皮质 - 纹状体回路是运动学习过程所必需的，并且M2皮质向纹状体的投射与HD小鼠所具有的运动学习缺陷有关。此外，M2皮质除参与运动学习外，还涉及多种功能，如决策和知觉行为，这在众多综述中已有提及。在这方面，来自M2皮质的锥体束神经元同侧投射到纹状体，并且还向丘脑、丘脑底核、上丘（SC）、脑桥和脊髓发出侧支轴突。然而，M2皮质回路在HD病理学中的作用除了在基底神经节方面外尚未被探究。

在本研究中，我们旨在利用R6/1 HD小鼠模型确定其他M2皮质回路对HD病理学的影响。首先，我们通过体内静息态功能磁共振成像（fMRI）技术绘制了野生型（WT）和HD小鼠中M2皮质与大脑其余部分功能连接性的改变。然后，我们选择上丘（SC）作为关键的M2皮质目标脑区，并通过弥散磁共振成像（MRI）分析研究了M2皮质 - 上丘通路的结构连接性。为了确定HD小鼠中M2皮质 - 上丘的功能改变，我们利用了光遗传学工具、光纤光度法、化学遗传学以及上丘依赖性的对意外视觉刺激（如移动的机器甲虫的出现和意外闪光）的行为反应。总之，我们的结果表明M2皮质活动参与了视觉刺激诱导的行为反应，并且在R6/1 HD小鼠模型中M2皮质活动受到严重损害。

二、 材料与方法

2.1 动物

实验使用R6/1转基因小鼠（B6CBA背景；RRID：IMSR_JAX:002809）进行，在实验时这些小鼠表达具有约145个CAG重复的突变型亨廷顿蛋白外显子1，以其年龄匹配的野生型同窝小鼠作为对照。小鼠购自杰克逊实验室（The Jackson Laboratory），混合基因型分组饲养在一起，在19°C - 22°C、40% - 60%湿度、12:12小时光照/黑暗循环的饲养室中可自由获取食物和水。通过耳部活检进行聚合酶链反应（PCR）确定基因型，将小鼠随机分配到实验组，并记录数据以便通过微芯片小鼠编号进行分析。

雄性和雌性小鼠在12周龄时进行症状前行为筛选；雄性小鼠在症状期（约20周龄）进行实验测试。如有需要，在测试前4周（16周龄小鼠）进行立体定位手术。基于实验室先前的数据对功能磁共振成像（fMRI）和行为实验进行了功效分析，考虑功效为0.8、α为0.05、标准差为20%，得出行为实验的样本量N = 12。整个手稿的图注中给出了N值（生物重复次数）。每个实验只进行一次。所有动物操作均按照西班牙RD 53/2013和欧洲2010/63/UE关于实验室动物的护理和使用规定进行，并得到巴塞罗那大学（Universitat de Barcelona）和加泰罗尼亚自治区（Generalitat de Catalunya）动物实验伦理委员会的批准。

2.2 磁共振成像（MRI）采集

实验在一台7.0T BioSpec 70/30水平动物扫描仪上盲法进行，该扫描仪配备有主动屏蔽梯度结构（400 mT/m，内径12 cm）。为评估感兴趣区域（ROIs）之间的连接性，17 - 20周龄的小鼠（n = 11只野生型，n = 13只R6/1型）进行了结构T2加权成像、弥散加权成像（DWI）和静息态功能磁共振成像（rs - fMRI）。将动物置于仰卧位的有机玻璃固定器中，使用牙棒、耳棒和胶带固定；使用带有鼻锥的有机玻璃固定器给予麻醉气体组合[美托咪定（单次推注0.3 mg/kg，输注0.6 mg/kg/h）和异氟烷（0.5%）]。

通过三维定位扫描确保头部在磁体等中心的正确位置。使用快速采集弛豫增强（RARE）序列获取T2加权图像[有效回波时间（TE）= 33 ms，重复时间（TR）= 2.3 s，RARE因子 = 8，体素大小 = 0.08×0.08 mm²，层厚 = 0.5 mm]。使用平面回波成像（EPI）序列采集弥散加权成像（DWI）[重复时间（TR）= 6s，回波时间（TE）= 27.7 ms，体素大小0.21×0.21 mm²，层厚 = 0.5 mm，30个b = 1000 s/mm²的梯度方向以及5个无弥散加权的基线图像]。使用平面回波成像（EPI）序列进行静息态功能磁共振成像（rs - fMRI）采集[重复时间（TR）= 2 s，回波时间（TE）= 19.4 ms，体素大小0.21×0.21 mm²，层厚 = 0.5毫米]；采集420个容积，总扫描时间为14分钟。

成像环节完成后，注射阿替美唑和生理盐水以逆转镇静作用并补充体液流失。

2.3 功能连接性分析

如先前所述进行基于种子点（seed - based）的分析，以评估M2皮质与大脑其余部分的功能连接性。静息态功能磁共振成像（rs - fMRI）数据的预处理包括：层面定时、使用SPM8进行空间重排以校正运动、使用ANTs进行弹性配准到T2加权像以校正平面回波成像（EPI）扭曲、去趋势、平滑处理（半高全宽（FWHM）= 0.6毫米）、对0.01 - 0.1赫兹之间的时间序列进行频率滤波，以及使用NiTime根据运动参数进行回归分析。

根据基于磁共振成像（MRI）的小鼠脑图谱确定脑区分割。原始图谱中定义的感觉运动皮质被手动划分为躯体感觉皮质（Som）、眶额皮质（OFC）、初级运动（M1）皮质、M2皮质、扣带皮质（Cg）、内侧前额叶皮质（mPFC）和压后皮质（RS）。使用ANTs将图谱模板弹性配准到每个个体的T2加权像，最后应用于标记图以获得每只动物的特定脑区分割。将脑区分割从T2加权像配准到静息态功能磁共振成像（rs - fMRI）图像。选择左侧M2皮质作为基于种子点分析的种子区域。提取M2皮质中的平均时间序列，并与大脑内所有体素的时间序列进行相关分析，从而得到一个包含每个体素的血氧水平依赖（BOLD）信号时间序列与种子时间序列之间相关性值的连接图。种子到区域的连接性计算为每个区域的相关性图的平均值，仅考虑正相关。

