引 言 

本期的文献导读是一篇关于《真空采血管对凝血试验的影响》的综述，介绍了真空采血容器材料、内壁、抗凝剂和浓度、真空度和水剂保持能力，以及死腔对凝血试验检测的影响。深入了解这种影响，对于规范实验操作，广泛开展凝血试验，建立凝血试验全面质量保证体系，做好分析前质量控制尤为重要。

临床常规凝血试验，包括血浆凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、纤维蛋白原（FIB）等试验已成为临床出血与血栓性疾病筛查、药物治疗监测等的常规检测项目。许多分析前变异可能会影响常规凝血试验的结果[1]，包括真空采血管，因为采血管不是惰性的采血容器，它的材料、内表面、附加剂、胶塞等可能干扰检测[2,3]。采血系统的设计错误或不当使用可能会干扰实验室检测结果的准确性，采血管和采血针等在血流过程中施加剪切力，导致细胞破裂；采血管的胶塞、表面活性剂和分离胶可能会析出释放至标本中和/或吸收标本中的分析物，特殊的添加剂可能改变分析物的稳定性。由于血液标本与这些成分相互作用，采血系统是检验分析前误差的潜在来源[4]。

一、容器材料和胶塞  

无论是玻璃管还是塑料管，容器材料及其内表面可能会吸附蛋白和血小板，导致溶血。血液离开人体后，进入采血管并与其内壁接触，血液中血小板可能迅速被激活，影响其他血小板活化的研究。传统上采用硅化玻璃管采集凝血试验标本[5-9]，但因其易碎、不环保和不耐辐照灭菌，而逐渐被塑料管代替。

玻璃材质通常有钠钙玻璃或硼硅酸盐玻璃，但会释放钙和镁至血液标本中[10]。凝血因子，例如XII因子（Hagemann因子）与亲水性玻璃表面的接触会激活凝血级联反应，从而导致纤维蛋白原转化为纤维蛋白，离心后从血浆中分离出非粘附性凝块[11]。与玻璃管中形成的凝块相比，塑料管通常具有疏水性表面，不会激活凝结过程[12]，塑料管表面形成的凝块呈凝胶状[13]。此外，血液不能在疏水性塑料表面上顺畅流动，可能导致血小板、纤维蛋白或血液凝结在管壁上[13]。但是，在处理或运输过程中血块重新悬浮在血浆中可能会产生溶血干扰检测结果[14,15]。

尽管Jan等对比研究5种采血管的体外血小板活化，认为玻璃管对血小板的保护最好，塑料管效果次之[16]。但Soner等[17]和Alexander等[18]的研究表明塑料管可以替代玻璃管用于凝血试验。Gosselin等人的研究表明尽管玻璃管和塑料管在PT、APTT、纤维蛋白原、蛋白C（功能性和抗原性）、功能蛋白S、抗凝血酶和XIII因子之间存在统计学差异（p<0.05），但不具有临床意义[5]。塑料管标本PT和INR显著低于玻璃管标本PT和INR，塑料管INR的治疗监测可能导致使用更高剂量的华法林[6]。Toulon等认为采集UFH患者的血液时，塑料管比玻璃管APTT明显更长，抗FXa活性更高，但这些差异均无临床相关性；塑料管在效期内，均适用于接受传统抗凝治疗的患者进行凝血测试[7]。Anton等人对比了三个品牌采血管对5种凝血活酶试剂检测凝血酶原时间（PT）和国际敏感性指数（ISI）的影响，Vac管中PT比S-Monette或Veno短，而ISI比S-Monette或Veno高；柠檬酸钠溶液中镁离子污染可能影响不同采血管中PT和ISI，对参考凝血活酶进行ISI校准，应使用二价金属离子污染最少的柠檬酸盐采血管。胶塞含有的金属离子可能影响检测[19]。

采血管制造厂家应充分验证血液盛装容器的生物相容性，包括血小板聚集、蛋白吸附和溶血，确保其提供的采血管不会对检测结果产生干扰。如果制造厂家自身无法验证其选择容器材料的生物相容性，应选择有验证能力的第三方（例如SGS等）进行验证。

（图片来自网络）

二、抗凝剂  

柠檬酸钠盐是凝血试验的首选抗凝剂。柠檬酸钠主要螯合或结合血液中的钙离子。钙是凝血级联反应中的必要因素，从凝血酶原复合物中除去钙可防止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制并阻止纤维蛋白原向纤维蛋白的转化。柠檬酸钠的螯合作用可以通过血液或去钙血浆的再钙化来逆转。由于这种简单的可逆作用，柠檬酸钠适用于凝血实验。柠檬酸钠对Ⅴ因子和Ⅷ因子有较好的保护作用，减缓其活性降低，对细胞及血小板的影响也极其微小，还可用于血小板聚集研究。其他抗凝剂（例如草酸盐、肝素或EDTA）不可用作凝血试验的抗凝剂[20]。

