针灸作为一种传统的中医疗法，已有超过4000年的实践历史，自1958年起被广泛应用于疼痛管理。然而，关于针刺穴位产生镇痛效应的作用机制、何种物质接收来自穴位的原始机械针刺信号，以及这些信号如何转化为有效的生物信号等问题尚未明确。本研究探讨了大鼠穴位处胶原纤维在针刺镇痛中的作用。当足三里穴位的胶原纤维结构通过注射I型胶原酶被破坏后，针刺所产生的针感力减弱，旋转或提插手法带来的镇痛效果也随之下降，同时肥大细胞脱颗粒比率受到抑制。研究人员认为，胶原纤维在针刺诱导的镇痛中扮演重要角色，并参与信号传递与转化过程。

一、介绍

针灸镇痛因其在缓解慢性疼痛方面经过验证的益处，已被全球广泛推荐作为替代和补充疗法。刺激局部穴位可产生系统性、持续性的镇痛效应，这一神奇现象激发了研究人员探索其机制的兴趣。然而，该现象背后的科学原理尚未明确，这已成为针灸及经络研究领域亟待解决的核心问题。

大量解剖学及临床核磁共振成像研究表明，穴位和经络底层结构与结缔组织密切相关，其中包括肥大细胞、胶原纤维、血管、神经丛、淋巴管等组成要素。刺激穴位时会引发"得气"感，表现为刺痛、麻木、沉重等感觉。有研究团队提出，通过提插旋转手法对穴位施加机械刺激时，局部结缔组织形变可能促使细胞级信号沿结缔组织平面传导，从而产生机械、生化或生物电效应，这可能是解释针刺 sensations 和镇痛作用的机制。

进一步研究发现，局部肥大细胞可能与上述效应相关，因其在穴位的分布密度显著高于非穴位区域。通过穴位刺激，肥大细胞会发生脱颗粒并释放生物活性介质，这些介质可能在体液调节系统中发挥作用。既然肥大细胞被认定在针刺镇痛中起重要作用，那么何种结构负责将机械信号传递给肥大细胞并触发其功能？通过扫描电镜和透射电镜的微观结构观察发现，从穴位取出的针具上残留物主要成分为胶原纤维。因此我们推测，胶原纤维可能是经络的重要物质基础之一，承担着信息和能量传递的功能。

本研究通过建立关节炎急性模型大鼠，以热痛刺激引发的缩足潜伏期作为痛阈指标，选取常用镇痛穴位足三里进行实验。采用I型胶原酶破坏穴位局部胶原纤维结构，对比针刺操作下胶原纤维对镇痛效果的影响。通过临床监测系统实时记录操作过程中的针机械力，显微镜下观察穴位处胶原纤维和肥大细胞的形态变化，并比较针刺前后肥大细胞脱颗粒比率的变化。

二、材料与方法

01.实验动物

采用76只实验用斯普拉格-达利大鼠（体重200±20克），由动物中心提供。所有动物均表现出正常缩足潜伏期值（8-11秒）。

02.试剂

使用完全弗氏佐剂诱导炎症症状，采用I型胶原酶破坏胶原纤维结构。

03.仪器

IITC 336GT型足尾刺激镇痛仪购自IITC公司，穴位神经刺激仪购自电子技术公司。

04.环境适应与分组

大鼠在恒温23±1℃、14/10小时光暗循环条件下笼养，自由获取食物饮水。所有动物均受到人道对待以防止感染并减少应激。76只大鼠中，4只用于针刺操作过程中的针力观测，其余随机分为9组（每组8只）：正常组（N）、关节炎模型对照组（M）、足三里胶原酶注射组（C）、旋转手法针刺组（R）、提插手法针刺组（L）、胶原酶预处理后旋转针刺组（CR）、胶原酶预处理后提插针刺组（CL）、胶原酶预处理犊鼻穴后提插针刺组（CDL）以及胶原酶预处理后电针组（CE）。

所有针刺组均统一采用足三里作为镇痛穴位。除4只针力观测大鼠外，其余动物在实验前均经历1周环境适应过程，每日相同时段置于缩足潜伏期测试仪中。除N组外，所有组别在第1日痛阈测定后建立关节炎模型，第2-3日进行环境适应。第4日除M组仅测定1次痛阈外，其他组均在处理前后各测定1次。C、CR、CL及CE组在足三里进行I型胶原酶预处理，CDL组在犊鼻穴预处理。随后R与CR组施以旋转手法，L、CL与CDL组施以提插手法，CE组采用电针刺激。为排除时间干扰因素，C组在注射后休息30分钟基础上额外休息20分钟，R与L组在操作前休息30分钟。所有大鼠在末次痛阈测定后处死并制备标本。各组实验流程见表1。

