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来源 | 《现代纺织技术》2024年第32卷，第8期

作者 | 胡文锋, 夏义尝, 高彦涛, 赵 奕

( 1.上海工程技术大学纺织服装学院,上海 201620;2.东华大学纺织学院产业用纺织品教育部工程研究中心,上海 201620 )

作者简介 | 胡文锋(1985—),男,上海人,实验师,主要从事产业用纺织品方面的研究。

  摘要   为了解决天然抗菌丁香酚(EG)应用过程中易挥发、利用率低的问题,采用Stöber法制备高比表面积、微孔径可控、热稳定性和生物兼容性优的丁香酚专用介孔二氧化硅微粒(MSNs),探究其在敷料应用场景下的长效缓释、高效抗菌等性能。设计制备的MSNs粒径范围为100～200 nm,孔径6.54 nm,比表面积998.05 m2/g,丁香酚固载量达57.09%。实验证明丁香酚/介孔二氧化硅纳米颗粒(EG@MSNs)具有快速抗菌效果,而EG@MSNs负载的非织材料基海藻酸钙敷料(EG@MSNs/CA@NWs)经过恒温培养箱培养15 d后,对大肠杆菌仍保持良好的抑菌效果,且该抗菌敷料的凝血时间缩短71.40%。此外,EG@MSNs/CA@NWs敷料的荧光物、表面活性物、水中溶出物和水浸出液酸碱度均表现优异。文章设计制备的EG@MSNs有望在伤口、创面抗菌修复领域展现良好的实际应用潜力。

  关键词  丁香酚; 介孔二氧化硅; 海藻酸钙海绵; 敷料; 抗菌

丁香酚是从天然丁香中提取的一种重要生物活性化合物,具有抗癌、抗氧化、防腐、抗抑郁等作用,并且对各种细菌和真菌具有广谱抗菌性,每100 g新鲜丁香植物中含有9.4～14.7 g丁香酚[1]。然而,丁香酚的快速挥发特性和化学不稳定性,致使其在实际使用时利用率低[2]。

介孔二氧化硅具有比表面积高、孔径可调、易于功能化以及热稳定性好和生物相容性高等特点,近年来在环境、能源和生物技术等世界热点研究领域被广泛研究[3-4]。陈小妮等[5]采用溶胶-凝胶法合成发散状介孔SiO2/MSNs,制备了不同Ag负载量的Ag-CeO2/MSNs催化剂,探究了SiO2/MSNs对四氢糠醇(THFA)选择性氧化生成乙酸四氢糠酯的催化效果。唐昭敏等[6]报道了一种负载过氧化铜(CuO2)的介孔二氧化硅纳米颗粒,其内部负载化疗药物阿霉素,通过分解可以产生外源性H2O2和类芬顿离子Cu2+,表现出良好的细胞相容性。王钊贵等[7]采用一锅溶胶-凝胶法制备了一种对松材线虫具有高毒力的负载甲维盐介孔二氧化硅纳米颗粒(EB@MSN),该纳米颗粒具有一定药物缓释功能,明显提高EB对松材线虫的毒力效果。然而,对于丁香酚的高效负载鲜有相关研究。

目前,大量的创面修复和止血等伤口护理应用中亟需具可控抗菌、天然安全的抗菌医用材料[8]。本文首先通过热风工艺制备生物相容性优、可促凝、易于创口修复[9-11]的非织造基复合海藻酸钙海绵(CA@NWs)敷料基材;再采用Stöber法,制备用于固载天然抗菌EG的高比表面积的MSNs,并用于获得热稳定性好、载香量高、即时溶出速度快的芳香抗菌纳米颗粒(EG@MSNs);最后,利用雾化溅射技术[12]将EG@MSNs均匀、牢固地喷涂在CA@NWs敷料表面。通过SEM、TEM、FT-IR、SAXRD等一系列表征与测试,对7种不同海藻酸钙含量的速冻CA@NWs芳香抗菌海绵敷料进行抑菌和凝血等生物医用性能测试,分析并验证抗菌丁香酚/介孔二氧化硅纳米颗粒的抑菌抗菌、凝血、抗炎等特性具有良好的应用潜力,有望应用于伤口、创面抗菌等修复领域。

