心脏中的成纤维细胞除提供机械稳定性外，还能调节心肌细胞的电生理特性。本研究旨在开发三维异细胞模型，通过选择性光遗传去极化或超极化技术分析成纤维细胞与人类心肌细胞在体外的电相互作用。

研究团队构建了表达光敏感离子通道Channelrhodopsin2（用于光遗传去极化）或光诱导质子泵Archaerhodopsin（用于超极化）的NIH3T3细胞系，并通过膜片钳技术进行表征。采用视频显微技术对含50%成纤维细胞与50%人多能干细胞来源心肌细胞的心脏球体进行分析，并利用锐电极测量膜电位。经转化生长因子-β1（TGF-β1）刺激可增强心脏球体中肌成纤维细胞的活化。通过qPCR和荧光漂白恢复技术检测连接蛋白43的表达。光照表达Channelrhodopsin2或Archaerhodopsin的成纤维细胞可分别诱导内向电流与去极化，或外向电流与超极化。TGF-β1刺激能提升连接蛋白43表达水平，增强成纤维细胞间偶联，并提高心脏球体的基础搏动频率及心肌细胞静息膜电位。在Channelrhodopsin2成纤维细胞构建的心脏球体中，光照可加速自发搏动（尤其在TGF-β1刺激后）。而采用Archaerhodopsin成纤维细胞构建的心脏球体经光照后，心肌细胞出现超极化且自发搏动在TGF-β1刺激后完全阻断。未使用TGF-β1刺激时，光照效应显著减弱。

TGF-β1刺激可增强异细胞间偶联，而成纤维细胞的光遗传超极化能抑制TGF-β1对心肌细胞自发活动的影响。这种新型异细胞心脏球体模型通过选择性光遗传操控成纤维细胞膜电位，实现了对成纤维细胞-心肌细胞偶联强度的直接体外量化。

一、介绍

心脏纤维化的特征是在衰老心脏或压力超负荷、心肌梗死和心力衰竭等心脏病变后，心肌组织中心脏成纤维细胞的过度增殖。在这些情况下，局部免疫反应伴随转化生长因子-β1（TGF-β1）和其他促炎信号分子水平升高，触发成纤维细胞增殖并转化为"活化肌成纤维细胞"状态。与静息状态的心脏成纤维细胞不同，活化的肌成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白，产生大量细胞外基质，并增加间隙连接蛋白连接蛋白43的表达水平。重要的是，心脏纤维化导致的结构变化不仅是心脏病变的标志，还可能引发和恶化心脏病变的结局。例如，伴随的心肌僵化会损害舒张期松弛，而活化肌成纤维细胞的出现与心律失常风险升高相关。这可通过心肌细胞传导速度降低和静息膜电位升高来解释。因此，纤维化心肌易引发和维持潜在致命性心律失常，如室性心动过速和心室颤动。

原则上，两种不同机制可能导致心脏纤维化期间心肌的电生理变化：（i）通过过量细胞外基质沉积造成的电隔离、非可兴奋细胞数量增加或影响心肌细胞电生理特性的旁分泌效应间接影响心肌细胞；（ii）肌成纤维细胞也可能通过间隙连接的电偶联直接影响心肌细胞的电特性。与心肌细胞相比，肌成纤维细胞被认为具有更高的膜电位，尽管这尚未在心脏体内得到证实。

因此，异细胞偶联会直接使心肌细胞去极化，导致钠通道失活和传导减慢，这可能加剧纤维化的致心律失常效应。事实上，多项研究令人信服地证明了体外成纤维细胞与心肌细胞之间存在高度动态的电紧张偶联，以及对心肌细胞功能产生的直接影响。

这些研究通过膜片钳技术或定量染料转移在细胞模型中测量直接偶联，或在体外进行电压成像和传导速度测量。重要的是，大多数报道基于单层二维培养，忽略了心脏组织中三维性的潜在更强效应。此外，所述模型需要繁琐的实验设置，无法转移到体内或整个器官设置中。

