转化生长因子-β（TGF-β）是一组在多类实验模型中具有神经保护作用的多功能蛋白质。研究人员此前报道称，鞘内注射TGF-β1能显著抑制神经病变引起的热痛觉过敏、脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞活化以及肿瘤坏死因子-α的上调。然而，TGF-β1镇痛的附加细胞机制，如丝裂原活化蛋白激酶通路尚未明确。在持续性疼痛过程中，MAPK（尤其是p38和细胞外信号调节激酶）的活化通过非转录和转录调控方式，对疼痛过敏的诱导和维持起关键作用。本研究采用慢性压迫性损伤大鼠模型，探讨脊髓p38和ERK在TGF-β1镇痛作用中的功能。

通过脊髓免疫荧光组织化学分析，研究人员在慢性压迫损伤诱导的神经病理性大鼠模型中研究了鞘内注射TGF-β1镇痛的细胞机制。

结果显示，单次鞘内注射TGF-β1（5纳克）后，其对慢性压迫损伤大鼠的镇痛效果可维持至少6小时，且持续高于最大可能效应的50%。因此，研究人员进一步检测了鞘内注射TGF-β1后0.5至6小时内脊髓p38和ERK的变化。TGF-β1显著抑制了慢性压迫损伤诱导的腰椎脊髓背角磷酸化p38和磷酸化ERK表达的上调。双免疫荧光染色显示，在慢性压迫损伤大鼠中，脊髓磷酸化p38的上调定位于神经元、活化小胶质细胞及活化星形胶质细胞；而磷酸化ERK的增加则出现于活化小胶质细胞和活化星形胶质细胞。此外，鞘内注射TGF-β1显著抑制了神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞中磷酸化p38的上调，同时也能降低小胶质细胞和星形胶质细胞中磷酸化ERK的上调。

本研究结果表明，抑制p38和ERK活性会影响TGF-β1在神经病变期间诱导的镇痛效应。

一、介绍

全球有15亿人遭受疼痛困扰。约20%的普通人群存在慢性疼痛问题，其中神经病理性疼痛的患病率为6.9%。现有药物治疗尚无法完全缓解所有神经病理性疼痛症状。神经病理性疼痛的细胞机制复杂，至今尚未完全阐明。2009年有研究报道，鞘内输注转化生长因子-β1可显著减轻大鼠神经损伤诱导的神经病理性疼痛，这提示需要从两个方向展开研究：一是阐明TGF-β1的镇痛特性及其作用机制；二是探究TGF-β1在化合物药物或细胞疗法镇痛机制中的直接参与。但目前针对TGF-β1镇痛细胞机制的研究仍较为有限。

在神经病变过程中，脊髓神经炎症可能促进中枢敏化，从而推动疼痛的发生与维持。周围神经病变中的脊髓神经炎症主要表现为小胶质细胞和星形胶质细胞的活化，以及促炎介质肿瘤坏死因子-α的上调。小胶质细胞和星形胶质细胞能够合成TNF-α，而该因子正是导致神经病理性疼痛的关键因素。抑制这两种胶质细胞的活化及脊髓TNF-α表达均可产生镇痛效应。p38和细胞外信号调节激酶作为MAPK亚群，其活化会刺激原发性小胶质细胞和星形胶质细胞中TNF-α的基因表达。周围神经损伤和脊髓损伤均会激活脊髓p38和ERK。既往研究表明，抑制p38和ERK活性可能是治疗神经病理性疼痛的潜在策略。

然而，关于p38和ERK在TGF-β1镇痛作用中所扮演的角色，目前在大鼠神经病变模型中的研究数据仍十分有限。本研究通过采用慢性压迫性损伤这一常用神经病理性疼痛模型，考察了鞘内注射TGF-β1对大鼠脊髓p38和ERK活化的影响。研究人员通过分析TGF-β1镇痛效应与p38、ERK活化过程的时间变化规律，进一步探究了这两种激酶在神经病理性疼痛过程中参与TGF-β1镇痛效应形成与维持的作用机制，并在神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞中研究了p38和ERK活化效应的细胞特异性。

二、方法

01.动物实验

采用雄性Wistar大鼠（260-285克），饲养于温控（22±1℃）和光周期控制（12小时光照/12小时黑暗）的实验动物房，自由获取食物和水。本研究遵循美国生理学会《动物护理和使用指南》，所有实验方案均通过机构动物伦理委员会审批。大鼠通过吸入2%异氟烷进行手术和药物注射麻醉，术后肌肉注射兽用头孢唑林（0.17克/千克）预防感染。实验设计和操作均遵循减少动物使用量和减轻动物痛苦的原则。