2.4 结构连接性分析

基于T2加权像中的自动识别区域和弥散加权成像（DWI）的纤维束成像（tractography）结果，识别并表征连接M2皮质与上丘（SC）的纤维束。估算弥散张量图像（DTI），并计算标准的弥散张量成像指标，包括分数各向异性（FA）、平均弥散率（MD）、轴向弥散率（AD）和径向弥散率（RD）。为估算纤维束，对弥散加权成像（DWI）进行预处理，包括使用FSL进行涡流校正、去噪。将5个基线图像取平均值并配准到T2加权像以校正平面回波成像（EPI）扭曲。使用基于约束性球形反卷积模型的确定性算法进行全脑纤维束成像，将分数各向异性（FA）> 0.1的体素视为种子点。将相同的阈值定义为算法的停止标准。一旦识别出纤维束，就计算其平均的分数各向异性（FA）、平均弥散率（MD）、径向弥散率（RD）和轴向弥散率（AD）。

图1. 使用静息态功能磁共振成像（rs - fMRI）进行的功能连接性分析表明，在20周龄的亨廷顿病（HD）小鼠中，上丘（SC）是与M2皮质连接中断最严重的脑区。A，基于图谱自动分割进行功能连接性分析的解剖区域。B，野生型（WT）和亨廷顿病（HD）的R6/1小鼠模型中左侧M2皮质的平均功能连接性图。当> 0.15时，彩色图表示平均相关值。C，表示左侧M2皮质与分析的所有左侧半球脑区的平均功能连接性。每个区域基于种子点的相关性图的平均值代表M2皮质与每个区域之间的功能连接性。每个点代表一只单独小鼠的数据。以基因型和脑区为因素进行双因素方差分析（Two - way ANOVA），随后进行邦费罗尼（Bonferroni）事后比较检验。数据为平均值±标准误（野生型（WT）n = 11只小鼠，亨廷顿病（HD）n = 13只小鼠；17周龄小鼠）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，亨廷顿病（HD）组与野生型（WT）组相比。A，杏仁核；Acd，伏隔核；BNST，终纹床核；Cg，扣带皮质；Ent，内嗅皮质；Pir，梨状皮质；AI，无颗粒岛叶皮质；GP，苍白球；Hip，海马；H，下丘脑；MM，内侧乳头体核；SN，黑质；Me，中脑核；mPFC，内侧前额叶皮质；OB，嗅球；OFC，眶额皮质；PAG，导水管周围灰质；PA，视前区；M1，初级运动皮质；M2，次级运动皮质；RS，压后皮质；Som，次级躯体感觉皮质；Str，纹状体；Thal，丘脑；VP，腹侧苍白球。

2.5 立体定位手术

我们使用了不同的腺相关病毒（AAV）：在钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CamKII）启动子下的AAV - ChR2病毒构建体（AAV1 - CaMKIIa - hChR2（H134H）- eYFP - WPRE.hGH；产品编号AV - 1 - 26969P，宾夕法尼亚大学 - 宾州载体核心（University of Pennsylvania - Penn Vector core））用于光遗传学调控；在突触蛋白（SYN）启动子下的AAV - GCaMP6f病毒构建体（AAV9 - SynGCaMP6f - WPRE - SV40；Addgene产品编号100837 - AAV9）用于光纤光度分析。在人突触蛋白（hSyn）启动子下的AAV - hM3D（Gi）病毒（AAV5 - hSyn - hM3D（Gi）- mCherry；产品编号50475 - AAV5）用于化学遗传学抑制。病毒的生产、扩增和纯化由宾夕法尼亚大学 - 宾州载体核心（University of Pennsylvania - Penn Vector Core）和Addgene完成（滴度：约1×10¹²基因组颗粒/毫升）。

图2. 扩散指标显示亨廷顿病（HD）小鼠M2皮质 - 上丘（SC）束的结构改变。A，野生型（WT）和亨廷顿病（HD）的R6/1小鼠模型中连接M2皮质区域与上丘（SC）的代表性纤维束。M2皮质和上丘（SC）区域根据图谱自动划分。B、E，M2皮质和上丘（SC）之间纤维束的扩散指标分析包括（B）分数各向异性（FA）、（C）平均弥散率（MD）、（D）轴向弥散率（AD）和（E）径向弥散率（RD）。每个点代表一只单独小鼠的数据。进行了非配对学生t检验。数据为平均值±标准误（野生型（WT）n = 11只小鼠，亨廷顿病（HD）n = 13只小鼠；约20周龄小鼠）。**p < 0.01。

图3. 区域扩散指标显示亨廷顿病（HD）小鼠上丘（SC）的微观结构得以保留。A，在20周龄的野生型（WT）和R6/1小鼠的上丘（SC）中测量了分数各向异性（FA）、（B）平均弥散率（MD）、（C）轴向弥散率（AD）和（D）径向弥散率（RD）。每个点代表一只单独小鼠的数据。进行了非配对学生t检验。数据为平均值±标准误（野生型（WT）n = 11只小鼠，亨廷顿病（HD）n = 13只小鼠；约20周龄小鼠）。

图4. 对亨廷顿病（HD）和野生型（WT）小鼠上丘（SC）中M2皮质末端的光遗传学刺激诱发了相似的电生理反应。A，在M2皮质注射AAV - CamKII - ChR2 - YFP构建体的示意图。B，包含上丘（SC）且有来自表达ChR2的M2皮质轴突的冠状切片中多电极阵列（MEA）的代表性位置。C，在野生型（WT）和亨廷顿病（HD）小鼠的上丘（SC）中，随着光强度增加而触发的场兴奋性突触后电流（fPSC）的幅度。数据为平均值±标准误（野生型（WT）n = 7只小鼠，亨廷顿病（HD）n = 8只小鼠；21周龄小鼠）。

对16周龄的小鼠在异氟烷麻醉（5%诱导，1.5%维持）下进行立体定位手术。手术前注射美洛昔康（2毫克/千克，皮下注射）以避免疼痛和减轻炎症。使用带有33号针头的5微升汉密尔顿注射器，以0.1微升/分钟的速度将0.5微升相应的病毒构建体注射到M2皮质（距前囟和硬脑膜的距离：前后（AP）2.46毫米，左右（ML）±1毫米，上下（DV） - 0.8毫米）。为使病毒颗粒扩散并避免回流，将针头再留置5分钟。在开始行为实验前，动物被饲养以实现病毒表达并从手术中恢复，时间至少为4周。

