但我总觉得没有尽到一个技术员的职责，在今后工作中自己将努力做到更好。

在实习和工作的一年里，我对整个矿山的矿床成因及矿体赋存情况有了系统的认识,这对我今后在矿山上的工作有很大的指导作用。还学会了储量的计算。理解并掌握了生产探矿工作的基本流程和基本工作情况，这对我今后在矿山上工作有了很大的帮助。

关键词中小型水库;洪水预报;水库调度系统;辽宁

辽宁省现已建成各类水库954座,其中中小型水库921座,中小型病险水库550座。受历史和经济条件制约,大部分中小型水库重建轻管,采用粗放式管理,没有成熟、科学的防洪预警体系和实用的防洪减灾措施,管理手段落后。水库在汛期到来时往往降低标准运行,难以发挥防洪减灾和兴利调度的作用。因此,亟待开展水情预报调度系统技术研究。

1研究目标

中小型水库存在以下问题:①中小型水库水文测站虽少,但由于其流域较小,洪水汇流与入库时间较短,传统人工语音报汛采用时段报汛,无法实现对水库流域降水的实时掌握和作出及时的洪水预报。②中小型水库水文预报采用传统人工洪水预报方法,效率低,不易进行参数率定,且无法进行实时预报。③中小型水库尚未实现水库洪水调度计算机模拟,采用手工方式进行洪水调度演算计算量大、效率低、精度差,难以实现多方案模拟调度优选,无法满足现场会商决策要求。④中小型水库一般管理工作人员较少且水平不高,水雨情资料人工整编费时、费力且及时性和准确率无法保证。因此,该研究结合水情自动遥测系统和水文预报与防洪调度应用软件系统,建立集水雨情数据自动采集与传输、防汛值班机、在线洪水预报、洪水调度模拟、水情资料整编与一体的水库控制流域水情遥测与洪水预报调度自动化系统解决方案,以解决水库传统工作模式中存在的问题,实现对水库控制运用的强大支持。

2研究内容

2.1水库控制流域水情遥测技术研究

具体内容包括:水雨情自动采集测站分布、采集数据的传输与存储、水雨情数据库的设计、原始数据的预处理加工与数据共享接口的设计、水情值班机模块的设计与开发及水情资料整编模块的设计与开发等[1]。

2.2水库控制流域水文预报与洪水调度技术研究

具体内容包括:水库日常水文预报与洪水预报、模型理论研究与相应程序模块设计与开发、水库洪水调度模拟模型理论研究与相应程序模块设计与开发、预报调度参数数据库的设计及在线率定维护程序模块的设计与开发等。

2.3水库控制流域防洪调度决策支持系统

具体内容包括:基于实时采集数据库、水雨情应用模型库、参数库的防洪调度决策支持系统软件工程设计开发的研究及系统通用性、可靠性、可移植性的研究[2]。

3解决关键问题

3.1值班机功能研究

实现实时数据动态显示的值班图、值班表功能[3]。值班图是基于对流域图的二次开发,实时显示各测站数据,显示的时间段可人工交互调整,默认为当日8∶00到次日8∶00数据;值班表是实现以数据表和过程线的方式显示当日数据。值班图、值班表数据刷新是以数据触发方式实现,即只有当数据库中有最新数据更新时才进行数据刷新。系统设计采用该模式开发既实现了数据实时显示,又大大降低了数据库服务器数据处理压力,避免了系统不必要的计算机资源消耗,提高了系统运行效率和稳定性。

3.2数据信息管理研究

实现数据库中数据的查询功能,包括遥测数据和其他参数数据查询[4]。遥测数据采用用户交互条件查询方式,用户可灵活设置单一查询条件或进行多条件组合查询,操作方便、显示直观;在参数查询中实现水库水位-库容、水位-面积、水位-输水洞、发电洞、溢洪道泄量的双向查询,并以曲线图方式显示特征曲线;实现对遥测雨量数据的统计功能,对降雨数据进行按时段、日、旬、月、年的统计,并以表格方式直观显示,统计数据支持报表生成功能。

3.3洪水预报调度研究

实现实时水库洪水预报调度和模拟水库洪水预报调度功能,并实现预报调度方案人工交互修正。支持调度方案生成、各种成果图表的显示、打印及报表的生成。针对中小型水库的流域特点分析水文管理历史资料,为水库建立水库洪水预报相关图;研究开发通用洪水预报模型(蓄满产流、超渗产流、新安江模型、马斯京根模型),开发流域汇流单位线制作模型;开发通用洪水调度模型(试算法、龙格库塔法)。

4小结

该研究成果为中小型水库水情自动化建设提供了可行、有效、系统的解决方案,对实际工程建设具有较强的指导作用。基于此模式的水情遥测与水文预报、洪水调度系统的建设已陆续在省内多座水库展开。

5参考文献

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[2] 刘奇,高永超,何维民.棋盘山水库水情预报调度系统技术研究[j].现代农业科技,2009(7):258-258,260.