实验材料:丁香酚(纯度98.5%),上海源叶生物科技有限公司;正己烷(分析纯),十六烷基三甲基溴化铵(分析纯),阿拉丁生化科技股份有限公司;氨水(分析纯,纯度25%～28%),正硅酸四乙酯(分析纯),溴化钾(纯度99.90%),上海麦克林生化科技股份有限公司;非织造基海藻酸钙冻干海绵,自制;抗凝牛全血(3.8%柠檬酸钠抗凝剂),上海源叶生物科技有限公司;胰蛋白胨(微生物用),酵母提取物(微生物用),琼脂粉(微生物用),上海生物工程有限公司。

实验仪器:场发射扫描电子显微镜(Regulus 8230,日本日立公司);透射电子显微镜(JEM-2100,日本JEOL公司);Zeta-电位分析及粒径分析仪(Zetasizer Nano ZS,马尔文帕拉科公司);傅里叶红外光谱仪(NEXUS-670,美国尼高力公司);全自动快速比表面与孔隙度分析仪(Autosorb-iQ,美国康塔仪器公司);X射线衍射仪(Bruker D8 ADVANCE,德国布鲁克公司);紫外可见近红外分光光度计(Lambda 35,美国珀金埃尔默公司);热重分析仪/差示扫描量热联用仪(CLARUS SQ8-STA8000,美国珀金埃尔默公司);喷笔(HP-CH,日本阿耐思特岩田公司);蠕动注射泵(Legato100,美国KD科学公司);冷冻干燥机(FD-1A-50,上海比朗仪器制造有限公司)。

采用改进的Stöber法制备MSNs,并通过纳米固载的方式制备具有抗菌功能的芳香纳米颗粒EG@MSNs。制备流程如下:

a)MSNs的制备:参照文献[13]中的研究,利用表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)在去离子水中形成胶束,之后加入本体正硅酸四乙酯(TEOS),在氨水的催化下水解并沿胶束原位自组装形成纳米颗粒,之后在含有盐酸的乙醇中提取模板,得到具有介孔结构的二氧化硅纳米颗粒。

b)EG@MSNs的制备:将0.5 g MSNs分散于20 mL丁香酚乳液中,在转子下持续搅拌72 h,得到含有丁香酚的EG@MSNs分散液。使用离心机(9000 r/min,15 min)进行固液分离,固体部分经过乙醇和去离子水交替洗涤4次,去除表面的游离丁香酚残余,然后采用冷冻干燥的方法(在-80 ℃下预冻0.5 h后,负压抽吸6 h)去除残留的水分,得到EG@MSNs芳香纳米颗粒粉末。

首先通过热风加固工艺制备非织造材料基材,然后采用浸取冷冻干燥的方法将非织造基材和海藻酸盐结构的复合,具体制备流程如下:

a)热风非织造基材(NWs)的制备:参照张楠等[14]的研究,按亲水ES纤维和粘胶纤维5∶5的比例称取纤维原料共105 g,混合、开松后喂入单锡林双道夫梳理机进行两道梳理,通过热定型烘干机在133 ℃下进行热风穿透后冷却定型。

b)热风非织造基复合海藻酸钙海绵(CA@NWs)的制备:配置质量分数为X%的海藻酸钠(SA)50 mL(X为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0),将NWs剪裁成直径为8 cm的圆形,浸渍于SA溶液中,预冻后放入-80 ℃冷冻2 h,经过冷冻干燥后使用质量分数为5%的氯化钙溶液进行交联固化10 min。最后,采用离子液体清洗并在45 ℃烘箱中干燥30 min。通过不同质量分数SA溶液制备得到的复合海绵敷料样品用X-CA@NWs表示。