东莞富临医疗科技有限公司是 Doric Lenses 亚洲代理商，为亚洲客户供应 Doric Lenses 电生理产品与配套产品。

2.6 行为评估

所有行为测试均由经验丰富的观察者在光照期进行。测试前动物在实验室适应至少1小时。每次测试之间，所有测试设备都用水清洗并干燥，不同动物测试之间也是如此。

2.7 “甲虫狂热任务”（BMT）

“甲虫狂热任务”（BMT）用于评估小鼠对意外移动的甲虫（Nano Nitro，赫克斯虫（Hexbug））的被动恐惧反应，特别是主动恐惧反应。该测试在一个白色长方形场地（15×40×30厘米）中进行，光线较暗（约20勒克斯）。简而言之，测试包括两个连续的5分钟阶段：在习惯化阶段，小鼠自由探索场地。在此期间，使用SMART 3.0软件（Panlab）记录小鼠的移动距离和直立次数。在测试阶段，对与不规则移动的机器甲虫的遭遇情况进行评分。将机器甲虫放置在距离小鼠最远的场地位置，然后分析以下行为反应：（1）逃避，小鼠朝着与甲虫移动方向相反的方向快速跳跃（飞奔）；（2）耐受，与机器甲虫接触后无视它；（3）接近，小鼠近距离跟随机器甲虫；（4）回避，小鼠朝着与机器甲虫相反的方向行走；（5）总反应，所有评估事件的总和。如先前所述，逃避事件以总反应进行归一化，而耐受、接近和回避则以这三个参数（不包括逃避事件）的总和进行归一化。

2.8 光诱导运动

该任务用于评估自由活动小鼠的光触发行为。场地由一个狭长的通道（8×150×30立方厘米）组成，通道光线较暗（约20勒克斯），在通道起点和终点等距离处放置一个明亮的白色灯泡。将小鼠放置在通道的一端，让其自由走向另一端；然后，当小鼠经过灯泡下方时，会触发一个持续约1秒的上方闪光（CLED_405，多丽克镜头（Doric Lenses）），该闪光以572.21兆赫兹进行调制，通过1米长的衰减光纤跳线（纤芯400微米，数值孔径0.48）被导向并耦合到个性化荧光微型立方体（iFMC7，多丽克镜头（Doric Lenses））中。组合的465纳米和405纳米的光被发射到一个带尾纤（纤芯400微米，数值孔径0.57）的光纤旋转接头（多丽克镜头（Doric Lenses）），该接头连接到一个低自发荧光单光纤跳线（纤芯400微米，数值孔径0.57），从而可对小鼠进行自由活动测试，最后通过黑色覆盖的氧化锆（Zicronia）套管与植入的光纤套管（见立体定位手术）连接。发射的荧光通过微型立方体和光谱反射回来，由多丽克（Doric）的荧光检测放大器进行检测和放大。数据被发送到光纤光度控制台。每次实验前，光纤跳线要进行3小时的漂白处理。在任务开始前5分钟将小鼠与光纤连接，并打开465纳米和405纳米的发光二极管（LED）以确保稳定的光度记录。

在自由活动的小鼠中，使用免费的多丽克神经科学工作室（Doric Neuroscience studio）软件以12,000赫兹的频率记录原始和已解调的465纳米和405纳米荧光强度数据。已解调的数据由Metofico提供的基于MATLAB的定制软件进一步处理。简而言之，数据被下采样到1赫兹，并使用定制数字滤波器去除伪影。荧光增量以基线（ΔF/F₀）进行归一化，基线为引入甲虫前1分钟窗口内的平均荧光值。为校正运动伪影，从归一化的465纳米信号中减去归一化的405纳米信号。

2.9 化学遗传学抑制

使用仅由设计药物激活的设计受体（DREADD）系统使M2皮质失活。根据研究人员的方法，在M2皮质表达AAV5 - hSyn - hM3D（Gi）- mCherry的小鼠在“甲虫狂热任务”（BMT）前约40分钟腹腔注射氯氮平 - N - 氧化物（CNO，BML - NS105 - 0025，恩佐（Enzo））（1.5毫克/千克）或生理盐水作为对照。

2.10 光遗传学刺激和多电极阵列（MEA）记录

按照先前描述的方法进行电生理记录。简而言之，在冰冷的充氧人工脑脊液（aCSF，95% O₂，5% CO₂）中，使用振动切片机将小鼠大脑冠状切片切成350微米厚，然后转移到32°C的充氧恢复溶液中15分钟。切片随后在室温下的充氧人工脑脊液（aCSF）中转移并放置至少1小时后再进行记录。

由一位不知情的实验者使用多通道系统（Multi Channel Systems）的多电极阵列（MEA）装置记录电生理数据。多通道系统（Multi Channel Systems）的MC刺激（MC Stimulus）和MC架（MC Rack）软件用于刺激、记录和信号处理。在记录过程中，我们使用数码相机评估切片在电极区域的正确位置。

通过对M2皮质传入纤维进行光遗传学刺激（使用强度逐渐增加（0.024、0.033、0.911、4.23、10.2、19.8、44.8和79.0毫瓦/平方毫米）的1毫秒473纳米光脉冲，由473纳米二极管泵浦固体激光器（Laserglow）发射），记录上丘外侧（lateral SC）的场兴奋性突触后电流（fPSCs）。激光器大致放置在切片表面，位于距前囟约 - 4.04毫米、距颅骨腹侧 - 1.75毫米、距中部外侧±1.45毫米处，对应于上丘外侧（lateral SC）。在1毫秒光刺激序列后分析上丘（SC）中的诱发场兴奋性突触后电流（fPSCs）反应。