最近，研究人员使用电压指示剂的成纤维细胞特异性表达来评估完整小鼠心脏内成纤维细胞的膜电位变化。研究人员这种方法证明，心肌细胞动作电位导致心肌梗死后纤维化瘢痕组织内的被动膜电位变化。尽管这一发现为梗死心脏体内异细胞偶联提供了普遍证据，显示了心肌细胞对成纤维细胞膜电位的影响，但所应用的成像工具不适合量化成纤维细胞对心肌组织和完整心脏中心肌细胞的直接电影响程度。然而，量化功能性合胞体内异细胞偶联对心肌细胞的影响对于机制理解和筛选间质纤维化的治疗方案至关重要，间质纤维化是终末期心力衰竭和心房颤动中高度致心律失常的替代物。

与电刺激或药理学刺激相比，光遗传学通过选择特异性启动子或建立转基因细胞系与非转基因细胞共培养，允许在异细胞环境中进行细胞类型选择性的去极化和超极化。这种方法被巧妙应用于与表达光门控通道Channelrhodopsin 2（ChR2）用于去极化或光驱动质子泵ArchT用于超极化的成纤维细胞共培养的单层心肌细胞的间接起搏或电沉默。

本研究报告展示了一种新方法，用于证明和量化体外生成的三维心脏组织中成纤维细胞对心肌细胞电行为的直接影响。利用光遗传刺激对成纤维细胞膜电位进行特异性操纵，并分析对心肌细胞的影响，我们能够量化成纤维细胞-心肌细胞偶联对自发活动的影响（作为触发心律失常的异位活动的替代参数）。此外，该系统可直接研究成纤维细胞-心肌细胞偶联的调节剂，我们通过应用TGF-β1证明了这一点，已知TGF-β1能上调肌成纤维细胞中连接蛋白43的表达。

二、方法

01.光遗传载体的构建

通过分子克隆技术构建了两种光遗传学载体：CAG-ChR2-mCherry和CAG-ArchT-eYFP。具体而言，将pcDNA3.1/hChR2(H134R)-mCherry载体中的CMV启动子替换为来自pCIG2质粒的CAG启动子（鸡β-肌动蛋白启动子与CMV增强子组合）；将pAAV-CaMKIIa-eArch 3.0-eYFP中的ArchT-eYFP片段克隆至含CAG启动子和新霉素抗性基因的载体中。所有构建均通过测序验证，转染前使用PvuI对质粒进行线性化处理。

02.转基因NIH3T3细胞系的建立与培养

NIH3T3成纤维细胞采用标准条件培养（DMEM培养基含10%胎牛血清、0.1 mM非必需氨基酸、50 μg/mL青霉素-链霉素、0.1 mM β-巯基乙醇，37°C、5% CO2环境）。使用FuGene®转染试剂进行脂质体转染，并通过新霉素筛选（900 μg/mL 7天，后维持剂量600 μg/mL）获得稳定表达细胞系。为进一步纯化，采用流式细胞分选技术（FACS）基于mCherry/eYFP荧光信号进行分选：mCherry使用561 nm激光激发/590±50 nm发射滤光片，eYFP使用488 nm激光激发/536±20 nm发射滤光片。经多轮分选与培养，最终获得纯度≥80%的细胞群体。进行膜片钳、qPCR或FRAP实验前3天，在培养基中加入4 ng/mL人源TGF-β1进行刺激，实验时更换为无TGF-β1的溶液。

03.荧光漂白恢复实验（FRAP）

表达ArchT-eYFP的成纤维细胞接种于明胶包被的盖玻片，培养3天至80%融合度。加载间隙连接通透性染料Calcein-AM Red-Orange（0.38 μM，37°C孵育20分钟）后，在室温外部溶液中进行检测。使用尼康共聚焦显微镜（40×水浸物镜，NA 1.25）进行FRAP分析：通过eYFP信号界定细胞边界，选择单个细胞进行漂白（561 nm激光，2.5 mW，5秒），每15秒采集一次荧光强度持续1000秒，数据归一化为漂白前强度（1）与漂白后即刻强度（0）之间的相对值。