这一学期里，我担任三年级班主任和语文教学，我班在学校领导的统一组织下，在任课教师的大力支持和配合下，各项工作顺利开展，学习、生活等方面都取得较突出的成绩。现将本学期的工作总结如下：

一、加强对学生的思想道德工作，培养学生良好的品质，净化学生的心灵，努力培养又红又专的合格人才。为了配合学校少先队大队部和处的工作，我们班积极开展了许多有益于学生身心健康发展的活动。例如，“积极参与“‘为中华之崛起而读书’的主题班会”、“‘美化校园、保护环境从我做起’的实践活动”、法制教育主题班会等。同时，我也经常利用班会课对学生进行身心教育，帮助学生澄清思想上的模糊认识，及时对学生进行针对性的教育。

二、加强班级管理，培养优秀的学风、班风，深入全面地了解学生，努力培养“求知、砺志、活泼、团结”的班集体。在这个学期里，一方面，我慎重地选拔和培养班委成员：第一。大力表扬班委优点，宣传他们的先进事迹，帮助小班委树立威信;第二。在鼓励班委大胆工作，指点他们工作方法的同时，更严格要求班委个人在知识、能力上取得更大进步，在纪律上以身作则，力求从各方面给全班起到模范带头作用，亦即以点带面;第三。培养班委团结协作的精神，通过班委这个小集体建立正确、健全的舆论，带动整个班集体开展批评与自我批评，形成集体的组织性、纪律性和进取心，亦即以面带面。另一方面，我有效地利用好每周一的班会课开展一些专题性的活动，扎实有效地加强一个学生的常规训练。训练的内容包括《小学生守则》和《小学生日常行为规范》要求的常规、课堂常规、集会和出操常规、卫生常规、劳动常规等等诸多方面。务必使每个学生具有服从集体，服从命令的思想，具有自我约束力，形成习惯，保证整个班集体随时表现出活而不乱，严而不死的良好班风班貌。

三、根据学校工作安排和本班实际情况，拟定了全班与小组在知识、能力、情感等方面的远、近期目标，让每一个学生明确到我们全班和小组正在努力奋斗的目标是什么，避免了盲目、低效地学习和生活，从而增强了集体的凝聚力和动力。同时积极抓好后进生的转化工作，尽可能创造条件和机会让后进生表现其优点和长处，使他们品尝到成功的欢乐和喜悦，努力帮助他们消除或减轻种种心理担忧，让他们认识到自己的位置和学习方向。

四、积极开展好文体活动，做好课间操、眼保健操，保护学生视力，增强学生的体质，提高学生的学习效率。三年级学生学习任务比较繁重，进行适当的体育活动不仅有利于学生身体素质的提高，而且也有利于学习效率的提高，每次活动我都亲临现场与学生一起活动并适当予以技术性的指导，这样不仅可以防止意外事故的发生，而且也可以加深与学生感情的交流。

[关键词] 手术室；内镜器械；辅助设备；清洗；消毒；保养

[中图分类号] R472 [文献标识码] C [文章编号] 1673-9701（2013）24-0122-02

随着医疗技术的发展，微创医疗技术也在不断发展和进步，手术室内镜的品种及数量也越来越多，包括腹腔镜、胸腔镜、宫腔镜、关节镜、鼻内镜等。器械质量优劣直接影响手术效果，而器械的清洗与保养直接关系到内镜手术的顺利进行[1]。内镜结构复杂、价格昂贵，内镜的清洗、消毒质量影响着医疗质量，与医院感染密切相关，因此，保证内镜的清洗、消毒质量尤为重要。我院手术室按照《内镜清洁消毒技术操作规范》执行清洗、消毒和保养工作，取得了良好的临床效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年1月～2013年1月我院腔镜手术1610例为实验组，2011年1月～12月腔镜手术1500例为对照组。两组腔镜手术包括：腹腔镜、胃镜、肠镜、纤维支气管镜、泌尿内镜、胸腔镜、宫腔镜、鼻内镜等。两组内镜种类比较，差异无统计学意义，具有可比性。

1.2 方法

对照组：采用传统常规方法对内镜进行清洗及消毒。清洗时清除管道中的血液、黏液及残留组织，洗净吹干后进行消毒灭菌。用2%戊二醛消毒，2%戊二醛浸泡10 h可灭菌，消毒、灭菌后用无菌水冲洗。实验组：清洗消毒方法严格按照《内镜清洁消毒技术操作规范》步骤进行，具体如下：

1.2.1 内镜的清洗：①初洗：手术结束后的内镜器械及辅助设备立即放入清洗槽内，用流动水彻底冲洗，管腔用高压水枪冲洗。对可拆卸的器械，清洗前先拆开零部件，打开各个阀门，用毛刷刷洗钳夹部位，最后用纯水涮洗全部器械。初步去除器械表面和管腔内的残留组织物和血块。②酶洗：清洗后的器械、辅助设备放入浓度为1∶100～1∶150多酶液的超声机中，管腔内灌满酶液，清洗5～10 min，发挥酶的催化作用，使器械中残留血液、体液及组织残留物溶解、松动；然后利用超声振动直接作用于被溶解的血液、体液等污垢，将其松解、粉碎成小颗粒[2]。再次在流动水中漂洗器械，用高压水枪或注射器吸取蒸馏水冲洗干净各管道，洗去器械表面多余的酶液及脱落的污物。③上油：器械擦干后，浸泡在器械油中。剂为水溶性，较好的与人体组织相容。保持器械表面光泽及关节部位易于松动，延长使用寿命[3]。捞起后甩尽表面液体，用高压气枪吹干器械表面和管腔，用烘干箱干燥30 min，检查安装好准备消毒灭菌。