 

柠檬酸是三羧酸，分子量192。通常使用三钠盐，其分子量为294，带有2分子水（pH值约为8.0）；也可以使用柠檬酸钠（柠檬酸二钠、柠檬酸氢二钠）（pH4.9~5.2）。柠檬酸钠和柠檬酸的组合称为“缓冲”柠檬酸钠。由于柠檬酸钠毒性小，适用于血液贮存，是输血保养液中的成分之一。柠檬酸钠在水中溶解慢，故只能配成水剂而不能用粉剂。血小板的聚集作用随血浆中柠檬酸钠浓度的升高而降低。

 

柠檬酸钠浓度可能对APTT和PT分析结果有重大影响，尤其是当结果超出正常范围且使用反应试剂时。过去也使用3.8%（0.129mol/L）柠檬酸钠，但现在已经不再推荐用于常规凝血研究。在3.8%的柠檬酸钠采血管中，存在过量柠檬酸钠可能会结合更多存在的钙离子，例如，重新添加到凝血试验中，从而干扰了凝血试验结果。CLSI建议使用3.2%柠檬酸盐浓度，相当于0.l09mol/L[20]。尽管建议浓度为3.2%柠檬酸钠，但采血管内的柠檬酸钠浓度仅大约为3.2%，并且不同制造商的采血管也有所不同[1]。

 

3.2%和 3.8%的柠檬酸盐采血管不可互换，因为两种柠檬酸盐浓度都可能产生不同的测试RI和患者结果。实验室应根据一种柠檬酸盐浓度确定其APTT和PT的正常范围，并且在确定新的正常范围之前，必须始终对所有患者标本使用该浓度[20]。

Adcock等人研究表明[21]，当使用反应性试剂（例如肌动蛋白FS，Innovin）时，两种柠檬酸盐浓度之间的APTT和PT结果将出现统计学差异；当使用反应性试剂和3.8%柠檬酸钠时，PT值始终更高；当使用非反应性试剂时，3.8%柠檬酸盐对应的APTT和PT正常范围可能比3.2%柠檬酸盐高；当使用非反应性试剂（例如肌动蛋白，凝血活酶C+）时，不同柠檬酸盐浓度对应的正常范围变化较小；当使用非反应试剂时，除了接受静脉肝素治疗的患者，改变柠檬酸盐浓度几乎没有临床意义。

Franz等的研究结果表明[22]，当使用3.8%柠檬酸钠时，含有鞣花酸的活化部分凝血活酶时间试剂（APTT-FS）、稀释罗素蝰蛇毒液时间（dRVVT）、因子V、因子VIII和蛋白C活性检测比3.2%柠檬酸钠显著延长；不同柠檬酸盐浓度对APTT-FS和StaclotLA检测有很大影响。

对于某些凝血和血小板试验，可以使用其他抗凝剂或无添加剂[23]。含有柠檬酸右旋糖和柠檬酸茶碱、腺苷和双嘧达莫的采血管已被用于抑制血小板活化。使用含有Phe-Pro-Arg-氯甲基酮和/或抑肽酶的采血管分别抑制凝血系统和血纤蛋白溶解系统的活化[24]。肝素锂、EDTA或无抗凝剂的采血管用于免疫分析检测，例如肝素诱导的血小板减少测试和APS抗体测试。已经有用于特殊检测的专用采血管，例如纤维蛋白（原）降解产物[25]（高浓度的凝血酶）和tPA测试[26]（酸化的柠檬酸盐），这些检测必须使用特殊采血管才能获得准确的结果。如果使用非标准管或制造商产品说明书中未推荐的采血管，则必须经过实验室验证[1]。

正常范围-柠檬酸影响[21]

柠檬酸钠浓度	肌动蛋白FSAPTT	Innovin PT	肌动蛋白APTT	凝血活酶C+PT
3.2%	22~31	8.6~10.7	23~33	12~14
3.8%	24~33	9.2~11.4	22~31	11~14
p	<0.001	<0.001	不显著	不显著

三、保水保气能力  

柠檬酸钠体积和血液的体积比例通常为1:9。柠檬酸钠管内的真空设定和真空保持能力影响采血管最终的采血量，进而影响附加剂和血液之间的比例。管内真空度设定除了与设备的准确度和精确度有关，通常还需要考虑海拔的影响，根据海拔不同而设定真空，随着海拔的升高，采血管真空度应设定得更大。如果按照0海拔设定真空的采血管在高海拔地区使用，可能会出现采血量过少的问题。

玻璃材质和塑料材质的分子排列方式、透水率和透气性都会影响真空度的保持。玻璃材质分子排列紧密，气密性好、防水、耐热，可在较长时间内保持真空度和液体，玻璃采血管的有效期也会更长[13]。