针对4只针力观测大鼠，采用研究人员开发的临床监测系统量化针刺刺激。该系统通过检测针采集针刺信号，经输入接口传输处理后，通过输出接口将数据传送至个人计算机（图1）。操作时固定检测针尾部，在足三里施以旋转或提插手法，计算机屏幕同步显示针刺过程中的两种力学参数（以针刺强度和频率为量化指标）。其中2只大鼠分别施以旋转和提插手法，另外2只在相同操作前30分钟接受胶原酶预处理。由于旋转手法中的提插力与提插手法中的旋转力均十分微弱，本研究分别分析两种旋转手法产生的旋转力数据与两种提插手法产生的提插力数据，每组数据均连续采集15秒。

图1 针力检测实验装置示意图. 采用自主研制的临床监测系统检测与量化足三里针刺过程中的动态针力。系统通过检测针采集机械信号，将处理后的数据输出至计算机，实时显示提插力与旋转力的同步监测结果。

所有实验于每日下午1点开始，操作过程均符合实验室动物护理与使用规范。

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05.关节炎模型与盲法缩足潜伏期测试方法

实验首日建立关节炎模型。先对大鼠进行麻醉，随后向左胫跗关节注射0.05毫升完全弗氏佐剂（1毫克/毫升），此过程称为造模。该模型被认为是研究抗痛觉过敏的理想动物模型，其炎症症状在24小时内出现，72小时后趋于稳定，且注射后可持续至少6周。

采用IITC 336GT型足尾刺激镇痛仪产生伤害性热刺激，以缩足潜伏期作为痛阈衡量指标。仪器设置15秒自动截断以防止组织损伤。测试前将自由活动的清醒大鼠置于仪器塑料箱中适应20分钟，随后用强光束产生的辐射热照射踝关节直至大鼠缩腿，此时间间隔记为缩足潜伏期。每只动物测试两次，间隔10分钟，取平均值作为基础痛阈。该过程包含20分钟适应期，统称为痛阈测定。基础值高于11秒或低于8秒的动物被排除实验。为控制潜在偏差，缩足潜伏期测试由不知晓分组情况的研究人员执行。

06.足三里针刺操作

因足三里是动物实验和临床治疗中常用的镇痛穴位，本实验所有针刺组均选择该穴位。采用灭菌不锈钢针灸针（0.25×25毫米）向左后肢足三里（胫骨前结节外侧5毫米处）插入7毫米深度。旋转手法：以每秒2-3转、90-180度范围捻针，操作20分钟，每分钟前30秒行针后30秒停针。提插手法：在2毫米范围内垂直皮肤提插，深度、频率及时间与旋转手法一致。

07.电针刺激

采用穴位神经刺激仪连接两枚针灸针，一针刺入足三里7毫米深度，另一针刺入昆仑穴（外踝尖与跟腱连线中点凹陷处）2毫米深度。参数设为疏密波（2-100赫兹），强度依次为0.5、1.0、1.5毫安，各维持7分钟。

针刺过程中，清醒动物被安置于塑料固定器内，后肢外露。为便于组织学定位，针具预先用龙胆紫标记。

08.穴位药物预处理

疏松结缔组织中的胶原纤维主要为I型，集中于皮下组织与肌肉间。选用I型胶原酶破坏穴位胶原纤维结构，该酶可作用于I、II、III型胶原纤维。足三里注射20微升（5毫克/毫升）I型胶原酶，犊鼻穴（髌骨下缘外侧凹陷处）因无肌肉层减半剂量。注射后等待30分钟确保胶原纤维充分分解。

09.标本制备与组织学观察

痛阈测定后立即麻醉处死大鼠，取左后肢以足三里为中心的5立方毫米组织块，4%福尔马林固定48小时后制成连续石蜡切片（5微米厚）。选取针迹附近无破损的8张连续切片，4张用于甲苯胺蓝染色，4张用于马洛里染色。400倍显微镜下观察皮肤与肌肉切片中胶原纤维和肥大细胞的形态。以细胞膜不完整且周围出现颗粒的肥大细胞记为脱颗粒细胞。每只动物取4张连续甲苯胺蓝染色切片的皮肤部位进行盲法脱颗粒计数并取平均值。组间脱颗粒率以均值±标准差百分比表示。