2.11 免疫组织化学

通过颈椎脱臼处死小鼠，取脑并用4%多聚甲醛（PFA）后固定以进行免疫组织化学分析，在含0.02%叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水（PBS）/蔗糖梯度（从死后48小时的15%到死后32小时的30%）中脱水，速冻并储存在 - 20°C。在振动切片机（Leica VT1000S）上切取30微米厚的切片，并在含0.02%叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中于4°C保存。使用抗绿色荧光蛋白（GFP）抗体（1:500，#11122，研究资源标识符（RRID）：AB_221569）来评估AAV - YFP、AAV - GCAMP6f的表达。游离切片在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤，在含0.3%曲拉通X - 100（Triton X - 100）和3%正常山羊血清的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中通透化和封闭15分钟。切片再次在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤，并在4°C下与一抗孵育过夜。脑切片再次洗涤，与二抗（1:200山羊抗兔Cy3），产品编号111 - 165 - 003，研究资源标识符（RRID）：AB_2338000）孵育2小时，然后使用DAPI荧光封片剂 - G（Southern Biotechnology）将切片固定在显微镜载玻片上。使用落射荧光显微镜（DMI6000 Leica）采集荧光图像。在没有一抗的情况下未检测到信号。未观察到绿色荧光蛋白（GFP）表达（表明腺相关病毒（AAV）无表达）的小鼠被剔除。

2.12 统计分析

所有结果均以平均值±标准误（mean ± SEM）表示。可能的情况下，单个小鼠的数据用单个点表示。使用GraphPad Prism 8.0.0版本软件进行统计分析。在适当的时候进行学生t检验、单因素和双因素方差分析（ANOVA），随后进行邦费罗尼（Bonferroni）事后检验，并在结果和/或图注中注明。p < 0.05的值被认为具有统计学意义。

三、 结果

3.1 M2皮质在HD小鼠中与上丘（SC）功能断开

为了研究亨廷顿病（HD）中M2皮质连接性的改变，我们使用了静息态功能磁共振成像（rs-fMRI），并通过基于种子的分析方法，分析了约20周龄的野生型（WT）和R6/1小鼠（图1）中M2皮质与覆盖左脑半球的22个自动识别的脑区之间的功能连接性。在野生型小鼠中，M2皮质与扣带回（Cg）和上丘（SC）显示出最高的功能连接性。此外，与野生型相比，亨廷顿病小鼠中M2皮质与所有分析的脑区之间的功能连接性均降低。双向方差分析（ANOVA）显示出显著的基因型效应（F(1,22) = 11.9; p = 0.002）、脑区效应（F(21,462) = 35.9, p < 0.0001）以及区域与基因型的交互效应（F(21,462) = 3.6, p < 0.0001）。与野生型相比，亨廷顿病小鼠的左侧M2皮质与左侧上丘（SC）的功能连接性显著降低（p < 0.0001），同时与左侧导水管周围灰质（PAG; p = 0.001）、丘脑（Thal; p = 0.05）、海马（Hip; p = 0.01）、压后皮质（RS; p = 0.001）、扣带回（Cg; p = 0.007）躯体感觉皮质，（Som；p = 0.02）和内侧前额叶皮质（mPFC；p = 0.02），的功能连接性也显著降低。如邦费罗尼（Bonferroni）事后检验所示（图1）。因此，我们的结果强调，有症状的亨廷顿病（HD）小鼠的M2皮质功能连接缺陷涉及多个皮质、海马和非基底神经节脑区，其中与上丘（SC）的变化最为显著。

3.2 亨廷顿病小鼠M2皮质投射到上丘（SC）的结构改变

为了评估在M2皮质 - 上丘（SC）回路中观察到的功能连接缺陷是否与结构改变相关，我们根据弥散加权成像（DWI）估计了M2皮质 - 上丘（SC）纤维束，并测量了分数各向异性（FA）以及平均弥散率（MD）、轴向弥散率（AD）和径向弥散率（RD）等弥散性指标（图2）。我们的数据表明，M2皮质 - 上丘（SC）纤维束也存在结构改变。我们发现，与野生型（WT）小鼠相比，亨廷顿病（HD）小鼠的分数各向异性（FA）值显著降低（图2B），而平均弥散率（MD）、轴向弥散率（AD）和径向弥散率（RD）在不同基因型之间保持相似（图2C - E）。此外，我们分析了上丘（SC）内的弥散张量成像（DTI）指标以排除可能的区域微观结构改变（图3）。在野生型（WT）和亨廷顿病（HD）小鼠的上丘（SC）中测量的所有评估弥散指标均相似，这表明M2皮质 - 上丘（SC）的微观结构改变与这两个脑区之间的投射有关，而不仅仅与上丘（SC）本身有关。

在野生型（WT）和亨廷顿病（HD）小鼠中，对上丘（SC）中M2皮质轴突的光遗传学刺激诱发相似反应 为了阐明上丘（SC）在野生型（WT）和亨廷顿病（HD）小鼠中是否对M2皮质活动作出反应，我们在野生型（WT）和亨廷顿病（HD）小鼠的上丘（SC）外侧部深层（dlSC）进行了多电极阵列（MEA）记录，这些小鼠之前已在M2皮质注射了AAV - CamKII - ChR2 - YFP构建体（图4）。通过记录随着光强度增加而在上丘外侧部深层（dlSC）诱发的场兴奋性突触后电流（fPSC），创建了标准化的输入 - 输出分析。我们的结果显示，在上丘外侧部深层（dlSC）对M2皮质轴突进行光刺激在野生型（WT）和亨廷顿病（HD）小鼠中均诱发了场兴奋性突触后电流（fPSC）。双向方差分析（ANOVA）显示出显著的光强效应（F(7,84) = 34.5, p < 0.0001），尽管未发现基因型效应（F(1,12) = 3.0, p = 0.1）和基因型与光强的交互作用（F(7,84) = 1.9, p = 0.08）。

有症状的亨廷顿病小鼠中与上丘（SC）相关的行为功能受损 上丘（SC）接收并整合视觉信息以控制反射运动，如刺激定向（接近反应）或防御性运动（回避或逃离）。为了检测亨廷顿病（HD）小鼠中依赖上丘（SC）的行为是否受到影响，我们选择了两个已知涉及啮齿动物上丘（SC）功能的任务：“甲虫狂热任务”（BMT）视觉诱导的运动行为。