采用雾化溅射技术对CA@NWs的非使用面进行芳香抗菌功能化整理,制备EG@MSNs/CA@NWs芳香抗菌海绵敷料。将经超声预处理的芳香整理液注入喷笔容器中,分散液质量浓度为20 mg/mL,设置气泵压力为4 bar,限流顶针后退半旋,此时液体流速为1 mL/16 s,将芳香整理液通过雾化溅射技术喷洒在CA@NWs表面,制备具有芳香抗菌功能的CA@NWs复合海绵。图1为EG@MSNs/CA@NWs复合海绵敷料制备实验流程图。

图1 EG@MSNs/CA@NWs复合海绵敷料制备流程图

Fig.1 Flow diagram for the preparation process of EG@MSNs/CA@NWs composite sponge dressing

1.5.1 基本性能

采用扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)对MSNs的形貌进行了表征。采用比表面积与孔径(BET)测试系列样品的比表面积和介孔孔径。采用电位分析(DLS-Zeta)测试MSNs、EG和EG@MSNs的Zeta电位。采用傅里叶红外光谱(FT-IR)、小角X射线衍射(SAXRD)、热重分析(TG)分析材料属性和热稳定性。

1.5.2 应用性能

采用紫外可见近红外分光光度计(UV-Vis)对比测试EG经MSNs固载前后在创面组织渗出液模拟液中的即时溶出量的差异,图2为标准线测试与校准。

图2 不同质量浓度的丁香酚溶液紫外吸收光谱图

Fig.2 Ultraviolet absorption spectrum of eugenol solution at different concentrations

EG@MSNs中芳香物质即时溶出量由紫外分光光度计法测定。吸光度值可以根据拟合方程A=0.01909C+0.01382计算得到样品模拟液A中EG的即时溶出量。

1.5.3 EG@MSNs/CA@NWs复合海绵敷料医用潜力评价

芳香纳米颗粒负载效果和抑菌性能测试。制备了两组样品,1#样品:添加了0.2 mL芳香整理液;2#样品:添加了0.5 mL芳香整理液。测试各样品对大肠杆菌(E.coli)生长的抑制作用,并以空白CA@NWs海绵和空白MSNs为对照样,参照《接触性创面敷料试验方法 第1部分:液体吸收性》(YY/T 0471.1—2004)中所述方法配置人体创面组织渗出液模拟液A。

体外凝血性能测试。评价参照文献[15],水中溶出物、荧光物以及水浸出液酸碱度测试分别参照《接触性创面敷料试验方法 第1部分:液体吸收性》(YY/T 0471.1—2004)中附录D、附录E和附录F的方法进行。表面活性物测试参照《脱脂棉纱布、脱脂棉粘胶混纺纱布的性能要求和试验方法》(YY 0331—2024)中的5.11进行。

用扫描电子显微镜观测MSNs的粒径,如图3所示。从图3(a)和3(b)中看出MSNs的粒径为100～200 nm,图4透射电镜图中MSNs表面孔洞排列均匀,与Wang等[16]的研究结果一致。丰富的通孔结构显著提高了MSNs的比表面积,有利于纳米固载和持续释放精油、药物和染料等小分子物质。此外,动态光散射(DLS)技术测量显示MSNs的平均直径为180.1 nm,如图5所示,分布系数(PDI)值0.428,表明合成样品粒径分布均匀。

图3 MSNs的SEM和粉末样品照片

Fig.3 SEM and physical powder sample images of MSNs

图4 MSNs的TEM图像

Fig.4 TEM image of MSNs

图5 MSNs粒径分布图

Fig.5 Particle size distribution of MSNs

2.2.1 EG@MSNs的结构与成分

MSNs经过高温煅烧后的FT-IR表征结果如图6(a)所示,其中MSNs-CTAB和MSNs在1050、800 cm-1和462 cm-1处显示了特征吸收峰,对应于Si—O—Si四面体的对称、弯曲和非对称振动峰。955 cm-1处的特征吸收峰归属于Si—O在Si—OH键中的拉伸振动峰。1644 cm-1和3346 cm-1处的特征吸收峰属于SiO2表面的硅羟基和吸附的水分子。煅烧移除CTAB模板前,MSNs-CTAB杂化球中含有CTAB,在2852 cm-1和2922 cm-1处出现C—H键伸缩振动带,在1464 cm-1处的吸收峰由CH2剪切振动产生,也同样表明烷基链中的亚甲基具有全反构象,证实了CTAB分子的存在[17-18]。经过煅烧后,属于CTAB的特征吸收峰消失,说明用于形成介孔孔道的模板剂已经基本除去,获得了纯净的MSNs样品,这与SEM和TEM图像结果一致。