10.数据分析

比较缩足潜伏期变化值，计算变化率为（第4日处理后值/处理前值-1）×100%。组内差异以均值±标准差表示，同时观察胶原纤维与肥大细胞形态变化。采用t检验评估组内处理前后痛阈差异，多组间痛阈变化率及肥大细胞脱颗粒率比较采用单因素方差分析及LSD或Dunnett's T3事后检验。对R、L、CR、CL组采用2×2析因方差分析，评估操作方法（旋转/提插）和药物（胶原酶注射/未注射）的主效应差异。p值<0.05视为具有统计学意义。

三、结果

01.针刺针力变化

通过临床监测系统记录实时针刺力学数据。结果显示：正常大鼠左后肢足三里行提插手法时平均针力幅度约为200毫牛（图2虚线），经I型胶原酶预处理后降至10毫牛（图2实线）；旋转手法平均扭矩从正常状态的30毫牛·毫米（图3虚线）降至10毫牛·毫米（图3实线）。表明胶原纤维在提插旋转过程中缠绕针体形成机械耦合，增强针体握持力。

图2 大鼠足三里提插手法时针体提插力变化 （通过自主研制的临床监测系统记录） 实线：经I型胶原酶预处理大鼠的提插力变化； 虚线：未预处理大鼠的提插力变化

图3 大鼠足三里旋转手法时针体旋转力变化 （通过自主研制的临床监测系统记录） 实线：经I型胶原酶预处理大鼠的旋转力变化 ；虚线：未预处理大鼠的旋转力变化

02.手法针刺对痛阈的影响

旋转与提插作为典型手法针刺操作均表现出显著镇痛效应。由表2可知，R组（旋转）与L组（提插）处理后缩足潜伏期较处理前显著延长（ p < 0.05），但两组间无统计学差异。

表2 针刺对痛阈的影响

03.I型胶原酶注射对痛阈的影响

胶原酶注射组（C组）处理前后痛阈无显著变化（p > 0.1），表明注射操作本身影响微弱。电针组（CE组）在胶原酶预处理后仍产生47.59%的痛阈提升（ p < 0.05），且显著高于CL、CR组（ p < 0.05），说明胶原酶未破坏其他细胞参与镇痛的功能。

04.胶原纤维破坏后手法针刺的镇痛效应

CL组与CR组的痛阈变化率（分别为3.83%和3.24%）较L组与R组显著降低（*p < 0.05, **p < 0.05）。2×2析因方差分析显示胶原酶注射主效应显著（◦ p < 0.05），而手法类型及交互作用无显著差异。CDL组（犊鼻穴胶原酶预处理后足三里行提插手法）痛阈提升45.97%（ p < 0.05），且与CL组存在显著差异（xx p < 0.05），表明远离针刺穴位的上游经络胶原纤维破坏不影响镇痛效果。

05.穴位胶原纤维与肥大细胞形态学观察

马洛里染色显示：正常组胶原纤维呈深蓝色平行束状排列（图4a1-4a2）；胶原酶预处理后纤维结构模糊、排列紊乱（图4b1-4b2）；提插操作后纤维表面粗糙（图4c1-4c2）；旋转操作后部分纤维扭曲挛缩（图4d1-4d2）。

图4 足三里部位皮肤与肌肉组织中染色的胶原纤维.

a1与a2为正常组标本：a1显示皮肤层面，a2显示肌肉层面

b1与b2为胶原酶注射组标本：b1显示皮肤层面，b2显示肌肉层面

c1与c2为提插手法组标本：c1显示皮肤层面，c2显示肌肉层面

d1与d2为旋转手法组标本：d1显示皮肤层面，d2显示肌肉层面 （马洛里染色，放大400倍；胶原纤维呈蓝色（→指示），肌肉与红细胞呈红色）

甲苯胺蓝染色显示：N组（图5a）与M组（图5b）肥大细胞形态完整；C组（图5c）、CR组（图5f）与CL组（图5g）可见少量脱颗粒；R组（图5d）与L组（图5e）出现显著脱颗粒现象。手法操作显著提高局部肥大细胞脱颗粒率（表3，R、L组 vs M组：* p < 0.05），而胶原纤维破坏后脱颗粒率显著降低（表3，R vs CR组： p < 0.05；L vs CL组：♦ p < 0.05）。