04.膜片钳实验

实验前24小时更换无新霉素培养基。将细胞接种于明胶包被的盖玻片，于铺板后4-36小时在37°C下进行记录。采用EPC10放大器，外部溶液成分为：140 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM葡萄糖, 10 mM HEPES (pH 7.4)；内部溶液为：12 mM NaCl, 20 mM KCl, 110 mM天冬氨酸钾, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 2 mM K2ATP, 10 mM EGTA, 10 mM HEPES (pH 7.2)。静息膜电位（RMP）在电流钳零电流模式下记录，并校正液接电位。光诱导电流在-53 mV钳制电位下检测，分析光照最后975 ms电流均值与光照前500 ms基线的差值。ChR2诱导去极化检测时，因成纤维细胞RMP接近ChR2反转电位，采用低频电压钳模式通过电流注入将膜电位设定至-43 mV后进行；ArchT诱导超极化则在零电流模式下直接记录。膜电位变化量计算为光照前均值与光照最后650 ms均值的差值。所有数据通过Fitmaster软件进行离线分析。

05.光照刺激系统

采用温度可控的LED模块（ChR2实验使用470 nm波长，ArchT实验使用535 nm波长），通过光纤（直径2毫米，数值孔径0.5）和双端口聚光器连接至显微镜系统。膜片钳实验使用20倍物镜（数值孔径0.75），频率记录和锐电极测量使用10倍物镜（数值孔径0.5）。光脉冲由膜片钳放大器或AM Systems的隔离脉冲刺激器控制。通过21-25级递增光强测试光敏感性：ChR2实验光强范围为0-8 mW/mm²，ArchT实验为0-14 mW/mm²。光强度校准通过测量焦平面光功率除以照射区域面积实现。

06.成纤维细胞增殖抑制

在制备心脏球体前24小时，使用1.2 μg/mL丝裂霉素C处理细胞2小时，PBS清洗三次。通过接种细胞至24孔板（含/不含4 ng/mL TGF-β1），培养7天后计数验证增殖抑制效果，期间每两天更换培养基。

07.三维心肌-成纤维细胞共培养体系建立

研究所用人源心肌细胞（Cor.4U©）后续STR鉴定证实源于人胚胎干细胞系RUES2，但细胞来源差异不影响研究结果与数据解读。心肌细胞按制造商方案解离后，与经增殖抑制的成纤维细胞按1:1比例混合（总计4000细胞/20 μL悬滴），通过悬滴法培养3天形成心脏球体。将球体接种于纤连蛋白包被的盖玻片，继续培养3-8天。TGF-β1刺激组在悬滴培养阶段和贴壁后均添加4 ng/mL TGF-β1持续至少6天。

08.节律记录

在37°C台氏液环境中，通过红外视频显微镜记录自发搏动频率。采用CCD相机拍摄搏动区域，通过自定义软件分析像素强度变化检测收缩事件。光遗传刺激采用交替递增/递减光强模式（ChR2：0-4 mW/mm²，ArchT：0-10 mW/mm²，共20级），每50秒照射20秒。标准化频率计算为照射前10秒平均频率与照射最初10秒平均频率的比值。若照射期间无搏动（如ArchT强超极化效应），频率记为0。

09.锐电极测量技术

采用高阻抗（60-120 MΩ）锐利微电极（内充3M KCl溶液），通过压电微操纵器以5-10 μm步长、100 mm/s速度穿刺心脏球体中的心肌细胞。信号经桥式放大器放大后数字化采集。心肌细胞鉴定标准为静息膜电位低于-30 mV。光遗传刺激采用每50秒照射20秒的范式，不同光强间隔施加。静息膜电位数据通过专业分析软件处理。