塑料管材料通常有聚酯[例如聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）]、聚烯烃[例如聚乙烯和聚丙烯（PP）]、聚丙烯酸酯、聚四氟乙烯、聚硅氧烷、聚氯乙烯、聚丙烯腈和聚苯乙烯[27,28]。与玻璃管[8]相比，塑料具有更高的透气性和透水性，因此塑料管的有效期比玻璃管短很多。PET是真空采血管常用的塑料，不容易破损，可以长时间保持真空度[9]，但是水渗透性较高，不适合水剂的采血管。另一种常用的塑料PP，具有较低的水渗透性，使其能够保留液体抗凝剂的体积和浓度[9]。因此，PET和PP结合的双层管可以最大程度地减少蒸发，特别是对基于凝血的试验[9]；内部的PP层可防止柠檬酸盐溶液蒸发，而外部的PET层则更透明，可更容易地观察采血管内的采血量。PP和PET的组合可延长保质期和抗凝剂的体积保持率[9]。这种双层管结构也减少了“死腔”[8]。

 

（凝血专用管）

四、死腔  

采血管死腔（未被血液填满的空腔）增加了血小板与管壁或死腔气体的接触而激活血小板，释放PF4并中和肝素，造成APTT负偏差。真空采血管死腔会产生血小板活性增强（PF4活性增强）、APTT缩短现象的原因可能是多方面的，但至少有一种原因是由于管内死腔增加了血小板与管壁作用的机会（尽管管壁被硅化，仍有激活血小板的可能），或死腔中气体对血小板的激活作用，导致血小板活化，释放出PF4，而PF4对血样中肝素的中和作用使肝素活性降低，导致了血样APTT缩短“假象”。而这将会误导临床医生根据APTT缩短的“假象”增加肝素的用量，是十分危险的[29-33]。由于死腔激活血小板是随机偶然事件，目前尚未对其发生机理和概率有非常明晰的认识，因此无法通过对APTT正常值的校正来解决死腔问题。不论是进行血小板功能试验还是监测APTT以指导肝素抗凝治疗，使用“无死腔”真空采血管是十分重要的[34]。

因此，凝血试验中的柠檬酸钠管建议使用双层管，确保血液和附加剂的体积比例为9:1。这个改良设计不仅在采血量适宜的前提下解决了死腔干扰问题，而且适用于各种类型的血凝仪，便于直接上机检测[29,35]。

参考文献    

1. Robert C. Gosselin, Richard A. Marlar. PreanalyticalVariables in Coagulation Testing: Setting the Stage forAccurate Results. Semin Thromb Hemost 2019; 45:433-448.

2. CLSI document GP34-A Validation and Verification ofTubes for Venous and Capillary Blood Specimen Collection;Approved Guideline (2010).

3. Bowen R A R , HortinG L , CsakoG , et al. Impact of bloodcollection devices on clinical chemistry assays[J].ClinicalBiochemistry, 2010, 43 (1-2) : 4-25.

4. Raffick A.R. Bowen,Alan T. Remaley. Interferences fromblood collection tube components on clinical chemistryassays. Biochem Med (Zagreb). 2014 Feb; 24 (1): 31-44.

5. Gosselin RC, Janatpour K, Larkin EC, Lee YP, Owings JT.Comparison of samples obtained from 3.2% sodium citrateglass and two 3.2% sodium citrate plastic blood collectiontubes used in coagulation testing. Am J Clin Pathol2004;122:843-848.

6. Fiebig EW, Etzell JE, Ng VL. Clinically relevant differencesin prothrombin time and INR values related to blood samplecollection in plastic vs glass tubes. Am J Clin Pathol2005;124:902-909.

7. Toulon P, Ajzenberg N, Smahi M, Guillin MC. A newplastic collection tube made of polyethylene terephtalate issuitable for monitoring traditional anticoagulant therapy(oral anticoagulant, unfractionated heparin, and lowmolecular weight heparin). Thromb Res 2007;119:135-143.

8. Kratz A, Stanganelli N, Van Cott EM. A comparison ofglass and plastic blood collection tubes for routine andspecialized coagulation assays: A comprehensive study.Arch Pathol Lab Med 2006;130:39-44.

9. Flanders M, Crist R, Rodgers G. A comparison of bloodcollection in glass versus plastic vacutainers on results ofesoteric coagulation assays. Lab Med 2003;34:732-735.

10. Narayanan S, Lin FC. Sampling technique. In: Wong SHY,ed. Therapeutic drug monitoring and toxicology by liquidchromatography. New York: Marcel Dekker, Inc.; 1985. p.79-88.

11. Gorbet M, Sefron M. Biomaterial-associated thrombosis:roles of coagulation factors, complement platelets andleukocytes. Biomaterials 2004;25:5681-703.