02.周围神经病变模型建立

采用Bennett和Xie建立并在本团队既往研究中完善的慢性压迫性损伤模型。简要而言，暴露大鼠右坐骨神经中段，分离5毫米神经段，用4号铬制肠线间隔1毫米进行四道松结扎，随后缝合肌肉和皮肤切口。假手术组仅暴露右坐骨神经不予结扎。

03.鞘内导管植入术

参照Yaksh和Rudy的方法及本团队既往研究，通过颅底寰枕膜将PE5导管（长9厘米，内径0.008英寸，外径0.014英寸）植入至脊髓腰膨大处。导管头端固定于大鼠颅部，导管死腔体积为3.5微升。所有鞘内注射后均以10微升人工脑脊液冲洗以确保重组人TGF-β1或溶媒完全输送。人工脑脊液组成成分（单位mM）：氯离子122.7，钠离子151.1，钾离子2.6，钙离子1.3，镁离子0.9，碳酸氢根21.0，磷酸氢根2.5，葡萄糖3.5，并经5%二氧化碳和95%氧气混合气调至pH 7.3。导管植入5天后出现明显神经损伤或脑脊液含新鲜血液者予以排除。采用BBB运动功能量表评估大鼠运动功能。

04.行为学测试

采用Hargreaves法及本团队既往研究方法评估热痛觉过敏。将大鼠置于分隔式塑料观察箱的玻璃平台上，使用IITC痛觉测量仪进行检测。以低强度热辐射（激活强度25）照射足底中部，设定30秒截止时间。通过观察缩足或舔足等疼痛行为记录缩足潜伏期。将数据转化为最大可能效应百分比，计算公式：%MPE = （（给药后潜伏期－基线值）/（截止时间－基线值））×100%。其中给药后潜伏期指鞘内注射TGF-β1或溶媒后测量的缩足潜伏期，基线值为鞘内注射前即刻测量的缩足潜伏期。

05.脊髓免疫荧光组织化学分析

为减少免疫组化过程差异，将多组大鼠腰椎脊髓样本统一包埋于OCT块中，采用-30°C恒冷切片机同步切片。改良Sung等人及本团队既往研究的免疫荧光方法，进行以下染色：

1. 磷酸化p38与胶质细胞标志物双标：脊髓切片（10μm）与兔源抗磷酸化p38单克隆抗体（1:100）及小鼠源抗OX-42（小胶质细胞标志物，1:200）或抗GFAP（星形胶质细胞标志物，1:200）单克隆抗体4°C共孵育过夜，随后与Alexa Fluor 488标记鸡抗小鼠IgG（绿色荧光）及DyLight 549标记驴抗兔IgG（红色荧光）室温共孵育40分钟

2. 磷酸化ERK与胶质细胞标志物双标：切片与兔源抗磷酸化ERK多克隆抗体（1:100）及上述胶质细胞标志物抗体共孵育，二抗处理同前

3. 神经元与磷酸化激酶双标：切片与Alexa Fluor 488标记小鼠抗NeuN神经元核蛋白抗体（1:500）及兔源抗磷酸化p38或ERK抗体（1:100）共孵育过夜，随后与DyLight 549标记驴抗兔IgG室温孵育40分钟

使用荧光显微镜观察染色切片，通过数码相机采集图像，采用Image J软件测量每只大鼠三个切片浅层（I-III板层）免疫反应阳性区域的像素值。免疫荧光数据以假手术+溶媒组为基准（100%）进行百分比转换。

06.数据与统计分析

所有数据以均值±标准误表示。组间差异采用单因素方差分析，进一步使用Student-Newman-Keuls事后检验，显著性设定为P<0.05。

三、结果

01.鞘内注射TGF-β1对慢性压迫损伤诱导的痛觉行为的影响

基于既往研究结果，本研究选择5纳克剂量的TGF-β1。术后14天，鞘内注射溶媒未显著影响慢性压迫损伤大鼠的热痛觉过敏（图1）。与溶媒组相比，TGF-β1的抗痛觉过敏效应在鞘内注射0.5小时后达到最大可能效应百分比峰值，随后随时间逐渐减弱。该效应在给药后至少6小时内持续高于50%最大可能效应。两组大鼠均表现正常行为（包括运动功能）。研究人员随后选取鞘内注射TGF-β1后的三个时间点（0.5小时、3小时和6小时），以探究脊髓磷酸化p38和磷酸化ERK的调控是否参与TGF-β1在神经病理性大鼠中的镇痛作用。