10.定量PCR与免疫组化分析

mRNA提取采用微量试剂盒，仅RNA完整性指数高于8.5的样本进入后续实验。定量PCR使用特异性探针检测连接蛋白43（GJA1）和GAPDH基因表达，采用2-ΔCT法相对定量并以未刺激成纤维细胞均值标准化。

免疫组化样本经4%多聚甲醛固定、0.25% Triton X-100透化后，用5%驴血清封闭非特异性结合位点。一抗孵育（抗α-辅肌动蛋白1:400，抗α-平滑肌肌动蛋白1:800）过夜后，采用Cy3/Cy5标记二抗（1:400）室温孵育1小时。细胞核经Hoechst 33342染色后，使用倒置荧光显微镜配合光学切片模块及特定滤光片组（Hoechst/eYFP/TRITC/mCherry/Cy5）采集图像。

11.统计学分析

使用专业统计软件进行处理：TGF-β1处理组间比较采用非配对双尾t检验；光照前后效应比较采用配对双尾t检验；ArchT心脏球体频率变化因数据非正态分布采用Mann-Whitney检验（高斯近似）；光照诱导膜电位变化采用单尾配对t检验。显著性阈值设定为P≤0.05。所有图表均展示个体数据点及表示标准误的均值线。

三、结果

01.三维心肌-成纤维细胞共培养体系的建立

为构建具有间质纤维化特征的心脏组织三维模型，本研究采用悬滴法以1:1比例共培养成纤维细胞与心肌细胞形成心脏球体。通过TGF-β1激活成纤维细胞（该因子在体内可诱导心脏纤维化，在体外可诱发肌成纤维细胞表型转化）。为排除细胞增殖对异细胞比例的影响，在构建心脏球体前使用丝裂霉素C处理成纤维细胞（图1A）。培养3天后，两种细胞形成致密的心脏球体（图1B）。免疫组化染色显示连接蛋白43在两种细胞中均有表达，并在成纤维细胞-心肌细胞界面观察到异细胞间隙连接的形成（图1C）。

图1.TGF-β1对共培养体系及分离细胞的影响（A）经TGF-β1处理7天后，对照组与丝裂霉素C处理组成纤维细胞计数对比（n=5，对照组P=0.0004，丝裂霉素C组P=0.78）。（B）接种3天后异细胞心脏球体形态（标尺200μm）。（C）心脏球体连接蛋白43免疫荧光染色（白色显示），可见转基因ArchT-eYFP成纤维细胞（绿色）与α-辅肌动蛋白阳性心肌细胞（红色）界面形成间隙连接（细胞核蓝色染色，标尺20μm）。（D、E）TGF-β1对心脏球体自发搏动频率（D，n=30，P=0.006）和心肌细胞静息膜电位（E，对照组n=6，TGF-β1组n=8，P=0.032）的影响。（F、G）TGF-β1对分离成纤维细胞静息膜电位（F，对照组n=33，TGF-β1组n=15，P=0.007）和膜电容指示的细胞尺寸（G，对照组n=19，TGF-β1组n=18，P=0.46）的影响。

02.TGF-β1提升心脏球体自发搏动频率

未刺激对照组心脏球体的自发搏动频率为24.6±1.8次/分钟，经TGF-β1刺激后显著增加至30.5±1.2次/分钟（图1D）。为探究机制，采用锐电极穿刺技术测量完整心脏球体内心肌细胞的静息膜电位（RMP）。结果显示，TGF-β1刺激使心肌细胞RMP较未刺激对照组显著升高16.2mV（图1E）。对分离3T3成纤维细胞的膜片钳分析表明，TGF-β1刺激显著降低其RMP（图1F），但未改变细胞电容（提示细胞尺寸无变化）（图1G）。因此，TGF-β1对成纤维细胞的孤立效应并不能直接解释心脏球体内心肌细胞RMP升高和搏动频率增加的现象。