1.2.2 内镜的消毒 实践证明，使用2%碱性戊二醛浸泡对内镜器械进行消毒灭菌，灭菌效果安全、可靠性高[4]。采用2%碱性戊二醛对内镜器械及其辅助设备进行消毒，腔镜器械所有关节完全浸泡于戊二醛中，管腔内充分注入消毒液。灭菌指杀灭或清除一切微生物。按内镜器械性质选择灭菌方法。耐高温的金属器械按照腔镜器械厂家说明书对内镜器械进行高压蒸汽灭菌。不能耐高压灭菌的器械如电凝摄像头、等离子刀等用环氧乙烷气体灭菌，内镜器械附件如光源线、单极线、电刀导线等，清水擦洗，用75°酒精擦洗后干燥处理，低温灭菌器灭菌。

1.2.3 内镜的保养 内镜器械轻拿轻放，不能碰撞、强烈摩擦、受压等；各类钳子要经常检查，观察钳端是否闭合良好，关节处要定期检查、上油、活动关节；用无水酒精脱脂棉球擦拭镜面，防止摩擦刮伤镜面，影响手术视野清晰；器械的尖端或锐利处应套上橡皮保护套，以免损伤医护人员；器械上的阀门要定期拆卸，进行清洁、上油，保持阀门灵活；各种密封圈、橡皮帽如有老化、裂口等迹象，要及时更换，以免影响手术。内镜操作手术结束后，先关闭各器械开关，再关闭电源开关，达到保护仪器，延长使用寿命的目的。

1.3 检测方法与结果判断

用隐血实验检测清洗消毒后的内镜是否合格。先用白纱布擦拭内镜器械，然后再在白纱布上滴上一滴A试剂，等到试剂全部渗入纱布后，在滴一滴B试剂，在2 min内判读完毕。在检测时间内颜色无任何改变者即为合格，变为淡紫色、紫色或是深紫蓝色即为不合格。

1.4 统计学分析

本次实验数据采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两组内镜消毒合格率及医源性感染率比较见表1。对照组内镜消毒合格率为85.2%，实验组内镜消毒合格率为96.2%，两组内镜清洗、消毒合格率比较，χ2=113.82，P = 0.001

3 讨论

3.1 内镜器械清洗的重要性

内镜是医学中很重要的诊疗工具，临床上应用广泛，但内镜器械制作材料特殊、结构复杂、精密度高，术中血液、黏液附着在内镜器械管腔内表面，清洗不彻底将导致消毒灭菌失败，因为传统的理化灭菌方式不能有效去除血迹和微粒等，并且内镜器械一般不宜进行高温消毒，且残存在手术器械上的有机物妨碍灭菌介质穿透，影响灭菌效果，清洗不彻底可使器械管腔内的细菌病毒继续存活，从而易引发院内感染[5]。

3.2 强化硬件及软件功能

结合我院具体情况，对内镜室进行合理布局，配备一般清洗设备及专用清洗机，清洗消毒槽、超声清洗机、高压水枪、通风设备等为内镜清洗创造充足的条件[6]。完善医院制度管理，制定内镜消毒操作规范，通过对比分析，《内镜清洁消毒技术操作规范》改良措施如下：彻底清洗器械及辅助用品的污渍是保证消毒灭菌成功的关键，清洗过程中拆卸便于拆卸的各个部件，不能因为有消毒、灭菌而忽视清洗环节。保证内镜清洗、消毒、灭菌质量，能有效减少医源性感染和交叉感染。特别是有些内镜管道细长，长期不彻底清洗，内镜表面形成一种生物膜，常规的内镜清洗步骤不可能将它去除，从而造成灭菌失败，引起交叉感染[7]。同时，清洗时加酶能有效分解内镜表面及内部的各种有机物，增加洁净度[8]。所有手术器械、医疗用品及接触患者的用品都要一用一灭菌，供应中心人员要定期学习有关内镜清洗、消毒、灭菌及保养的相关知识，不断加强对新器械的学习，掌握新知识、新技能[9]。转变手术室器械管理措施，使护士由过去的被动接受仪器与器械管理，转变为参加到管理中去成为管理者中的一员，大大提高手术室内镜器械的消毒，降低器械的耗损[10]。

本项结果显示，严格按照国家卫生部规定的清洗、消毒、灭菌及保养原则操作，能保证有效的消毒灭菌效果，提高内镜清洗、消毒、灭菌的合格率，降低医院感染的风险，延长内镜的使用寿命，有利于外科腔镜手术顺利进行和发展，使医院取得良好的效益。

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【关键词】 慢病毒载体 T淋巴细胞 绿色荧光蛋白基因

Expression of Green Fluorescent Protein Gene in Mouse T Lymphocytes Mediated by Lentiviral Vector