在“甲虫狂热任务”（BMT）中（图5），评估对随机移动的机器甲虫的行为反应。在测试的习惯化阶段，允许小鼠在场地中探索5分钟，与野生型（WT）小鼠相比，亨廷顿病（HD）小鼠的运动和自发探索（如直立时间）显著减少（图5B、C），如先前所述。在测试阶段，当小鼠面对机器甲虫时，亨廷顿病（HD）小鼠对机器甲虫的总反应数量显著减少（图5D）。然后，我们评估了对机器甲虫接触的反应类型，我们观察到与其他评估的反应（如耐受、接近或回避）相比，野生型（WT）小鼠的主要反应是逃离机器甲虫。有趣的是，亨廷顿病（HD）小鼠几乎没有或没有逃避反应，这从逃避反应的总百分比大幅降低可以看出（图5E）。我们进一步按照先前描述评估了排除逃避行为时的反应百分比，发现当排除逃避反应时，亨廷顿病（HD）小鼠对机器甲虫的总反应数量与野生型（WT）相比显著更高（图5F）。其中，亨廷顿病（HD）小鼠的耐受（图5G）和接近反应（图5H）均显著增加。最后，尽管在两种基因型中（当排除逃避反应时），回避行为都是对机器甲虫的优先反应，但与野生型（WT）小鼠相比，亨廷顿病（HD）小鼠的回避反应显著减少（图5I）。总之，我们的数据强调，与野生型（WT）小鼠相比，亨廷顿病（HD）小鼠对意外威胁甲虫的反应选择有所不同，这表明视觉输入与威胁反应的耦合发生了改变。

图5. 在有症状阶段，野生型（WT）和亨廷顿病（HD）小鼠对随机移动的机器甲虫的行为反应存在差异。A，“甲虫狂热任务”（BMT）方案的示意图，包括在长方形场地中5分钟的习惯化阶段和5分钟的测试阶段。B、C，在习惯化阶段，（B）测量移动距离，（C）测量直立时间。D - I，在测试阶段，（D）表示对机器甲虫的总诱导反应。分析了（E）逃避反应的百分比、（F）排除逃避反应后的总反应百分比，以及（G）耐受、（H）接近和（I）回避反应（排除逃避反应时）的百分比。每个点代表一只单独小鼠的数据。进行了非配对学生t检验。数据为平均值±标准误（野生型（WT）n = 12只小鼠，亨廷顿病（HD）n = 14只小鼠；21周龄小鼠）。*p < 0.05。**p < 0.001。***p < 0.001。

接下来，我们评估了对来自上方视野的意外刺激做出反应的光触发运动行为。我们比较了不同基因型小鼠对黑暗走廊中心突然出现的白色闪光（持续约1秒）的反应（图6）。我们观察到突然的光在野生型（WT）小鼠中引起短暂的冻结（静止行为）（数据未显示）。尽管我们没有观察到野生型（WT）小鼠在光照后通过走廊的时间减少，如先前所述，但我们发现亨廷顿病（HD）小鼠的这个时间增加了。双向方差分析（ANOVA）显示出显著的基因型效应（F(1,24) = 11.0, p = 0.003）、时间1/时间2效应（F(1,24) = 20.8, p = 0.0001）和交互效应（F(1,24) = 10.9, p = 0.003）。邦费罗尼（Bonferroni）事后分析表明，突然的光不会影响野生型（WT）小鼠的运动（图6B），而在亨廷顿病（HD）小鼠中运动显著增加且在各试验中保持一致（图6C、D）。一方面，到达走廊中心的时间受试验次数的影响，如双向方差分析所示，存在显著的试验效应（F(4,85) = 6.8, p < 0.0001），但不存在基因型效应（F(1,24) = 4.3, p = 0.05）和交互效应（F(4,85) = 6.8, p = 0.09）（图6C）。另一方面，在亨廷顿病（HD）小鼠的所有试验中，从走廊中心到尽头的时间增加，如双向方差分析所示，存在显著的基因型效应（F(1,24) = 15.8, p = 0.0006）和交互效应（F(4,85) = 3.8, p = 0.007），但不存在试验效应（F(4,85) = 1.1, p = 0.3）（图6D）。因此，我们的数据进一步证实，野生型（WT）和亨廷顿病（HD）小鼠对意外视觉刺激产生不同的反应。

图6. 有症状的亨廷顿病（HD）小鼠对意外闪光的行为反应发生改变。A，任务方案示意图。小鼠将穿过一条走廊，当小鼠到达走廊中心时会突然出现一道闪光。B，绘制到达走廊中心（时间1，t1）以及从走廊中心到走廊尽头（时间2，t2）的平均行进时间。每个点代表一只单独小鼠5次试验的平均值。C、D，展示5次试验中时间1（C）和时间2（D）测量值的图表。以基因型和时间或试验为因素进行双向方差分析（ANOVA），然后进行邦费罗尼（Bonferroni）事后检验比较。数据为平均值±标准误（野生型（WT）n = 12只小鼠，亨廷顿病（HD）n = 14只小鼠；21周龄小鼠）。*p < 0.05。***p < 0.001。

为了排除性别或运动改变可能混淆目前的结果，我们在12周龄无症状的雄性和雌性小鼠中进行了“甲虫狂热任务”（BMT），此时尚未出现运动协调症状（图7）。我们的结果证实，在这个阶段，运动活动没有改变，而与对照组相比，亨廷顿病（HD）小鼠的自发行为（如直立）已经减少。此外，在这个阶段，两性小鼠对随机移动的机器甲虫的反应改变情况相似，与对照野生型（WT）小鼠相比，亨廷顿病（HD）小鼠的反应数量减少、排除逃避反应后的总反应相似、耐受增加、回避和接近反应减少（图7）。总之，在亨廷顿病（HD）小鼠中，从无症状阶段起，与上丘（SC）相关的行为就发生了改变。

图7. 与12周龄的野生型（WT）小鼠相比，雄性和雌性亨廷顿病（HD）小鼠对随机移动的机器甲虫的行为反应均发生改变。A、B，在习惯化阶段，（A）测量行进距离，（B）测量直立时间。C - H，在测试阶段，（C）表示对机器甲虫的总诱导反应。分析了（D）逃避反应的百分比、（E）排除逃避反应后的总反应百分比，以及（F）耐受、（G）接近和（H）回避反应（排除逃避反应时）的百分比。每个点代表一只单独小鼠的数据。以基因型和性别为因素进行双向方差分析（ANOVA）。数据为平均值±标准误（雄性野生型（WT）n = 8只；雄性亨廷顿病（HD）n = 10只；雌性野生型（WT）n = 9只；雌性亨廷顿病（HD）n = 9只小鼠；12周龄小鼠）。*p < 0.05。**p < 0.01。***p < 0.001。