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03.TGF-β1增强成纤维细胞间功能偶联

鉴于TGF-β1已知可增强成纤维细胞与心肌细胞的偶联，我们进一步检测了其对3T3成纤维细胞连接蛋白43（Cx43）表达及功能的影响。TGF-β1孵育使Cx43 mRNA表达水平提升约3倍（图2A）。通过二维成纤维细胞单层的荧光漂白恢复实验（FRAP）分析细胞间偶联功能：与未处理对照组相比，TGF-β1处理组荧光恢复速度显著加快（图2B-D）。上述结果表明，相对去极化的成纤维细胞与心肌细胞间增强的异细胞偶联，可能是导致心脏球体内心肌细胞RMP升高和搏动加速的原因。但成纤维细胞对心肌细胞的间接旁分泌效应以及TGF-β1对心肌细胞的直接作用仍不能排除。

图2 .TGF-β1增强成纤维细胞功能偶联（A）TGF-β1对成纤维细胞Cx43相对表达量的影响（对照组n=3，TGF-β1组n=4，P=0.02）（B）FRAP实验典型示例：未处理（上）与TGF-β1处理（下）的ArchT-eYFP成纤维细胞（中央细胞被漂白，黄色示eYFP，红色示Calcein AM，标尺10μm）（C）对照组（青绿色）与TGF-β1处理组（红色）荧光信号随时间恢复曲线（D）漂白1000秒后荧光恢复的统计分析（对照组n=5，TGF-β1组n=6，P=0.009）

04.成纤维细胞膜电位光遗传调控体系的建立

为直接验证成纤维细胞膜电位通过异细胞偶联对心肌细胞静息膜电位（RMP）的影响，本研究在三维心脏球体中建立了成纤维细胞膜电位的选择性光遗传调控技术。通过构建转基因3T3细胞系，实现在CAG启动子控制下表达ChR2-mCherry融合蛋白（蓝光门控阳离子通道），实现成纤维细胞特异性光诱导去极化（图3A）。脂质体转染联合新霉素筛选仅获得<25% ChR2-mCherry阳性细胞，经流式细胞分选（FACS）多轮纯化后阳性率提升至81.3%（图3B、C）。对于光诱导超极化，通过表达ArchT-eYFP融合蛋白（绿光驱动外向质子泵），经FACS分选获得96.9%阳性细胞（图3D-F）。

通过膜片钳实验验证光遗传蛋白功能：表达ChR2-mCherry的成纤维细胞在470 nm蓝光照射下产生内向电流和去极化（图4A、B），在8.0 mW/mm²光强下最大稳态电流密度达-1.71±0.31 pA/pF，最大去极化幅度为18.5±3.1 mV；表达ArchT-eYFP的细胞在535 nm绿光照射下产生外向电流和超极化（图4C、D），在14 mW/mm²光强下最大电流密度为+1.60±0.26 pA/pF，最大超极化幅度达-28.9±5.8 mV。值得注意的是，通过梯度调节光强可实现膜电位的精确调控：ChR2-mCherry细胞系的半数有效光强度（eLi50）对于内向电流和去极化分别为0.79±0.12 mW/mm²和0.87±0.23 mW/mm²。由于ArchT为非饱和质子泵，增加光强未出现平台效应（图4C、D），无法计算eLi50。关键发现是，TGF-β1孵育不影响ChR2诱导的内向电流/去极化或ArchT诱导的外向电流/超极化（图4E-H），这对后续光遗传分析至关重要。

图3 转基因NIH 3T3成纤维细胞系的构建（A）CAG启动子调控ChR2-mCherry融合表达质粒示意图（B）转染成纤维细胞中ChR2-mCherry信号（红色）与α-平滑肌肌动蛋白染色（白色，标尺10μm）（C）ChR2-mCherry阳性细胞FACS分选谱图及百分比（D）CAG启动子调控ArchT-eYFP融合表达质粒示意图（E）转染成纤维细胞中ArchT-eYFP信号（绿色）与α-平滑肌肌动蛋白染色（白色，标尺10μm）（F）ArchT-eYFP阳性细胞FACS分选谱图及百分比