表3 足三里部位皮肤肥大细胞脱颗粒率

图5 足三里部位皮肤组织中的肥大细胞（箭头指示） （a）正常组标本 （b）模型组标本 （c）胶原酶注射组标本 （d）旋转手法组标本 （e）提插手法组标本 （f）胶原酶预处理+旋转组标本 （g）胶原酶预处理+提插组标本 （甲苯胺蓝染色，放大400倍；肥大细胞呈紫蓝色）

四、讨论

本研究首次在关节炎模型上揭示了胶原纤维在针刺镇痛中的作用机制。通过痛阈测试发现，提插与旋转手法对关节炎大鼠均产生显著镇痛效果（表2中L组与R组），但当足三里胶原纤维结构被破坏后，手法针刺的镇痛效应明显减弱（表2中CL与CR组），而电针镇痛效果未受影响（表2中CE组）。组织切片显示：正常胶原纤维呈定向束状卷曲排列（图4a1-4a2），肥大细胞膜完整光滑（图5a）；针刺后胶原纤维形态改变——旋转手法致部分纤维断裂（图4d1-4d2），提插手法使纤维表面粗糙（图4c1-4c2），同时伴随肥大细胞显著脱颗粒（图5d-5e），脱颗粒率较模型组显著升高（表3中R、L组）。

经I型胶原酶预处理后，胶原纤维结构紊乱、染色变淡（图4b1-4b2），但肥大细胞形态保持完整（图5c），此时手法针刺的镇痛效果与模型组或胶原酶对照组无显著差异（表3中CR、CL组）。力学数据分析显示胶原酶预处理后针刺针力显著下降（图2、3）。以上结果表明：胶原纤维通过接收机械针刺信号参与镇痛过程，而肥大细胞脱颗粒是镇痛效应产生的重要环节。

我们观察到密集的胶原纤维网络分布于真皮致密结缔组织与皮下疏松结缔组织中，后者延伸至肌肉组织形成肌间膜（图4a2）。针刺时针体可有效刺激这两层的胶原纤维。提插手法产生的"得气"感强于旋转手法，可能与胶原纤维的力学特性相关：胶原纤维在机械应力下可拉伸至原长度的110–115%，旋转手法可能导致塑性变形或断裂从而减弱针体握持力，而提插手法在垂直方向运动未超出纤维应力范围，故能保持更强得气感。

胶原酶预处理后，胶原纤维无法有效传递机械信号，导致针感减弱及镇痛效果下降。值得注意的是，胶原纤维形态保持完整时肥大细胞脱颗粒率高，而纤维结构破坏后脱颗粒率显著降低，说明机械应力传递与肥大细胞活化存在密切关联。

既往研究证实，真皮致密结缔组织与皮下疏松结缔组织形成三维胶原纤维网络，连接体表与内脏器官。针刺镇痛过程中，针体刺激肌肉膜与真皮结缔组织层，引起胶原纤维形变并诱导肥大细胞脱颗粒（图6b-6c）。一方面，颗粒内物质激活神经受体形成上行镇痛信号；另一方面，这些物质通过组织液扩散可能改变基质状态，产生循经感传现象。当胶原纤维结构破坏后，针刺无法形成有效机械耦合，肥大细胞脱颗粒受阻（图6d），细胞级信号传导中断，从而导致镇痛效应减弱。

图6 穴位胶原纤维与肥大细胞示意图 （a）正常状态下结缔组织层面的胶原纤维与肥大细胞分布 （b）旋转手法操作时的胶原纤维与肥大细胞状态 （c）提插手法操作时的胶原纤维与肥大细胞状态 （d）胶原纤维破坏后行提插或旋转手法时的结构状态

本实验室前期研究发现，通过色甘酸钠抑制肥大细胞脱颗粒可显著降低针刺镇痛效果，证实肥大细胞脱颗粒是产生镇痛效应的重要环节。该过程可能通过两种途径实现：一是组胺等颗粒物质沿经络通过组织液流动诱导下游肥大细胞脱颗粒（肥大细胞分化依赖成纤维细胞，且密集环绕胶原纤维分布，有利于组胺沿经络传输）；二是活性物质刺激神经末梢引发轴突反射，促使P物质释放进而诱导肥大细胞脱颗粒，颗粒物质再刺激神经分支形成级联反应。针刺产生的神经信号在不同阶段被整合调控，最终实现镇痛效应或调节靶器官功能。

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