Abstract

This study was purposed to constructe the threeplasmid system of the lentiviral vector carrying the green fluorescent protein (GFP) gene and to investigate the expression of GFP in T lymphocytes of the mouse. The polypurine tract (PPT) element， ubiquinone promoter (PUB) and GFP were ligated to plasmid pLO134 using subcloning technology to construct plasmid pTK153. Human kideny 293T cells were cotransfected with the threeplasmid system containing packaging plasmid NRF， plasmid pTK153 and envelope plasmid VSVG by using calcium phosphate DNA precipation and the expression of GFP was observed under fluorescence microscope after 12 hours. The viral particles were collected after transfection 72 hours， were frozen at -80℃ and were used to infect mouse T lymphocytes at multiplicity of infection (m.o.i .) of 3. The expression of GFP in mouse T lymphocytes was observed by fluorescence microscopy and fluorescenceactivated cell sorting (FACS). The results showed that the transfection efficacy was 63.04±7.24% in 293T cells analysed by FACS and the viral titer was (3.09±0.61)×106 U/ml. The expression of GFP was also evident in mouse T lymphocytes and the transduction efficacy was (37.98±6.26)%. It is concluded that the threeplasmid system of lentiviral vector containing GFP gene is successfully constructed and the transduction efficacy is high in mouse T lymphocytes.

Key words

lentiviral vector; mouse T lymphocytes; green fluorescent protein gene

J Exp Hematol 2007; 15(1):125-128

逆转录病毒载体（retroviral vector， RV）系统已被广泛应用于临床前及临床的基因转移研究，虽然对其复制以及转导外源目的基因至细胞的相关机理研究得较为深入，但是逆转录病毒载体不能有效转导非分裂期细胞，因而其应用于临床基因治疗受到了一定的限制［1］。围绕这一问题，近年来人们把目光投向了来源于包括人类免疫缺陷病毒1（human immunodeficiency virus1， HIV1）在内的慢病毒载体（lentiviral vector， LV）。LV最大的特点是可以感染非分裂期细胞如神经细胞、肝细胞、造血干细胞、胰岛细胞、肌肉细胞等［2］。我们构建了以HIV1为基础的LV三质粒系统，并以绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein gene， GFP）作为标志基因，观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。

LV三质粒系统的构建及鉴定

用限制性内切酶BamHⅠ和BglⅡ分别从pTK131、pTK145及pTK54切下PPT元件、PUB启动子及GFP基因，用T4DNA连接酶依次将PPT元件、PUB启动子及GFP基因连接至由BamHⅠ酶切并经牛小肠碱性磷酸酶去除5'P的载体pLO134上，连接产物转化感受态细胞DH5α，同时设立空白对照。37℃过夜培养，次日从连接板挑取6-8个克隆进行扩增培养，用Promega公司质粒小量提取试剂盒提取质粒后，分别用限制性内切酶EcoRⅠ、SacⅡ和AgeⅠ+XbaⅠ鉴定连接产物的正反向。包装质粒NRF、包膜蛋白质粒VSVG、pTK131、pTK145及pTK54均为本科徐开林教授构建。

慢病毒载体包装细胞系的建立

应用Ivitrogen 公司无内毒素的质粒中量提取试剂盒提取pTK153、NRF及VSVG用于转染。转染前24小时选择生长状态良好的293T细胞按1∶3传代，24小时后细胞生长达60%-70%汇合时采用磷酸钙沉淀法进行转染。将转移质粒pTK153 15 μg、ΔNRF 10 μg、VSVG 5 μg、CaCl2 125 μl，补加消毒的双蒸水至500 μl，在涡旋混合器上边振荡边加入500 μl 2×BES，室温放置30分钟。将转染液加到培养板中，轻轻混匀，3% CO2、37℃培养箱中培养3小时后，加入血清使其终浓度为10%，12小时后更换完全培养基，5% CO2、37℃培养箱中继续培养，并在荧光显微镜下观察荧光表达情况及FACS测定GFP阳性率。

病毒滴度测定

在6孔板中分别接种2×105的293T细胞，将所收集的上清按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6进行系列稀释，将1 ml 稀释后的病毒液分别加入到相应的孔中，48小时后在荧光显微镜下观察各孔中GFP的荧光表达情况，计数表达GFP的细胞个数，乘以相应的稀释倍数即得到病毒滴度。

病毒颗粒感染小鼠T淋巴细胞

取BALB/c小鼠脾细胞，在RPMI 1640培养液中培养3天后，用台盼蓝染色法测定活细胞数，然后按2×106/ml细胞与包装好的慢病毒颗粒按m.o.i 1∶3感染病毒颗粒，共同培养，24小时后重复感染1次。48小时后在荧光显微镜下观察GFP的表达情况或通过FACS计数GFP表达阳性率。

转贴于

结

果

载体构建

从pTK131用BamHⅠ和BglⅡ切下154 bp的PPT元件，连接至pLO134的BamHⅠ后，经EcoRI单酶切后，获得的正向连接片段为170 bp、7745 bp，构建成pTK134（PPT元件）；再连接从pTK145切下的1224 bp的PUB启动子，用SacII单酶切鉴定，正向连接所得片段为560 bp、1212 bp和7367 bp，构建出pTK151（PPT+PUB）；最后连接从pTK54切下的780 bp的GFP基因，用AgeI和XbaI酶切鉴定，正向连接所得片段为800 bp和9125 bp，获得转移质粒pTK153（PPT+PUB+GFP）。