图4.转基因成纤维细胞系的电生理学特性（A-D）光诱导电流密度（CD）与膜电位变化（ΔMP）。左侧为不同光强（按颜色梯度：蓝-深绿-红-浅绿）下的典型响应曲线，右侧为统计分析。ChR2成纤维细胞在470 nm蓝光（绿色条表示）照射下诱发内向电流（A，原始轨迹对应光强：0.01、2.1、4.4、8.0 mW/mm²，n=16）和去极化（B，原始轨迹对应光强：0.54、2.1、3.7、6.6 mW/mm²，n=10）。表达ArchT的成纤维细胞在535 nm绿光照射下诱发外向电流（C，原始轨迹对应光强：0.4、4.6、9.2、13 mW/mm²，n=18）和超极化（D，原始轨迹对应光强：0.30、4.4、8.2、11 mW/mm²，n=13）。（E-H）TGF-β1刺激对光诱导电流及膜电位变化的影响。ChR2-mCherry成纤维细胞的最大内向电流密度（E，对照组n=16，TGF-β1组n=7，P=0.40）和去极化幅度（F，对照组n=10，TGF-β1组n=5，P=0.88）；ArchT-eYFP成纤维细胞的最大外向电流密度（G，对照组n=18，TGF-β1组n=9，P=0.64）和超极化幅度（H，对照组n=14，TGF-β1组n=13，P=0.32）。

05.光诱导成纤维细胞去极化提升心脏球体搏动频率

通过将非转基因心肌细胞与转基因ChR2-mCherry成纤维细胞共培养构建心脏球体，分析成纤维细胞去极化对心肌细胞的直接电生理影响。这些球体显示明亮的mCherry荧光信号（图5A），在470 nm蓝光（4 mW/mm²）照射下自发搏动频率立即增加，光照终止后恢复至基线水平（图5B）。频率增加效应具有光强依赖性，半数有效光强度（eLi50）为1.3±0.7 mW/mm²（n=5，图5C）。值得注意的是，TGF-β1处理组心脏球体的最大效应（标准化频率1.75±0.13）显著高于未处理对照组（1.30±0.09，图5D），而eLi50值相近（0.8±0.5 mW/mm²，n=7，图5C）。该eLi50值与成纤维细胞ChR2电流的eLi50范围一致，表明光在心脏球体内的衰减效应可忽略。重要对照实验显示，用野生型成纤维细胞构建的对照组心脏球体在光照下搏动频率无变化（图5E），证明不存在热效应。

图5 光诱导成纤维细胞去极化对心脏球体搏动频率的影响（A）ChR2-mCherry成纤维细胞构建的心脏球体mCherry荧光信号（红色，标尺200μm）（B）TGF-β1刺激组典型自发搏动频率轨迹（绿色条表示4.0 mW/mm²光照）（C）对照组（绿色，n=10）与TGF-β1刺激组（红色，n=16）在不同光强照射下的标准化搏动频率（D）对照组（n=10）与TGF-β1处理组（n=16）的最大光诱导频率增幅（P=0.03）（E）野生型成纤维细胞构建的对照组心脏球体在470 nm/4.0 mW/mm²光照下的自发搏动频率变化（n=3，P=0.98）

06.光诱导成纤维细胞超极化抑制心脏球体自发活动

为研究成纤维细胞超极化在三维心脏类器官中的作用，我们构建了含非转基因心肌细胞和表达ArchT-eYFP成纤维细胞的心脏球体（图6A）。绿光照射可立即引起自发搏动的剂量依赖性减速，光照停止后恢复至基线水平（图6B、C）。未经TGF-β1处理的球体对绿光响应较弱（图6C），而所有经TGF-β1处理的心脏球体在高光强照射下均完全停止自发搏动（图6D）。