12. Anraku H, Shoji Y. Vacuum Blood Collection Tubes,U.S.Patent No.8,565,334,August 1989.13. Hulon W. “Blood collection tube assembly”, U.S. Patent No.5,297,561, March 1994.

14. Ernst DJ. Plastic collection tubes decrease risk of employeeinjury. MLO Med Lab Obs 2001;33:44-46.

15. Vogler EA, Siedlecki CA. Contact activation of bloodplasma coagulation: a contribution from the hematology atbiomaterial interfaces research group the Pennsylvania StateUniversity. Biomaterials 2009;30:1857-69. http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2008.12.041.

16. Jan Philippe, Erik De Logi, et al.Comparison of FiveDifferent Citrated Tubes and Their in Vitro Effects onPlatelet Activation. Clinical Chemistry 50, No. 3, 2004:656-658.

17. Soner Yavaş, Selime Ayaz, et al. Influence of BloodCollection Systems on Coagulation Tests. Turk J Hematol2012; 29: 367-375.

18. Kratz A, Stanganelli N, Van Cott EM. A Comparison ofglass and plastic blood coagulation tubes for routine andspecialized coagulation assays: a comprehensive study. ArchPathol Lab Med. 2006;130:38-44.

19. Anton M.H.P. van den Besselaar, Martha M.C.L. Hoekstraet al. Influence of blood collection systems on theprothrombin time and international sensitivity indexdetermined with human and rabbit thromboplastin reagents.Am J Clin Pathol 2007;127:724-729.

20. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) H21-A4:Collection, Transport, and Processing of Blood Specimensfor Testing Plasma - Based Coagulation Assays; ApprovedGuideline - Fourth Edition.

21. Adcock, Dorothy M, Kressin, et al. Effect of 3.2% vs 3.8%Sodium Citrate Concentration on Routine CoagulationTesting. Am J Clin Pathol. 1997; 107:105-110.

22. Franz Ratzinger，Mona Lang et al. The Effect of 3.2% and3.8% Sodium Citrate on Specialized Coagulation Tests.Arch Pathol Lab Med. 2018;142:992-997.

23. CLSI. Collection of Diagnostic Venous Blood Specimens.7th ed. Standard GP41. Wayne, PA: Clinical and LaboratoryStandards Institute; 2017.

24. BovillEG,TerrinML,StumpDC,etal. Hemorrhagic eventsduring therapy with recombinant tissue-type plasminogenactivator, heparin, and aspirin for acute myocardialinfarction. Results of the Thrombolysis in MyocardialInfarction (TIMI), Phase II Trial. Ann Intern Med 1991;115(04) :256-265

25. Kadani M,B N VS S, B M, , etal. Evaluation of plasmafibrinogen degradation products and total serum proteinconcentration in oral submucous fibrosis. J Clin Diagn Res2014; 8 (05): ZC54-ZC57

26. Chapman SN, Mehndiratta P, et al. Current perspectives onthe use of intravenous recombinant tissue plasminogenactivator (tPA) for treatment of acute ischemic stroke. VascHealth Risk Manag 2014; 10:75-87

27. Vogler EA. “Blood collection assembly includingmechanical phase separating insert”, U.S. Patent No.5,533,518, July 1996.

28. Dubrowny NE, Harrop AJ. “Collection device”, U.S. PatentNo. 6,686,204, February 2004.

29. Strekerud FG, Abildgaard U. Activated partialthromboplastin time in heparinized plasma:influence ofreagent ,acute2phase reaction and interval between samplingand testing. Clin Appl Thromb Hemostasis, 1996, 2:169-176.

30. Joist J , Eyers T. Laboratory Monitoring of heparin Therapy.Thrombosis Forum ,1995 ,1 (2) :2.

31. Triplett DA ,Brandt J T. Laboratory Monitoring of HeparinTherapy. Hemoliance Times ,1997 ,2 (2) :1

32. Hirsh J, Dalen J E, et al. Heparin: mechanism of sclion,pharmacokinetics, dosing considerations, monitoring ,efficacy , and safety. Chest ,1995 ,108 (Suppl 4) :258S-275S.

33. Rosborough TK. Comparison of Anti2factor Xa heparinActivity and Activated Partial Thromboplatin Time in 2773Plasma Samples from Unfractionated Heparin -treatedpatients . Am J Clin Pathol , 1997 ,108∶662-668.

34. Brill2Edwards P , Ginsberg J S , Johnston M , et al .Establishing a therapeutic range for heparin therapy. AnnIntern Med ,1993 , 119 (2) :104-109.

35. Sandrick K. Partial drawback: iffy APTTs lead to tube’sexist. CAP today, 2000, 14 (6) :1 ,49-50 ,56 ,58.

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