慢病毒载体的包装

用磷酸钙沉淀法将构建好的三质粒pTK153、NRF及VSVG转染293T细胞后，12小时在荧光显微镜下观察到293T细胞中表达绿色荧光（图1），证实了GFP基因的表达。转染72小时后荧光显微镜下再观察发现细胞中荧光强度较12小时时有所增强，FACS分析转染效率为（63.04±7.24）%，从而建立了慢病毒载体系统的包装细胞系。

病毒滴度的测定

将转染72小时后包装细胞上清液再感染293T细胞，48小时后测定6孔板中慢病毒载体的滴度。在未进行超速离心的情况下，病毒滴度测定结果为（3.09±0.61）×106 U/ml。与常用的逆转录病毒载体的滴度相近，说明慢病毒载体包装后容易获得较高的病毒滴度。

感染T细胞情况

感染小鼠T淋巴细胞48小时后，荧光显微镜下观察到T淋巴细胞内含有绿色荧光（图2），证实GFP基因在其中的表达，FACS分析转导效率为（37.98±6.26）%，较本实验室同样条件下逆转录病毒载体感染小鼠T淋巴细胞的效率（23.2±3.5）%为高（P＜0.01）。

讨

论

作为基因治疗中常用的靶细胞，T淋巴细胞是处于非分裂期的细胞，在移植物抗宿主病等疾病中起到重要的作用。提高目的基因对T细胞的转导效率对于对这类疾病实施基因治疗具有重要的意义，这是目前研究的重点和难点。寻找新型的载体是其中的方法之一。常用的逆转录病毒载体对其转导效率较低，本实验室既往应用其转导T淋巴细胞转导效率为（23.2±3.5）%［3］，采用慢病毒载体后，转导效率达到（37.98±6.26）%，有较明显的提高。慢病毒载体最大的特点是可以感染非分裂期细胞，这是由其自身结构所决定的［4］。HIV1为RNA双链分子，其单链由9 749个核苷酸组成，共有9个基因，除包括与简单逆转录病毒相同的gag、pol和env 3个编码病毒颗粒的基本结构基因外，还有2个调节基因tat和rev及4个辅助基因vif、vpr、vpu和nef。在病毒复制的过程中，gag编码的基质蛋白、pol编码的整合酶和vpr辅助蛋白形成整合前复合物，其本身具有核定位信号，有利于整合前复合物进入靶细胞核，而不完全依赖靶细胞的分裂状态，此为慢病毒可感染非分裂细胞的主要机制［5］。

目前慢病毒多采用三质粒表达系统，包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒，其中包装质粒在CMV启动子的控制下，表达HIV1复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G蛋白（VSVG），应用VSVG包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度；转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留350 bp的gag和RRE，并在其中插入目的基因。将载体系统分成三个质粒最大的益处是使序列重叠的机会大大减少，减少载体重组过程中产生有复制能力野生型病毒的可能性。通过三质粒共转染293T细胞，超速离心后病毒滴度可达109 U/ml［6］。

在本实验中我们成功构建了以PUB启动子为内部启动子、GFP基因为标志基因的慢病毒载体的三质粒包装系统。三质粒系统中的包装质粒ΔNRF，内含人巨细胞病毒早期启动子和来自胰岛素基因的Poly(A)位点；包膜蛋白质粒编码VSVG。转移质粒中以GFP基因作为标志基因，利用GFP基因作为标志基因可以非常直观、方便地观察到实验结果，缩短了实验流程。将此三质粒转染293T细胞后，荧光显微镜下观察到了GFP的表达，建立了慢病毒载体的包装细胞系。病毒滴度的测定在未进行超速离心的情况下仍然达到106 U/ml，与常用的逆转录病毒载体滴度相近，说明应用慢病毒载体比较容易获得较高的病毒滴度，这对于进一步感染靶细胞获得较高的转导效率是至关重要的。

虽然我们试验中对T细胞的转导效率有所提高，但是要将其大规模应用还不能达到要求，分析其中原因可能与未进行超速离心浓缩病毒颗粒获得较高的病毒滴度以及未进行G418筛选等有关系。但G418筛选过程操作费时，工艺复杂，筛选过程中损失大量的T淋巴细胞是其缺陷，而加大病毒用量提高m.o.i.比率和重复感染的方法可以提高基因转导效率，但势必需要更多的病毒产出。有报道应用流动感染的方法可以提高病毒感染效率达90%［7］，操作简单、省时、病毒用量少、不需重复感染，对此我们将在以后的工作中作进一步的尝试。

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关键词 姜黄素 肝癌细胞 低密度脂蛋白受体 基因表达 小鼠 流式细胞仪

