文章来源：中华内分泌代谢杂志, 2021,37(3) : 228-234

作者：贺明娟 梅稳 侯亚莉 林梅

材料和方法

一、材料

30只4周龄SPF级雄性C57BL/6J野生型小鼠，体重18～20 g，连同高脂饲料均购自北京华阜康生物科技股份有限公司。艾塞那肽购自美国Eli Lilly公司；链脲佐菌素(streptozocin, STZ)购于美国Sigma公司。其他材料和试剂包括One Touch Ultra血糖仪及试纸(强生公司，美国)；小动物无创血压仪(Softron BP98A)；原位细胞凋亡检测试剂盒(Roche公司，瑞士)；磁珠、磁力收集器(Invitrogen公司，美国)；胶原酶A(Roche公司)；一抗：兔抗小鼠裂孔膜肾病蛋白(Nephrin)抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；Wilms瘤基因1(Wilms′ tumor gene 1, WT1)蛋白抗体(Santa Cruz公司，美国)；兔抗小鼠活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 (Cleaved caspase-3)、蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)和磷酸化Akt(p-Akt；CST公司，美国)；二抗：山羊抗兔IgG抗体(辣根过氧化物酶标记；CST公司，美国)；小鼠β-肌动蛋白(β-actin)抗体(武汉博士德生物工程有限公司)。

二、方法

1．造模及分组：

小鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法分为正常对照鼠10只和实验鼠20只，分别给予普通饲料(脂肪11%，碳水化合物68%，蛋白质21%)和高脂饲料(脂肪41%，碳水化合物42%，蛋白质17%)喂养。喂养4周后，实验鼠和正常对照鼠每天腹腔注射STZ(50 mg/kg)或柠檬酸缓冲液，连续5 d。2周后，剪尾测定小鼠随机血糖，连续2 d随机血糖≥13.9 mmol/L视为糖尿病模型建立成功^[7]。实验鼠中18只小鼠糖尿病模型造模成功。为进一步诱导糖尿病肾病模型形成，糖尿病肾病鼠继续高脂饲料喂养8周，而正常对照鼠继续普通饲料喂养^[8]。造模成功后，取16只糖尿病肾病小鼠按照随机数字表法分为艾塞那肽干预糖尿病肾病组(DN＋Ex组， n＝8)和糖尿病肾病对照组(DN组， n＝8)，每天分别腹腔注射艾塞那肽(24 nmol·kg^-1·d^-1)和等剂量的柠檬酸盐缓冲液，持续8周^[9]。从10只正常对照鼠中，按随机数字表法选取8只为正常对照组(NC组， n＝8)，每天腹腔注射等剂量的柠檬酸盐缓冲液，持续同样时间。

2．生理生化指标检测及标本采集：

每周定期测定各组小鼠体重、摄食量及空腹血糖(禁食6 h)。采用Softron BP98A测定未经麻醉的、安静状态的小鼠血压和心率。代谢笼收集小鼠24 h尿液，酶联免疫吸附(ELISA)法检测尿蛋白/肌酐比值。实验结束后，使用戊巴比妥钠麻醉，开腹腔，下腔静脉采血。全自动生化仪检测血清肌酐及尿素氮水平。ELISA法检测血清胰岛素、HbA_1C、三酰甘油、总胆固醇、游离脂肪酸水平。剥离完整肾脏，双侧肾脏称重，计算肾脏指数[肾脏指数＝双侧肾脏重量(g)/体重(g)×100%]。

3．肾脏形态学观察：

(1)过碘酸希夫染色(pexiodic acid-Schiff stain, PAS)染色，4%多聚甲醛溶液固定肾脏，常规石蜡包埋切片，行PAS染色，普通光镜下观察肾小球。(2)免疫荧光染色，肾脏经包埋、切片脱蜡、抗原修复、血清封闭后，先后加入稀释好的一抗(兔抗鼠Nephrin多克隆抗体1∶50)和荧光标记二抗[山羊抗兔四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)1∶100]，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核。参照文献使用WT1抗体(1∶50)和原位细胞凋亡检测试剂盒进行WT1和原位缺口末端标记法(TUNEL)荧光双染色^[10]。在荧光显微镜下观察。(3)透射电子显微镜：取1 mm³大小肾皮质保存于2.5%戊二醛液中固定24 h，然后放入1%的四氧化锇中固定1.5 h。通过梯度乙醇和丙酮脱水并包埋，切片后安装在铜网上(200目)，透射电子显微镜成像并观察。