图6 光诱导成纤维细胞超极化对心脏球体搏动频率的影响（A）ArchT-eYFP成纤维细胞构建的心脏球体eYFP荧光信号（绿色，标尺200μm）（B）TGF-β1刺激组在低光强照射（绿色条表示0.4 mW/mm²）下的典型自发搏动频率轨迹（C）对照组（绿色，n=10）与TGF-β1刺激组（红色，n=16）在不同光强照射下的标准化搏动频率（D）对照组（n=10）与TGF-β1处理组（n=16）的最大光诱导频率抑制效应（P=0.03）

07.成纤维细胞超极化对心肌细胞膜电位的调控作用

为直接证明成纤维细胞超极化可减弱其对心肌细胞的去极化效应（图1E），采用锐电极技术在光诱导成纤维细胞超极化过程中记录心脏球体中心肌细胞的动作电位。对TGF-β1处理的心脏球体进行低强度光照可诱导心肌细胞超极化，减缓舒张期自发去极化速度，并呈剂量依赖性降低自发搏动频率（图7A、B），这与视频显微镜观察到的频率变化一致（图6C）。

图7 TGF-β1刺激心脏球体中成纤维细胞超极化对心肌细胞膜电位的调控（A）TGF-β1处理的ArchT-eYFP成纤维细胞心脏球体中，心肌细胞膜电位（MP）及动作电位叠加图：光照前（绿色轨迹）与低光强照射期间（红色轨迹，535 nm，0.8 mW/mm²）（B）对照组（绿色，n=1-6）与TGF-β1刺激组（红色，n=1-8）在不同光强照射后的标准化动作电位频率（C）同一标本在高光强照射（绿色条，10 mW/mm²）下的心肌细胞膜电位典型轨迹（D）图B实验的统计分析：照射前后静息膜电位（RMP）变化（n=8，P=0.049，10 mW/mm²）

08.高强度光照效应与机制分析

高强度光照（10 mW/mm²）可完全阻断心脏球体的自发搏动活动（图7C）。统计分析显示，TGF-β1刺激组心脏球体中心肌细胞的静息膜电位（RMP）显著降低7.54±9.35 mV（图7D）。这表明成纤维细胞特异性超极化能够部分抵消TGF-β1诱导的心肌细胞去极化（图1E），直接证明了成纤维细胞对心肌细胞的电生理影响——当成纤维细胞处于肌成纤维细胞活化状态时，这种影响尤为显著。

四、讨论

本研究建立了一种新方法，可在体外三维心脏组织模型中量化成纤维细胞与心肌细胞间的电偶联。通过校准光强对心脏球体内的成纤维细胞进行选择性光遗传刺激，精确调控膜电位，证实TGF-β1处理可增强成纤维细胞与心肌细胞间的功能异细胞偶联。

与早期报道不同（该研究显示TGF-β1可增强新生大鼠心室肌成纤维细胞的电流和去极化），我们在NIH 3T3细胞系成纤维细胞中未观察到类似效应——尽管TGF-β1处理浓度与持续时间相近（本研究4 ng/mL处理3天，Salvarani等研究为2.5 ng/mL处理1-2天），但NIH 3T3细胞反而出现轻微超极化（图1F）。这种差异可能源于细胞来源不同、肌成纤维细胞样预激活状态改变或细胞尺寸差异（大鼠心室肌成纤维细胞电容约80 pF，NIH 3T3成纤维细胞约20 pF，图1G）。值得注意的是，TGF-β1刺激在大鼠心室肌成纤维细胞（1.77倍）和NIH 3T3成纤维细胞（3.25倍，图2A）中均引起连接蛋白43表达水平相似程度的升高。与先前报道中TGF-β1刺激的肌成纤维细胞使心肌细胞去极化约20 mV的结果一致，本研究发现TGF-β1刺激的心脏球体中心肌细胞去极化达16 mV（图1D）。

虽然未进行详细的组织学三维重建，但本研究认为三维心脏球体模型在模拟成纤维细胞-心肌细胞偶联方面优于既往使用的细胞对或单层培养模型，因其更好模拟了心脏间质纤维化中成纤维细胞穿插于心肌细胞层的真实情况。因此，本研究将既往发现延伸至三维异细胞组织模型，并证实TGF-β1刺激后增强的异细胞偶联更具重要性。