血清低密度脂蛋白胆固醇酯(LDL-C)的增高是引起动脉粥样硬化及心血管疾病的主要危险因子之一。现在已很清楚低密度脂蛋白受体介导的内吞作用在低密度脂蛋白的代谢过程中起着重要作用。因此，通过药物调节低密度脂蛋白受体的表达是控制血浆低密度脂蛋白胆固醇酯水平的一个有效途径。近年的研究显示姜黄素具有显著降低血清脂质过氧化物，增加高密度脂蛋白胆固醇，降低血清总胆固醇含量水平，以及调节脂蛋白代谢相关酶活性的作用[1-3]。肝脏是LDL-C代谢的主要器官，肝细胞膜上有表达丰富的低密度脂蛋白受体。为探讨姜黄素调节血脂作用的分子机理，实验以小鼠肝癌细胞系Hca-F为材料，用姜黄素处理后，应用激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪对肝细胞摄取胞外DiI-LDL，进行定性、定量分析。

1 材料与方法

1．1 材料：小鼠肝癌细胞系Hca-F购自中国科学院细胞库；PRMI-1640培养基（Lot#1165062）为美国Gibcobrl公司产品；新生牛血清购自杭州四季青生物制品有限公司；姜黄素为标准品，购自安徽甙尔塔天然有机化合物信息中心；健康成人血浆购自浙江省中心血站；DiI荧光素（Lot#970807）购自美国Biotium公司；细胞培养板与培养瓶购自丹麦Nunclon公司；AKTA prime蛋白纯化系统为瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司产品；Biofuge stratos超速冷冻离心机为德国Heraeus公司产品；80MX超高速离心机为日本日立公司产品；激光扫描共聚焦显微镜和FACSort流式细胞仪（美国ABBOTT）。

1．2 DiI-LDL的制备：取健康成人血浆，用序列超速离心法,以NaBr调节密度至1．019g/ml，用RT50转头，40000r/min，4℃离心22h。上层为乳糜微粒（CM）和极低密脂蛋白（VLDL），小心吸去。将余下血浆用NaBr调节密度至1．060g/ml，同样条件离心22h，所得上层溶液即为LDL。小心收集至50ml离心管，共得15ml。将得到的LDL装入透析袋，在4℃冰箱中用1000ml含0．02%NaN3的生理盐水透析，以除去高浓度的NaBr。12h换透析液1次，透析24h。取出后用聚乙二醇6000浓缩2h，最终得2ml浓缩液。进一步纯化使用Sepharose 6B柱，以含0．9%NaCl、0．02%NaN30．01mol/L的PBS溶液作为洗脱液，用AKTA prime蛋白纯化系统分离蛋白质。分离条件：加样量：2ml；流速：0．3ml/min；收集：2ml/管；测定电压：1mV；走纸：0．2mm/min。对分离所得的第二个蛋白质洗脱峰用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳分析，证实该蛋白质确为LDL。根据记录仪所显示的LDL峰，取相应试管中的液体，合并为一管，共得34ml。将得到的LDL装入透析袋，再用聚乙二醇6000浓缩5h，得到10ml的LDL，以Folin-Lowrry氏法测定LDL蛋白质浓度。取2ml的LDL溶液与100mg不溶性马铃薯淀粉置于试管中涡旋震荡，然后加入60μl DiI(用甲醇溶解，浓度为10mg/ml)4℃放置1h，液氮迅速冷冻，真空干燥器冷冻干燥，然后加入2ml 10mmol/L的Tricine azide(pH8．2)，4℃冰箱中孵育48h，每隔一定时间取出混匀1次。4℃2000r/min离心15min，去淀粉沉淀。取上清，用Biofuge stratos超速冷冻离心机于4℃下12000r/min离心15min，取上清，重复离心1次，所得的上清含DiI-LDL，以Folin-Lowrry氏法测定上清液中的蛋白质浓度[4]。分装，充氩气，4℃保存（该试剂不可冰冻，4℃下可保存1～2个月）。

1．3 细胞培养与LDL的吸收测定：取一块24孔培养板，将小鼠肝癌细胞系Hca-F培养在含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液中，1．0×106个细胞/ml，2．5ml1640培养液/孔。实验设给药组、对照组、背景控制组。给药组（又分4组）：培养孔中分别加入姜黄素贮存原液，使其终浓度分别达到10、20、30、40μM。对照组和背景控制组不用姜黄素处理。24h后，各孔取1．5ml细胞液分别至1．5ml离心管中，3500r/min离心5min，去上清。各管加1ml无血清PRMI-1640培养液洗细胞2min，3500r/min离心5min，去上清。背景控制组，加1ml4%的甲醛固定细胞10min，使LDL受体功能失活。3500r/min离心5min,去上清。加1ml含15μg/mlDiI-LDL的无血清PRMI-1640培养液。其它各组分别直接加1ml含15μg/ml的DiI-LDL的无血清PRMI-1640培养液。各管在37℃下孵育4．5h，然后4℃下孵育0．5min，3500r/min离心5min,去上清。加1ml4%的甲醛固定细胞10min)。接着用PBS洗3次[5]。激光扫描共聚焦显微镜观察各组细胞，并用流式细胞仪定量测定细胞对DiI-LDL的吸收量。