图6 MSNs的红外光谱图

Fig.6 Infrared spectrum of MSNs

MSNs载香前后的FT-IR表征结果如图6(b)所示,在载香前,EG在720～1250、1637.56、1615.56 cm-1和1514.12 cm-1出现了特征峰,分别对应于CC的振动带和芳香族部分的CC拉伸(后三处特征峰)。说明3500 cm-1处的宽频带是2,4-二烯丙基-6-甲氧基苯酚(EG)中OH振动产生[19-20]。

经过载香后,EG@MSNs在1640 cm-1处峰强度增强,在1510 cm-1位置出现新的特征峰,表明MSNs成功固载了EG,但吸收特征峰低于游离EG,表明EG主要包含在MSNs腔中[21]。

2.2.2 EG@MSNs的载香分析

结合MSNs理化性质的变化,进一步分析EG小分子与MSNs之间的结合效果。BET测试结果显示,MSNs初始比表面积为998.05 m2/g,介孔尺寸为6.54 nm,孔径分布均匀,如图7(a)所示,这主要是由于纳米级颗粒尺寸和丰富的孔道结构所致。根据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)的规定,MSNs和EG@MSNs的吸脱附等温线如图7(b)所示,显示出典型的Ⅳ型吸脱附等温线,中段有吸附回滞环,后段快速上升,表明多孔材料吸附出现毛细凝聚的体系。MSNs载香后,EG小分子会占据介孔孔道,使得MSNs的孔道由介孔变为更为狭窄的狭缝孔隙,这一点可以通过吸脱附等温线回滞环的变化,从介孔二氧化硅特征的H2型趋向于H4型来证明,同时导致EG@MSNs的比表面积降至669.39 m2/g。

图7 MSNs固载丁香酚前后结构和性能变化测试图

Fig.7 Structural and performance changes of MSNs before and after loading eugenol

Zeta电位测试中如图7(c)所示,EG/水乳液经过超声细胞粉碎仪处理后电位电势为33.7 mV,而MSNs由于具有硅羟基(Si-OH),其电位电势为-28.6 mV,EG@MSNs电位电势为-13.1 mV,这表明除了具有小孔吸附作用外,MSNs和EG之间还存在电荷力相互作用。MSNs和EG@MSNs的SAXRD图谱如图7(d)所示,MSNs有序排列的介孔结构可以通过2θ=1.38°处出现的属于(100)晶面的特征衍射峰来证明,与形貌观察结果一致,但衍射峰较弱,说明介孔排列的短程有序性不高[22]。对于EG@MSNs,衍射强度明显下降,进一步证明EG小分子在MSNs的介孔孔道中被固载,衍射峰的保留说明载香后的介孔结构仍然有部分保留,没有被完全占据,但由于芳香小分子的固载,有序性降低。此外,对应于2θ=1.38°处的衍射峰位置往左出现一定的偏移,根据布拉格公式可知,晶面间距(d)与衍射角(θ)呈反比关系,当衍射角保持不变时,晶面间距会随着物质密度的增加而减小,而精油小分子的吸附会增加晶体表面或孔道内的物质的密度,使精油小分子的吸附会使MSNs的晶面间距减小[23]。