3.3 视觉刺激激发野生型（WT）小鼠M2皮质的神经元活动，但不激发亨廷顿病（HD）小鼠的

由于M2皮质的神经元投射到上丘外侧部深层（dlSC），并且与下视野视觉刺激有关，我们假设M2皮质神经元的活动可能是导致在亨廷顿病（HD）小鼠中观察到的“甲虫狂热任务”（BMT）改变的原因。为了证明这一点，我们评估了M2皮质活动是否与意外的下视野视觉刺激（例如机器甲虫的出现）相关（图8）。我们通过注射腺相关病毒（AAV - GCaMP6f）构建体，在M2皮质神经元中表达GCaMP6f钙传感器（图8A、B），并在“甲虫狂热任务”（BMT）的10分钟期间记录荧光（图8C）。在习惯化阶段，不同基因型之间的荧光信号稳定且相似，在所有野生型（WT）小鼠中引入机器甲虫后荧光信号立即显著增加，但在亨廷顿病（HD）小鼠中并非如此（图8D）。

图8. 视觉刺激的存在激活野生型（WT）小鼠的M2皮质神经元，但不激活亨廷顿病（HD）小鼠的，这通过体内光纤光度法的荧光钙记录显示。A，光纤套管植入示意图以及在M2皮质注射腺相关病毒（AAV - GCaMP6f）构建体的代表性图像。B，代表性荧光图像，显示野生型（WT）（左）和亨廷顿病（HD）（右）小鼠M2皮质中的4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚（DAPI，蓝色）、GCaMP6f表达（绿色）以及光纤套管植入情况。C，“甲虫狂热任务”（BMT）方案，包括5分钟的习惯化阶段和5分钟的测试阶段。D，在野生型和有症状的亨廷顿病（HD）小鼠中，在将移动的机器甲虫引入场地前1分钟和后5分钟，M2皮质荧光钙信号的平均光度记录。荧光信号的增加量通过每只小鼠各自的基线进行归一化。E，计算并展示每分钟归一化荧光信号的平均值。每个点代表一只单独小鼠的数据。以基因型和时间为因素进行双向方差分析（ANOVA），然后进行邦费罗尼（Bonferroni）事后检验比较。数据为平均值±标准误（野生型（WT）n = 6只小鼠，亨廷顿病（HD）n = 5只小鼠；20周龄小鼠）。*p < 0.05，**p < 0.01，与野生型（WT）相比。

为了更好地量化这些结果，我们对荧光数据取平均值以获得1分钟的时间窗，并随时间评估基因型差异。双向方差分析（ANOVA）报告了显著的时间效应（F(5,45) = 4.7，p = 0.002）、基因型效应（F(1,9) = 7.4，p = 0.02）以及时间与基因型的交互作用（F(5,19) = 3.1，p = 0.02）（图8E）。邦费罗尼（Bonferroni）事后分析显示，在测试阶段的前3分钟内，组间存在显著差异。因此，我们的数据证实，在野生型（WT）小鼠中，当存在意外的下视野视觉刺激时，M2皮质变得活跃。然而，亨廷顿病（HD）小鼠缺乏这种神经元参与。有趣的是，虽然所有野生型（WT）小鼠都有M2皮质的活动，但在这个实验中并非所有小鼠都对机器甲虫表现出逃避反应（图9），这表明M2皮质的参与并不仅仅反映这种特定的行为反应。此外，尽管小鼠数量较少，但耐受反应显著增加，回避反应显著减少，这与图5的结果一致。

图9. 野生型（WT）和亨廷顿病（HD）小鼠在与体内光纤光度法相关的“甲虫狂热任务”（BMT）期间的行为反应，与图8相关。A、B，在习惯化阶段，（A）测量行进距离，（B）测量直立时间。C - H，在测试阶段，（C）对机器甲虫的总反应，（D）逃避反应的百分比，（E）排除逃避后的总反应，以及（F）耐受、（G）接近和（H）回避反应（排除逃避反应时）的百分比进行了分析。每个点代表一只单独小鼠的数据。进行了非配对学生t检验。数据为平均值±标准误（野生型（WT）n = 6只小鼠，亨廷顿病（HD）n = 6只小鼠；20周龄小鼠）。***p < 0.001。孔德 - 贝里奥萨巴莱塔尔（Conde - Berriozabal）等人·亨廷顿病中的M2皮质 - 上丘（Superior Colliculus）《神经科学杂志》，2023年5月3日 • 43(18):3379 - 3390 • 3387在弥散加权成像（DWI）指标方面。总之，我们证明了从M2皮质到上丘（SC）的长距离锥体束神经元在结构和功能上都受到严重影响，这与亨廷顿病（HD）中脑内神经元受影响更严重的观点形成对比（加托。此外，如在上丘（SC）中的弥散加权成像（DWI）测量以及使用多电极阵列（MEA）对上丘（SC）中M2轴突的电生理反应所示，在亨廷顿病（HD）状况下上丘（SC）结构似乎保持完好，这表明M2皮质 - 上丘（SC）功能的改变与M2皮质输入有关，而非上丘（SC）结构缺陷。

3.4 在野生型（WT）小鼠中急性抑制M2皮质神经元使“甲虫狂热任务”（BMT）中的野生型（WT）反应略微向亨廷顿病（HD）表型转变

为了进一步了解M2皮质活动的缺乏是否是“甲虫狂热任务”（BMT）中亨廷顿病（HD）表型的原因，我们研究了在野生型（WT）小鼠中急性抑制M2皮质神经元是否能够模拟对下视野视觉输入的亨廷顿病（HD）反应。

我们向小鼠的M2皮质双侧注射腺相关病毒5 - 人突触蛋白 - 人源M3D（Gi） - 樱桃红（AAV5 - hSyn - hM3D(Gi) - mCherry）以表达Gi蛋白偶联受体hM3D，并比较在腹腔注射氯氮平 - N - 氧化物（CNO）（1mg/kg）或生理盐水（Veh）约40分钟后在“甲虫狂热任务”（BMT）中的行为表现（图10）。