2 结果

2．1 DiI-LDL配体荧光法检测结果：通过LDL-R介导的内吞作用，肝细胞能够吸收溶液中的DiI-LDL。细胞内积累的荧光染料量反映了细胞表面LDL-R的活性[6]。激光扫描共聚焦显微镜观察结果表明10～40μM浓度的姜黄素诱导具活性的LDL-R的表达，增加肝细胞LDL-R的活性（详见图1）。

2．2 流式细胞仪定量测定结果：应用流式细胞仪可检测和定量分析细胞对DiI-LDL的摄取量。结果表明10～40μmol/L浓度的姜黄素显著增加肝细胞LDL-R的活性(详见图2、图3)。

3 讨论

根据LDL受体介导的内吞途径，一个LDL受体往返细胞内外1周约需10min，因此在其20h的寿命中可以往返达数百次。这就意味着一个有功能的LDL受体可以摄取数百个LDL颗粒进入细胞。利用LDL受体的这一功能，我们可以通过对其配体LDL进行荧光素标记后，与细胞一起孵育，应用激光扫描共聚焦显微镜即可快速地定性检测，应用流式细胞仪则可方便、准确、

快速地进行定量分析。选用小鼠肝癌细胞系Hca-F，一方面，肝脏是LDL-C代谢的主要器官，肝细胞膜上有表达丰富的低密度脂蛋白受体。另一方面，Hca-F为悬浮培养细胞，非常适合用流式细胞仪分析。提高LDL-R的活性和降低血清LDL水平是防止动脉粥样硬化及心血管疾病的有效途径。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶是肝细胞合成胆固醇的限速酶。它的抑制剂，如他汀类，有些已作为降胆固醇药用于临床，但最近的研究表明，他汀类药物存在一些潜在的副作用，如肝损伤、肌痛、多发性神经疾病等[7-8]。

现代药理实验和临床试验也证明中药姜黄可以通过调节血脂水平而起到治疗高胆固醇血症和动脉粥样硬化症的作用，进一步的研究显示姜黄素是这一药物中最具活性的调脂化合物，并证明具有上调小鼠巨噬细胞[9]和人永生化淋巴细胞LDL受体基因表达的作用[5]。本实验进一步证明姜黄素是一个非常强的LDL受体基因表达促进剂，能极其显著地增加肝细胞对LDL的摄取。

如果病人的LDL-R都是没有活性的，那么仅仅增加其表达量是没有意义的。但是绝大数家族性高胆固醇血脂的患者是LDL-R缺陷型的杂合子。他们产生二分之一数量功能正常的LDL-R，他们血浆中LDL颗粒的数量比正常人平均要高2．5倍[10]。实验表明姜黄素足以能够将巨噬细胞和肝细胞的LDL-R数量调高1倍，从而降低异常升高的血浆LDL水平。很显然，姜黄素将是一个潜在的有效降胆固醇新药。

4 参考文献

［1］沃兴德，崔小强，唐利华.姜黄素对食饵性高脂血症大鼠血浆脂蛋白代谢相关酶活性的影响［J］.中国动脉硬化杂志，2003，7(4):339-341.

［2］Soni K.B.Kuttan R.Effect of oral curcumin administration on serum peroxides and cholesterol levels in human volunteers［J］. Indian J Physiol Pharmacol，1992，36(4):273-275.

［3］Babu P.S. Srinivasan K. Hypolipidemic action of curcumin, the active principle of turmeric (Curcuma longa) in streptozotocin induced diabetic rats［J］. Mol Cell Biochem， 1997，166(1-2):169-75.

［4］范春雷，沃兴德，罗艳,等.姜黄素对爪蟾卵母细胞人LDL受体表达的影响［J］.中国中西医结合杂志，2005，25（5）：432-435.

［5］窦晓兵，范春雷，洪行球，等.姜黄素对人淋巴细胞人低密度脂蛋白受体表达影响的研究［J］.中国药学杂志，2005，40(13):980-982.

［6］Thierry Grand-Perret, Anne Bouillot, Aurélie Perrot, et al.SCAP ligands are potent new lipid-lowering drugs［J］. Nature Medicine ，2001， 7(12):1332-1338.

［7］Guis S., Bendahan D., Kozak-Ribbens G., et al. Rhabdomyolysis and myalgia associated with anticholesterolemic treatment as potential signs of m alignant hyperthermia susceptibility［J］. Arthritis Rheum 2003， 49: 2379-2388.

［8］Gaist D., Jeppesen U., Andersen M., et al. Statins and risk of polyneuropathy［J］. Neurology， 2002， 58:1333-1337.

［9］Fan Chunlei,Qian Ying,Wo Xingde,et al. Effect of Curcumin on the Gene Expression of Low Density Lipoprotein Receptors［J］. Chin J Integr Med，2005，11(3):201-204.