对EG@MSNs进行热重分析,结果如图8所示。纯EG在约91.8 ℃开始出现失重,在213.5 ℃后失重趋于平缓。MSNs表现出良好的热稳定性,重量在550 ℃内保持稳定。TG测试中重量下降了5.6%,其中1.9%对应于71.9～146.7 ℃范围的含水降解峰,由于样品经过冷冻干燥预处理,下降量很小,余下的3.7%对应于MSNs硅羟基(Si-OH)间的缩聚脱水。EG@MSNs的TG曲线显示有两个失重阶段,第一阶段在72.1～227.4 ℃之间,重量下降了54.3%,对应于含水和固载EG在表层和浅层孔道的释放,在182 ℃处达到最快热损失速率。第二阶段在227.4 ℃后开始,重量下降了8.3%,对应于MSNs自身的硅缩聚和深层孔道中固载EG的释放。与MSNs相比,EG@MSNs具有高达57.1%的EG固载量,表明高比表面积和丰富的介孔孔道使得EG@MSNs具有极高的芳香小分子吸附和固载能力。此外,EG@MSNs的TG曲线显示,固载EG的释放速率较慢,表明MSNs的纳米固载能够提高EG的热稳定性,有利于长期缓释应用。

图8 热重分析图

Fig.8 Thermogravimetric analysis (TGA) diagram

2.2.3 EG@MSNs在溶液体系释放性分析

为了适应医疗敷料的湿润环境需求,并确保样品在创伤处理时能够迅速形成抗菌的液体微环境,本文采用UV-Vis法测试EG@MSNs在创面组织模拟液中即时溶出量,实验结果经过origin软件线性拟合后如图9所示,得出芳香颗粒浓度与即时溶出量之间的关系。EG的正辛醇-水分配系数(log Kow=2.1)表明其微溶于水,未经MSNs纳米固载时,随着EG在模拟液中添加量的增加,其即时溶出量呈现缓慢的线性增加,拟合方程R2为0.8212,显示出良好的拟合准确性。经过MSNs固载后,随着模拟液中芳香纳米颗粒的浓度增加,精油小分子的即时溶出量迅速增加,根据拟合方程计算得出,在模拟液中EG@MSNs的分散质量浓度约为2.35 mg/mL时,其即时溶出量达到了添加过量EG所能达到的同一水平。因此,经过MSNs固载后,EG在创面组织模拟液中的即时溶出量大大提高。

图9 芳香颗粒浓度与即时溶出量之间的关系

Fig.9 Relationship between aromatic particle concentration and immediate dissolution amount

2.3.1 芳香纳米颗粒负载效果

EG@MSNs/CA@NWs复合海绵敷料的SEM表征如图10所示,经过芳香雾化溅射整理后的CA@NWs海绵表面均匀分布着EG@MSNs纳米颗粒。抗菌纳米颗粒有序负载于敷料以吸收创面组织渗出液,可为创面微环境提供快速的抗菌效果。

图10 EG@MSNs负载在CA@NWs敷料上的SEM图

Fig.10 SEM images of EG@MSNs loaded on CA@NWs dressings

2.3.2 抑菌性能

丁香酚的抑菌机理是丁香酚通过抑制金黄葡萄球菌的三羧酸循环和电子链传递中的关键酶活性来抑制其生长[24-25]。为了评价实验样品的抑菌性能,使用了抑菌圈法,效果如图11所示。培养基经过恒温培养箱培育24 h后,可以明显观察到,未经载香和芳香雾化溅射整理的MSNs与CA@NWs空白样都没有抑菌效果,而经过纳米固载精油的EG@MSNs和芳香雾化溅射整理的CA@NWs海绵对大肠杆菌(E.coli)有显著的抑制效果,E.coli抑菌圈的半径达到18.1 mm。同样,芳香雾化溅射整理后的CA@NWs海绵也展示了明显的抑菌效果。根据芳香整理液用量的不同,出现了不同的抑菌效果差异,其中,1#、2#样品的抑菌圈大小分别为14.5、23.4 mm,当芳香整理液用量达到0.5 mL时,经过芳香整理后的CA@NWs海绵样品几乎完全抑制了大肠杆菌的生长,具有极佳的抑菌效果。因此,雾化溅射的整理方式能够快速、低成本、自主可控地调节样品的抗菌性能。

图11 样品抑制大肠杆菌性能评价示意图

Fig.11 Schematic diagram of the evaluation of Escherichia coli inhibition performance of the samples