图10. 在野生型（WT）小鼠中，M2皮质神经元的化学遗传学抑制使“甲虫狂热任务”（BMT）中对机器甲虫的行为反应向亨廷顿病（HD）表型转变。A，代表性荧光图像，显示表达腺相关病毒5 - 突触蛋白 - 人源hdM3D(gi) - 樱桃红（AAV5 - syn - hdM3D(gi) - mCherry）化学遗传学病毒构建体（红色）和4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚（DAPI，蓝色）的M2皮质神经元。B、C，在习惯化阶段，（B）测量行进距离，（C）测量直立时间。D - I，在测试阶段，（D）测量对机器甲虫的总反应。E，逃避反应的百分比。F，排除逃避后的对机器甲虫的总反应。G，耐受百分比，（H）接近反应和（I）回避反应（从排除逃避反应的总反应中得出）。每个点代表一只单独小鼠的数据。进行了单因素方差分析（ANOVA），随后进行邦费罗尼（Bonferroni）事后分析。数据为平均值±标准误（野生型 - 生理盐水（WT - Veh）n = 5只，野生型 - 氯氮平 - N - 氧化物（WT - CNO）n = 4只，亨廷顿病（HD）n = 5只小鼠；20周龄小鼠）。*p < 0.05，**p < 0.01，与野生型 - 生理盐水（WT - Veh）相比。p < 0.05，p < 0.01，与野生型 - 氯氮平 - N - 氧化物（WT - CNO）相比。

在习惯化阶段，野生型（WT）注射生理盐水或CNO的小鼠之间的运动和探索行为仍然相似，而亨廷顿病（HD）小鼠的这些行为减少（图10B、C）。单因素方差分析（ANOVA）显示，在运动（F(2,11) = 10.6，p = 0.03）和探索行为（F(2,11) = 13.5，p = 0.001）方面都存在显著的组间效应，邦费罗尼（Bonferroni）事后分析表明，与野生型（WT）相比，只有亨廷顿病（HD）小鼠的这两个参数显著降低。

在随后的测试阶段，评估了对机器甲虫的行为反应。在野生型（WT）经CNO处理的小鼠中，对机器甲虫的反应向亨廷顿病（HD）表型转变（图10D - I）。具体而言，与野生型（WT）注射生理盐水的小鼠相比，野生型（WT）经CNO处理的小鼠对机器甲虫的总反应数量增加，并接近亨廷顿病（HD）注射生理盐水的水平（图10D，单因素方差分析（ANOVA）组间效应（F(2,11) = 7.9，p = 0.008））。在这个实验中，逃避行为大多不存在，并且在所有组中相似（图10E，单因素方差分析（ANOVA）组间效应（F(2,10) = 0.8，p = 0.4））。此外，野生型（WT）经CNO处理增加了无逃避行为的总反应数量（图10F，单因素方差分析（ANOVA）组间效应（F(2,11) = 8.8，p = 0.005）），表现出耐受增加的趋势（图10G，单因素方差分析（ANOVA）组间效应（F(2,11) = 11.5，p = 0.002）），接近的接近反应（图10H，单因素方差分析（ANOVA）组间效应（F(2,11) = 1.0，p = 0.4））以及减少的回避反应（图10I，单因素方差分析（ANOVA）组间效应（F(2,11) = 8.6，p = 0.006）），与野生型（WT）注射生理盐水的小鼠相比向亨廷顿病（HD）表型转变。邦费罗尼（Bonferroni）事后分析进一步证实，在野生型（WT）小鼠中抑制M2皮质神经元诱导出部分亨廷顿病（HD）表型，除了耐受行为与亨廷顿病（HD）注射生理盐水的小鼠仍有差异外，在任何分析的反应中与野生型（WT）注射生理盐水或亨廷顿病（HD）注射生理盐水的小鼠均无差异。总之，尽管使用的小鼠数量较少，但在野生型（WT）小鼠中急性抑制M2皮质能够使行为反应向亨廷顿病（HD）表型转变，这表明M2皮质的神经元活动是对意外视觉刺激（例如随机移动的机器甲虫）选择反应类型的关键。

四、 讨论

在亨廷顿病（HD）出现运动症状的许多年前，皮质运动前区就受到显著影响。这些改变已被广泛地与皮质 - 纹状体连接中断相关联，并与在亨廷顿病（HD）中严重表现出的运动缺陷有关。在此，我们全面绘制了亨廷顿病（HD）小鼠M2皮质的连接图谱，并描述了显著的结构和功能缺陷，特别是M2皮质投射到上丘（SC）的部分。此外，我们的数据揭示了亨廷顿病（HD）小鼠中依赖上丘（SC）的行为功能发生了深刻改变，且这些改变出现在运动改变之前。而且，我们表明在野生型（WT）小鼠中存在视觉刺激时M2皮质会被激活，但在亨廷顿病（HD）小鼠中则不会，并且使用设计药物特异性激活的设计受体（DREADDS）对M2皮质进行急性抑制会促使野生型（WT）小鼠在“甲虫狂热任务”（BMT）中出现类似亨廷顿病（HD）的表型，这表明M2皮质的异常激活可能是导致在亨廷顿病（HD）小鼠中观察到的行为改变的原因。

M2皮质的锥体神经元向许多皮质和皮质下脑核发送投射，包括上丘（SC），如先前所述。值得注意的是，功能磁共振成像（fMRI）显示在有症状的亨廷顿病（HD）小鼠中，M2皮质与多个皮质、海马体、丘脑、中脑导水管周围灰质（PAG）和上丘（SC）之间存在严重的功能连接缺陷，这与神经解剖学投射有所不同。由于功能连接被定义为空间上相隔较远的神经生理事件之间的时间相关性，M2皮质与海马体、丘脑和中脑导水管周围灰质（PAG）之间的强活动相关性可能是通过其他脑回路间接产生的。然而，M2皮质是上丘（SC）的主要输入之一。此外，功能连接缺陷伴随着M2皮质 - 上丘（SC）回路的结构改变，这可通过弥散加权成像（DWI）指标的下降看出。总之，我们证明了从M2皮质到上丘（SC）的长距离锥体束神经元在结构和功能上都受到严重影响，这与脑内神经元在亨廷顿病（HD）中受影响更严重的观点形成对比。此外，如通过对上丘（SC）的弥散加权成像（DWI）测量以及使用多电极阵列（MEA）检测上丘（SC）中M2轴突的电生理反应所示，在亨廷顿病（HD）状况下上丘（SC）结构似乎保持完好，这表明M2皮质 - 上丘（SC）功能的改变与M2皮质输入有关，而非上丘（SC）结构缺陷。