摘要：目的 观察热毒宁注射液对病毒性心肌炎（VMC）小鼠血浆SOD活性及MDA含量的影响，探讨热毒宁注射液对病毒性心肌炎小鼠的抗炎保护作用。方法 40只雄性BALB/c小鼠随机分为四组：空白组（A组）、模型组（B组）、更昔洛韦注射液组（C组）、热毒宁注射液组（D组），每组10只。A组腹腔注射0.5 ml生理盐水，连续注射10 d；B、C、D各组首先腹腔注射巨细胞病毒（CMV）悬液0.1 ml，0.5 min后分别注射生理盐水、更昔洛韦注射液、热毒宁注射液各0.4 ml，连续治疗10 d；10 d后采集血液，采用采用黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法检测血清SOD活性及MDA含量。结果 与B组相比，C、D组小鼠的SOD活性显著升高，MDA含量明显降低（P

关键词：病毒性心肌炎；热毒宁注射液；SOD；MDA；小鼠

心肌炎主要是由病毒感染、化学物质损伤或自身免疫引起的心肌局灶性或弥漫性炎性病变。心内膜穿刺的病理检查结果表明，大约60%心肌炎患者的心肌细胞病毒检测为阳性[1]，这种因病毒感染心肌细胞而引起的心肌炎称为病毒性心肌炎。大约有20%病毒性心肌炎患者逐渐演变为扩张型心肌病，其致残致死率高[2]。能引发心肌炎的病毒较多，其中以柯萨奇病毒感染最为常见，CMV也是侵犯心肌的重要病毒之一。近年来，病毒性心肌炎患者发病率逐年上升，但具有明确疗效的治疗药物却为数不多。本课题研究了热毒宁注射液对巨细胞病毒性心肌炎小鼠的抗炎保护作用。

1 资料与方法

1.1实验病毒、动物 CMV由徐州医学院附属医院急诊实验室赠予，40只6～8w龄雄性BALB/c健康小鼠，体重25 g左右，购自湖北医药学院实验动物中心。

1.2实验试剂、药物SOD及MDA测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，更昔洛韦注射液购自湖北科益药业有限公司，热毒宁注射液由连云港康缘药业有限公司生产。

1.3动物分组、取材 将40只6w龄雄性BALB/c健康小鼠随机分为四组：空白组（A组）、模型组（B组）、更昔洛韦注射液组（C组）、热毒宁注射液组（D组），每组10只。A组腹腔注射0.5 ml生理盐水，连续注射10 d；B、C、D各组首先腹腔注射10-4LogTCID50CMV悬液0.1 ml[3]，0.5 min后分别注射生理盐水、更昔洛韦注射液、热毒宁注射液各0.4 ml，连续治疗10d； 10 d后眼球摘除取血法采集血液约1.0 ml，离心后，-20℃冰箱中保存，以检测SOD活性及MDA含量。

1.4血清SOD及MDA含量检测 按照SOD及MDA试剂盒说明书步骤进行操作，检测SOD及MDA含量。

1.5统计学处理 计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS13.0软件处理数据。多组定量资料间的比较进行方差齐性检验，若方差齐采用单因素方差分析，若方差不齐采用Dunnett's T3（3）检验。单因素方差分析中的两两比较采用SNK法检验，检验水准为α=0.05，P

2 结果

与模型组相比，热毒宁组、更昔洛韦组SOD活性显著升高，MDA含量明显降低（P0.05）。见表1。

3 讨论

心肌炎是一种弥漫性或局限性的心肌炎性病变，其详细发病机制尚不清楚，可能与病毒本身对心肌的直接损伤及其引起的免疫反应有关[4]，目前缺乏特效的病毒根治方法。热毒宁注射液是复方中草药注射剂，有效成分为青蒿、金银花、栀子，具有解热、抗病毒、抗细菌、增加免疫等药理作用。现代药理学研究表明，青蒿含倍半萜内酯、黄酮类、青蒿酮，具有抗病毒、解热、抗炎、抗氧化、镇痛等作用。

VMC的发生与脂质过氧化反应增强有关，VMC时受损的心肌细胞产生的氧自由基破坏了原来的动态平衡，引发了脂质过氧化反应，而氧自由基的清除依赖抗氧化酶系的作用[5]。SOD是抗氧化酶系中的主要抗氧化酶，其活性高则抗氧化作用强。MDA是脂质过氧化反应的中间产物，其含量多少体现了氧化损伤的程度。

本研究结果显示，热毒宁注射液组小鼠SOD活性升高，MDA含量降低，但与更昔洛韦组无明显差别，表明热毒宁注射液具有抗氧化作用，其可使VMC小鼠的SOD活性升高，清除过表达的氧自由基，改善动态失衡，减少脂质过氧化反应，从而减少中间产物MDA含量抑制炎症反应。为临床热毒宁注射液治疗病毒性心肌炎提供了实验依据，但热毒宁注射液治疗病毒性心肌炎的具体作用靶点尚有待于进一步研究。

参考文献：

[1]Luo H ， Wong J ， Wong B .Protein degradation systems in viral myocarditis leading to dilated cardiomyopathy[J].Cardiovascular Research， 2010， 85（2）： 347-356.

[2]Olimulder MA， Van Es J， Galjee MA.The importance of cardiac MRI as a diagnostic tool in viral myocarditis induced cardiomyopathy[J]. Netherlands Heart Journal， 2009， 17（12）： 481-486.

[3]WangYX， Da Cunba V， MartinMcNuhy B. Inhibition of Rho-kinase by fasudil attenuated Angiotensin II induced cardiac hypertrophy in apolipoprotein E deficient mice[J].Eur J Pharmacol， 2005， 512（223）：215-222.