4．肾小球组织的分离：

小鼠麻醉后，经腹主动脉灌注冰磷酸盐缓冲液(PBS)除去肾内血液，然后将8 mL磁珠溶液以及2 mL含混合胰酶消化液的磁珠液注射进腹主动脉中。摘除肾脏，将其剪成1 mm³小块，胶原酶A消化(水浴37℃消化30 min)。筛网过滤分离肾小管，磁力收集器收集含磁珠的肾小球组织，用于后续实时定量PCR和Western印迹。

5．实时定量PCR：

用Trizol提取肾小球组织中总RNA，反转录成cDNA，实时定量PCR测定肾小球组织中促纤维化分子[Ⅳ型胶原蛋白(Collagen Ⅳ)、转化生长因子-β(TGF-β)和纤维连接蛋白(Fibronectin)]表达水平。TGF-β上游引物为5′-AGGGCTACCATGC-CAACTTC-3′，下游引物为5′-CCACGTAGTAGACGAT-GGGC-3′；Collagen Ⅳ上游引物为5′-AACAACGTCT-GCAACTTCGC-3′，下游引物为5′-CTTCACAAACCGC-ACACCTG-3′；Fibronectin上游引物为5′-CCCCAACT-GGTTACCCTTCC-3′，下游引物为5′-TGTCCGCCTA-AAGCATGTT-3′。以β-actin作为内参，2^-ΔΔCt法分析各基因相对表达量。实时定量PCR条件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，循环40次。

6．Western印迹：

裂解液提取细胞总蛋白，经二喹啉甲酸法进行蛋白定量后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白样品进行分离，并将凝胶上的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脱脂牛奶封闭2 h，依次加入相应特异性一抗Nephrin(1∶1 000)、Cleaved caspase-3(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)、β-actin(1∶200)和辣根过氧化物酶标记的二抗(稀释比例为1∶50 000)处理。使用发光试剂进行显色，通过BandScan分析胶片灰度值。

三、统计学处理

SPSS 22.0用于统计分析。计量资料以Mean±SD表示。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间多重比较采用最小显著差异t(LSD-t)检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、各组小鼠生理生化指标的比较

干预治疗8周后，3组小鼠的血压、心率水平无显著差异(P>0.05)。与NC组小鼠相比，DN组和DN＋Ex组小鼠的空腹血糖和HbA_1C水平均明显升高，血清胰岛素水平明显下降，血清总胆固醇、游离脂肪酸、三酰甘油水平明显升高(P<0.01)，符合2型糖尿病小鼠高血糖、高血脂的特征。艾塞那肽干预后，与DN组小鼠相比，DN＋Ex组小鼠的空腹血糖和HbA_1C水平显著下降，血清胰岛素水平增加，血清总胆固醇、游离脂肪酸、三酰甘油水平显著下降(均P<0.01，表1)。

二、各组小鼠肾脏指数、血肌酐、尿素氮及尿蛋白/肌酐比值水平比较

与NC组小鼠相比，DN组和DN＋Ex组小鼠的肾脏指数显著升高；艾塞那肽干预后，DN＋Ex组小鼠的肾脏指数较DN组明显下降(均P<0.01)。而3组小鼠间的血肌酐和尿素氮水平差异无统计学意义(P>0.05)。与NC组小鼠相比，DN组和DN＋Ex组小鼠的尿蛋白/肌酐比值显著增加(P<0.01)，出现蛋白尿，提示进展为糖尿病肾病。艾塞那肽干预后，DN＋Ex组小鼠的尿蛋白/肌酐比值较DN组小鼠明显下降(P<0.01，表1)。

三、艾塞那肽对糖尿病肾病小鼠肾小球的影响

PAS染色及定量分析显示，与NC组小鼠相比，DN组和DN＋Ex组小鼠的系膜基质指数增加，肾小球体积增大(P<0.05或P<0.01)；艾塞那肽干预后，DN＋Ex组的系膜基质指数较DN组小鼠显著下降，肾小球体积显著减小(P<0.05或P<0.01，图1A，图1B)。

图1  各组小鼠肾小球组织PAS染色以及Collagen Ⅳ、TGF-β和Fibronectin mRNA相对表达水平

Fig 1  PAS staining and the relative expression of Collagen Ⅳ，TGF-β，and Fibronectin mRNA in glomerular lysates among different groups