一致地，M2皮质功能的改变可能是多种亨廷顿病（HD）症状背后的一个常见机制。如使用微型显微镜进行钙成像实验所示，M2皮质的激活与许多自然行为有关，例如直立、抓握、进食、梳理等，并且如通过对Arc - GFP表达的双光子成像所示，还与运动学习过程有关。众所周知，所有这些行为在亨廷顿病（HD）小鼠模型中都会发生改变。在这方面，我们证明了异常的M2皮质活动会导致亨廷顿病（HD）中与上丘（SC）相关的行为，例如“甲虫狂热任务”（BMT），该任务与对线状物的视觉感知有关且依赖上丘（SC）功能。具体而言，亨廷顿病（HD）小鼠对机器甲虫的逃避和回避反应减少，而耐受反应增加。此外，在野生型（WT）小鼠中，机器甲虫存在时M2皮质会被激活，但在亨廷顿病（HD）小鼠中则不会，并且使用设计药物特异性激活的设计受体（DREADDS）对M2皮质进行抑制会使野生型（WT）小鼠在“甲虫狂热任务”（BMT）中的反应轻微向亨廷顿病（HD）表型转变。尽管在后一个实验中使用的小鼠数量较少，可能会低估化学遗传学刺激的效果，但我们的数据表明M2皮质活动有助于对视觉刺激的反应选择；然而，其他上丘（SC）回路也可能对亨廷顿病（HD）表型有所贡献。

在这方面，M2皮质与扣带皮质（Cg）显示出最高的功能连接性，而扣带皮质（Cg）又是上丘（SC）内侧部分（mSC）的主要皮质传入。信息从M2皮质和扣带皮质（Cg）以功能分隔的环路流向上丘（SC），然后通过不同的丘脑靶点返回基底神经节回路以调节动作选择。具体而言，M2皮质 - 上丘外侧部深层（dlSC）通路功能与通常出现在下视野的趋近和奖赏性刺激有关，而扣带皮质（Cg） - 上丘内侧部（mSC）功能更多地与上视野中的逃避行为和运动（例如，捕食者）有关。令人惊讶的是，我们发现野生型（WT）小鼠中逃避反应的数量在不同批次的小鼠之间差异很大，这可能与它们之间不同的焦虑水平有关，而亨廷顿病（HD）小鼠在任何批次中都很少或没有逃避反应。在不同基因型之间观察到的诱发逃避反应的显著差异表明，扣带皮质（Cg） - 上丘（SC）和/或上丘（SC） - 中脑导水管周围灰质（PAG）通路在亨廷顿病（HD）病理中可能也受到影响。此外，在野生型（WT）小鼠中，无论是否存在逃避反应，机器甲虫存在时所有小鼠的M2皮质都会被激活，这支持了逃避反应不依赖于M2皮质活动的观点。因此，亨廷顿病（HD）小鼠中所有不同行为反应都存在改变这一现象表明，上丘（SC）内侧和外侧部分的输入可能都受到影响。相应地，已知扣带皮质（Cg）在亨廷顿病（HD）患者的早期阶段就会发生改变，并且运动皮质和扣带皮质（Cg）中的细胞丢失与亨廷顿病（HD）的症状相关。因此，我们假设扣带皮质（Cg） - 上丘（SC）的改变在亨廷顿病（HD）中也可能起作用。

同时，如功能磁共振成像（fMRI）数据所示，亨廷顿病（HD）小鼠中的M2皮质 - 中脑导水管周围灰质（PAG）回路在功能上也发生了改变。中脑导水管周围灰质（PAG）是上丘（SC）的主要输出之一，负责确定计算逃避反应的阈值，而在亨廷顿病（HD）状况下逃避反应几乎不存在。有趣的是，来自腹外侧膝状体核或黑质网状部的γ - 氨基丁酸（GABA）能神经递质传递增强会减少“甲虫狂热任务”（BMT）中的逃避反应，这表明上丘（SC）中γ - 氨基丁酸（GABA）能活性增加可能导致亨廷顿病（HD）小鼠的行为反应改变。此外，上丘（SC） - 中脑导水管周围灰质（PAG）回路受多模态感觉信息和学习经验的影响，这些信息和经验在动物的整个生命过程中不断更新。由于M2皮质仅向中脑导水管周围灰质（PAG）发送少量直接投射，我们假设M2皮质可能通过调节上丘（SC）活动间接调节中脑导水管周围灰质（PAG）功能，或者通过对上丘（SC）和中脑导水管周围灰质（PAG）的其他输入（如扣带皮质（Cg））来调节。

上丘（SC）参与控制定向眼跳运动（也称为扫视运动）。因此，在亨廷顿病（HD）小鼠中观察到的上丘（SC）功能改变与亨廷顿病（HD）患者在症状前阶段就存在的扫视眼球运动异常控制是一致的。实际上，眼球运动功能和运动共享许多潜在的神经元回路，并且在几种运动障碍中，眼球运动缺陷先于运动症状出现。虽然尚未探索亨廷顿病（HD）患者上丘（SC）功能的直接改变，但对帕金森病（PD）的研究表明，与对照组相比，初发帕金森病（PD）患者上丘（SC）对发光的反应（通过功能磁共振成像（fMRI）测量）是异常的）。上丘（SC）中的这些改变与动作和感知协调的缺陷有关。值得注意的是，最近一项针对帕金森病（PD）患者的研究表明，在运动皮质进行重复经颅磁刺激提高了反向扫视成功率和姿势不稳 - 步态困难。在这方面，在帕金森病（PD）小鼠模型中对M2皮质进行光遗传学刺激可逆转运动功能障碍。因此，进一步理解皮质、视觉和运动领域之间的复杂回路有助于基于运动障碍中的回路修复设计新的治疗方案。

总之，我们的数据提供了令人信服的证据，表明M2皮质回路改变参与亨廷顿病（HD）的病理生理过程，且这种参与超出了基底神经节的范围。特别是，我们强调了M2皮质功能连接的改变，尤其是M2皮质未被激活这一情况是导致在亨廷顿病（HD）小鼠中观察到的依赖上丘（SC）症状的原因之一。揭示M2皮质除皮质 - 纹状体之外的众多回路改变和功能为理解亨廷顿病（HD）症状提供了有价值的见解，这可能对其他运动障碍（如帕金森病（PD））也有意义。此外，进一步理解和靶向上丘（SC）回路可能还会为延缓运动障碍症状的发作和减轻症状严重程度提供新的治疗机会。

公司地址：广东省东莞市樟木头镇塑金国际1号楼810