将体外观察到的心肌细胞膜电位升高和自发活动增强转化为体内情况，意味着心脏工作心肌中自发活动增加，可能触发期外收缩并引发潜在致命性快速心律失常。此外，心肌细胞的阈下去极化会降低钠通道可用性，导致电活动传导减慢，从而稳定和延长心律失常发作。因此，成纤维细胞诱导的心室肌细胞RMP升高被认为是间质纤维化高度致心律失常效应的原因之一。

01.靶向成纤维细胞膜电位的药理学调控策略

鞘脂类分子鞘氨醇-1-磷酸可通过开放成纤维细胞特异性离子通道使其去极化，经异细胞偶联进而导致心肌细胞去极化，这一发现展示了药理学精准调控成纤维细胞膜电位的潜力。若能识别仅表达于（肌）成纤维细胞的超极化钾通道或氯通道，并开发其特异性激活剂，将有望通过选择性超极化成纤维细胞来消除其对心肌细胞的去极化效应，成为极具前景的新型治疗策略。通过光遗传学技术对表达ArchT的成纤维细胞进行超极化，我们发现该策略在非TGF-β1刺激条件下对心肌细胞电生理影响微弱（图6D），这很可能源于异细胞偶联程度较低或舒张期输入电阻较TGF-β1去极化心肌细胞更低。因此，若该原理在体内完整心脏中成立，药理性肌成纤维细胞超极化将在病变心脏的健康区域产生较小副作用，主要作用于存在肌成纤维细胞且异细胞偶联增强的区域。

02.技术优势与应用前景

本研究通过记录心脏球体自发搏动来量化成纤维细胞-心肌细胞偶联的技术具有操作简便、可扩展性强的特点。除本文采用的视频显微镜分析外，还可结合多孔板系统进行可扩展的场电位测量（该技术已成功与光遗传刺激联用）。通过分析光遗传刺激成纤维细胞去极化与超极化的效应，可区分两类药物：影响异细胞偶联的药物（对ChR2和ArchT效应产生类似改变）和导致成纤维细胞超极化的药物（降低自发搏动频率并增强ChR2诱导的去极化效应）。对心肌细胞功能的副作用可通过非TGF-β1刺激心脏球体的基础搏动频率变化检测。因此，本研究为针对心肌纤维化三维模型中成纤维细胞电特性或异细胞偶联的新型化合物筛选提供了简便、可扩展的平台，较现有技术（双细胞膜片钳、间隙连接-FRAP或染料注射等操作繁琐且难以高通量化的方法）具有明显优势。

未来，本文所述光遗传学方法有望为研究体内原生成纤维细胞与心肌细胞的异细胞偶联效应提供新途径。但目前实现成纤维细胞特异性表达光遗传工具仍面临挑战——即使利用Cre/LoxP系统仍难以实现光遗传工具在成纤维细胞中的特异性表达，或仅能在少量特定成纤维细胞亚群中表达荧光报告基因。尽管如此，本研究验证了成纤维细胞特异性光遗传去极化/超极化技术的概念可行性，为最终应用于体内动物模型奠定基础。

五、结论

本研究建立了一种新型三维异细胞共培养模型，可量化成纤维细胞对心肌细胞电特性的影响。研究证实TGF-β1刺激通过增强异细胞偶联使心肌细胞去极化，进而提高其自发活动性。关键发现是：光诱导成纤维细胞去极化会进一步增强致心律失常效应，而在TGF-β1增强偶联的情况下，光诱导成纤维细胞超极化可完全阻断自发搏动。该新方法在输入与输出端均具有简易性和可扩展性，可用于体外筛选影响成纤维细胞-心肌细胞功能电偶联的化合物，未来亦有望用于量化体内成纤维细胞膜电位对心肌细胞功能的影响。

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