实时定量PCR检测结果显示，与NC组小鼠相比，DN组和DN＋Ex组小鼠的肾小球组织中促纤维化分子Collagen Ⅳ、TGF-β和Fibronectin mRNA表达均显著升高(P<0.01)；艾塞那肽干预后，DN＋Ex组小鼠肾小球组织中Collagen Ⅳ、TGF-β和Fibronectin mRNA表达均较DN组明显下降(P<0.01，图1C)。

四、艾塞那肽对糖尿病肾病小鼠足细胞的影响

免疫荧光染色显示，相比NC组，DN组和DN＋Ex组小鼠足细胞中裂孔膜蛋白Nephrin表达下调；艾塞那肽干预后，DN＋Ex组足细胞中Nephrin蛋白表达较DN组明显上调(图2)。Western印迹结果显示，与NC组小鼠相比，DN组和DN＋Ex组小鼠的肾小球组织中裂孔膜蛋白Nephrin表达均显著下降(P<0.01)；艾塞那肽干预后，DN＋Ex组小鼠肾小球组织中Nephrin表达较DN组明显升高(P<0.01，图3)。

图2  各组小鼠足细胞病理学的改变(免疫荧光染色图)

Fig 2  Pathological changes of podocytes among different groups (Immunofluorescent staining images)

图3  Western印迹检测各组小鼠肾小球组织中Nephrin、Cleaved caspase-3、Akt和p-Akt蛋白表达水平

Fig 3  Western blotting and quantification analyses of Nephrin, Cleaved caspase-3, Akt, and p-Akt protein expressions in glomerular lysates among different groups

扫描电镜显示，在DN组和DN＋Ex组小鼠均出现了足细胞足突的融合、足突数量的减少及肾小球基底膜的增厚。但与DN组相比，DN＋Ex组小鼠足细胞足突的融合、足突数量的减少及肾小球基底膜的增厚情况有所改善(图2)。

WT1和TUNEL免疫荧光共染色进一步显示，相比NC组，DN组和DN＋Ex组小鼠肾小球中足细胞凋亡明显增加；艾塞那肽干预后，DN＋Ex组比DN组足细胞凋亡显著减少(图2)。Western印迹结果显示，与NC组小鼠相比，DN组和DN＋Ex组小鼠的肾小球组织中凋亡蛋白Cleaved caspase-3表达均显著增高(P<0.05或P<0.01)；艾塞那肽干预后，DN＋Ex组比DN组小鼠肾小球组织中凋亡蛋白Cleaved caspase-3表达明显下降(P<0.01，图3)。

五、艾塞那肽对糖尿病肾病小鼠肾小球组织中Akt、p-Akt蛋白表达的影响

Western印迹结果显示，DN组小鼠肾小球组织中p-Akt/Akt表达水平明显下调，明显低于NC组(P<0.01)。艾塞那肽干预后，小鼠肾小球内p-Akt/Akt表达水平明显上调(P<0.01，图3)。

讨论

近年来，越来越多的临床研究显示，GLP-1受体激动剂能够改善糖尿病患者的肾脏指标，且这一作用可能独立于该药物的降糖效应。糖尿病患者每周注射度拉糖肽的评价7(AWARD-7)试验纳入了577例慢性肾脏病(CKD)3～4期的2型糖尿病患者，随机分为度拉糖肽1.5 mg/周组、度拉糖肽0.75 mg/周组和甘精胰岛素组。随访52周后，与甘精胰岛素组比较，度拉糖肽0.75 mg/周组和度拉糖肽1.5 mg/周组能够在降糖效果类似的基础上延缓患者估算的肾小球滤过率(eGFR)下降^[11]。但目前GLP-1受体激动剂对肾脏的保护作用机制尚未完全明确^[12]。GLP-1受体表达于胰腺的β细胞、肾脏、肺、心脏、胃肠道、脑等部位^[13]。有研究发现，GLP-1受体表达于肾小球毛细血管壁，但因受体检测技术限制，GLP-1受体在肾脏表达仍然存在不确定性^[14]。Ishibashi等^[15]的研究表明，GLP-1作用于肾脏系膜细胞的GLP-1受体，减少活性氧生成，降低单核细胞趋化蛋白1基因和蛋白表达，起到抗炎症、抗氧化作用。本研究组前期体外研究发现，GLP-1通过上调足细胞Nephrin蛋白表达和减少足细胞凋亡可改善高糖诱导的足细胞损伤^[16]。而目前，GLP-1对足细胞的作用在糖尿病肾病动物实验中尚未见报道。