2.3.3 体外凝血性能

从图12(a)中可以看出,当抗凝牛全血滴加至CA@NWs芳香抗菌海绵敷料上后,敷料迅速吸收血液并由浅色转为暗红色。在培养皿边缘缓慢注入去离子水后,医用棉纱布敷料和NWs吸收的血液在水中溶解较多,材料由暗红色恢复为浅色。这说明尽管两者都能够吸收血液并留存在孔隙空间内,但基本上没有凝血效果。由于NWs具有更丰富且复杂的内部孔道结构,部分血液仍然残留在材料上,因此NWs的凝血效果略优于医用棉纱布。

图12 体外凝血性能评价

Fig.12 In vitro coagulation performance evaluation

对于CA@NWs芳香抗菌海绵敷料而言,随着CA含量的增加,水中因血液溶出而变色的区域明显减少,说明血液吸附能力随CA含量的增加而提高,当海藻酸盐浓度达到质量分数为1%时,水中没有明显的血红细胞溶出而变色的区域,证明血细胞能够牢固地吸附在材料复合空间结构内部。

不同材料的凝血时间如图12(b)所示,与空白对照组、医用纱布敷料和NWs相比,CA@NWs芳香抗菌海绵敷料具有显著的凝血效果。此外,随着制备浓度从质量分数为0.1%增加至3%,凝血时间缩短了57.1%～71.4%,只需少量的海藻酸钙即可显著缩短敷料的整体凝血时间。此外,由于增加了孔隙,敷料与血液充分接触,低CA含量的复合敷料与纯CA的凝血时间相差不大。通过体外凝血性能评价可知,NWs骨架的应用能够有效发挥海藻酸钙材料的促凝血能力。

2.3.4 荧光物、表面活性物、水中溶出物、水浸出液酸碱度

荧光物、表面活性物、水中溶出物、水浸出液酸碱度性能是医用敷料重要的性能指标 [26-27]。参照《接触性创面敷料试验方法 第1部分:液体吸收性》(YY/T 0471.1—2004)中附录E、D、F分别测试样品的上述性能发现:如图13所示成品的荧光物符合医用行业标准;如表1所示,在制备的7种不同质量分数梯度速冻CA@NWs芳香抗菌海绵敷料中,各浓度条件下的复合敷料表面活性物质泡沫高度均接近于0 mm,符合医用行业标准不超过2 mm的要求,而敷料在水中的溶出物含量在0.32%～0.44%范围内,随着海藻酸钠浓度的略微增加,但总体上仍符合医用行业标准中不高于0.50%的规定,同时水浸出液pH值均呈弱酸性,弱酸环境有利于介孔二氧化硅中负载的丁香酚小分子的释放[28-29]。

表1 不同质量分数的试样生物医用标准性能测试

Tab.1 Biomedical standard performance testing of samples with different mass fractions

图13 荧光物质测试图

Fig.13 Fluorescent substance testing

本文制备了高固载量丁香酚专用介孔二氧化硅(EG@MSNs),再与海藻酸钙热风非织造敷料基材(NWs)结合,得到了抗菌、促凝血的CA@NWs敷料。研究结果显示:

a)MSNs中EG的固载量达到了57.09%,在热作用下以浅层快速和深层慢速两个阶段释放,从而提高了EG的热稳定性。

b)经MSNs固载后,EG在创面组织模拟液中的即时溶出量显著增加,当EG@MSNs的拟合计算分散质量浓度为2.35 mg/mL时,即时溶出量达到了添加过量EG所能达到的同一水平。这使得EG@MSNs在创伤处理敷料中能够最大程度地发挥作用,并有潜力与“湿润疗法”有机结合,快速创建抗菌的液体微环境。

c)负载丁香酚的CA@NWs敷料具有长达15 d以上的显著大肠杆菌生长抑制能力,且凝血时间可缩短71.4%。同时,该敷料的荧光物、表面活性物、水中溶出物和水浸出液酸碱度优良,具有良好的实际应用潜力。

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  参考文献 

略

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