本研究发现，在STZ/高脂饮食诱导下，糖尿病肾病小鼠出现蛋白尿和肾小球损伤。其中，肾小球损伤表现为肾小球肥大、系膜基质增生、基底膜增厚等病理特征改变。而艾塞那肽治疗8周后，降低了糖尿病肾病小鼠的尿蛋白以及肾小球损伤。因此，本研究提示艾塞那肽对糖尿病肾病具有保护作用，而后研究了艾塞那肽对糖尿病肾病小鼠肾小球中足细胞损伤的影响。免疫荧光染色和Western印迹检测显示，在STZ/高脂饮食诱导下，糖尿病肾病小鼠肾小球中Nephrin表达下降，而艾塞那肽治疗能够显著上调糖尿病肾病小鼠中Nephrin的表达。电镜结果也显示，糖尿病肾病小鼠的肾小球中足突融合和足突数量减少，而艾塞那肽治疗能够显著改善足细胞足突融合和足突数量的减少。这些结果均提示，艾塞那肽治疗可改善糖尿病肾病小鼠足细胞的损伤。再者，本研究进一步探索了艾塞那肽对糖尿病肾病小鼠足细胞凋亡的影响。WT1和TUNEL免疫荧光共染色显示，糖尿病肾病小鼠肾小球中足细胞凋亡增加；Western印迹检测显示，糖尿病肾病小鼠的肾小球中Cleaved caspase-3表达增加。而艾塞那肽干预治疗能够显著减少足细胞凋亡，下调Cleaved caspase-3表达，提示艾塞那肽治疗改善了糖尿病肾病小鼠足细胞凋亡。

在糖尿病肾病中，p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)信号通道、Nocth信号通道、Smad信号通道等促凋亡通道的激活可诱导足细胞的凋亡^[2]。正常情况下，体内同时存在促凋亡和抗凋亡信号，两者维持动态平衡以保证机体内环境稳定。除了促凋信号增强外，足细胞抗凋亡信号减弱也是足细胞凋亡的重要原因。而磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/Akt通路是足细胞中重要的抗凋亡信号通路之一^[2]。体内研究报道，在合并糖尿病肾病的db/db小鼠中，足细胞的Akt蛋白磷酸化受抑制，导致了足细胞凋亡^[17]。体外研究报道，在高糖诱导的足细胞中，Akt蛋白磷酸化活性下降，抑制了下游的B淋巴细胞瘤(B-cell lymphoma, Bcl)-xL/Bcl-2相关死亡启动子(Bad)蛋白的Ser136磷酸化，进一步促进了足细胞凋亡^[18]。体内和体外实验均提示PI3K/Akt信号通路减弱可诱导糖尿病肾病中足细胞的凋亡。目前发现，GLP-1可以通过激活PI3K/Akt、环磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/protein kinase A, cAMP/PKA)、MAPK、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)等通路发挥刺激细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用^[19]。因此，推测GLP-1可能通过激活PI3K/Akt通道抑制足细胞凋亡。在本研究中，糖尿病肾病小鼠肾小球组织中p-Akt蛋白表达显著下降，而艾塞那肽干预治疗可明显增加p-Akt蛋白的表达，提示艾塞那肽可能通过激活PI3K/Akt信号通路改善了糖尿病肾病小鼠足细胞的损伤及凋亡。

本研究还发现，艾塞那肽治疗显著改善了糖尿病肾病小鼠的高血糖和高血脂状态。而糖脂代谢的恢复也有助于改善糖尿病肾病小鼠的蛋白尿、肾小球以及足细胞损伤。

值得注意的是，高糖诱导足细胞凋亡的作用机制还与促进p53途径、MAPK途径等有关^[20,21]。因此，艾塞那肽对足细胞的保护作用机制还有待进一步探索。另外，本研究是对小鼠足细胞进行的体内实验，实验分离的肾小球组织中除了足细胞，还有肾小管细胞、系膜细胞、血管内皮细胞等其他细胞。因此，艾塞那肽对糖尿病肾病小鼠的足细胞保护作用是否还有其他细胞共同参与，以及艾塞那肽是否直接激活了足细胞中的PI3K/Akt信号通路还有待体外实验进一步证实。

综上，本研究发现艾塞那肽能够上调足细胞中Nephrin蛋白表达，减少足细胞损伤及凋亡，改善糖尿病肾病小鼠的肾小球损伤，减少蛋白尿，从而延缓糖尿病肾病的进展。这种保护作用可能与激活肾小球中PI3K/Akt信号通路有关。

志谢　武汉市卫生和计划生育委员会科研基金项目(WX18Q01)资助

参考文献 （略）

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