图1.转化生长因子-β1（TGF-β1）在慢性压迫损伤术后14天大鼠中的抗痛觉过敏效应时程变化。横轴表示鞘内注射溶媒或TGF-β1（5纳克）后的时间（小时），纵轴表示抗痛觉过敏的最大可能效应百分比。TGF-β1显著减轻术后14天慢性压迫损伤大鼠的热痛觉过敏。各数据点代表每组六只大鼠的均值±标准误。*与相同时间点的慢性压迫损伤加溶媒组相比P<0.05。

02.鞘内注射TGF-β1对慢性压迫损伤诱导的脊髓磷酸化p38表达上调的影响

假手术联合鞘内注射溶媒组大鼠腰椎脊髓同侧背角仅见微量弥散的磷酸化p38免疫反应（图2a）。

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慢性压迫损伤术后14天，同侧脊髓背角磷酸化p38免疫反应显著增强（图2b）。TGF-β1处理0.5小时后，对慢性压迫损伤诱导的磷酸化p38免疫反应上调未见显著抑制（图2c）。定量分析显示，鞘内注射3小时和6小时后，TGF-β1显著逆转了慢性压迫损伤诱导的同侧腰椎背角磷酸化p38免疫反应上调（图2f）。

图2.鞘内注射转化生长因子-β1（TGF-β1）对慢性压迫损伤术后14天脊髓磷酸化p38表达上调的影响。图示各组脊髓磷酸化p38标记细胞（红色）：假手术联合鞘内注射溶媒组（a）、慢性压迫损伤联合鞘内注射溶媒组（b）、慢性压迫损伤联合鞘内注射TGF-β1（5纳克）组在注射后0.5小时（c）、3小时（d）和6小时（e）的表现。磷酸化p38免疫反应定量分析（f）显示TGF-β1显著抑制慢性压迫损伤诱导的脊髓磷酸化p38上调。图f中各柱状图代表每组六只大鼠的均值±标准误。标尺：所有图像（a-e）均为100微米。*与假手术联合溶媒组相比P<0.05；#与慢性压迫损伤联合溶媒组相比P<0.05。

通过双免疫荧光染色进一步观察鞘内注射TGF-β1对神经病理性大鼠磷酸化p38表达细胞特异性的影响。采用抗NeuN抗体标记神经元核特异性蛋白，抗OX-42抗体显示小胶质细胞表面标志物CD11b，抗GFAP抗体标识星形胶质细胞胞质中间丝。假手术联合溶媒组中，磷酸化p38主要定位于神经元（图3a）。慢性压迫损伤联合溶媒组术后14天，在神经元（图3b）、小胶质细胞（图3e）和星形胶质细胞（图3h）中均观察到脊髓磷酸化p38表达上调，而鞘内注射TGF-β13小时后能显著抑制这种上调。

慢性压迫损伤术后14天可见小胶质细胞活化，表现为OX-42免疫反应增强、胞体肥大伴胞突回缩（图3e）；星形胶质细胞表现为GFAP免疫反应增强、胞体肥大伴突起增粗（图3h）。TGF-β1能显著抑制这两种胶质细胞的上述活化表现。

图3.鞘内注射转化生长因子-β1（TGF-β1）对慢性压迫损伤术后14天脊髓神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞中磷酸化p38表达上调的影响。图示假手术联合溶媒组（a、d、g）、慢性压迫损伤联合溶媒组（b、e、h）及慢性压迫损伤联合TGF-β1组（c、f、i）在鞘内注射3小时后腰椎脊髓背角磷酸化p38（红色）分别与NeuN（神经元特异性标志物，绿色）、OX-42（小胶质细胞标志物，绿色）和GFAP（星形胶质细胞标志物，绿色）的双重免疫荧光染色合并图像。结果显示慢性压迫损伤联合溶媒组中脊髓磷酸化p38表达定位于神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞（黄色合并信号；白色箭头），而鞘内注射TGF-β1可抑制该表达。标尺：所有图像均为50微米。

03.鞘内注射TGF-β1对慢性压迫损伤诱导的脊髓磷酸化ERK表达上调的影响

假手术联合鞘内注射溶媒组大鼠腰椎脊髓同侧背角仅见微量弥散的磷酸化ERK免疫反应（图4a）。慢性压迫损伤术后14天，同侧脊髓背角磷酸化ERK免疫反应显著增强（图4b）。TGF-β1处理0.5小时后，对慢性压迫损伤诱导的磷酸化ERK免疫反应上调未见显著抑制（图4c）。定量分析显示，鞘内注射3小时和6小时后，TGF-β1显著抑制了慢性压迫损伤诱导的同侧腰椎背角磷酸化ERK免疫反应上调（图4f）。

图4.鞘内注射转化生长因子-β1（TGF-β1）对慢性压迫损伤术后14天脊髓磷酸化细胞外信号调节激酶（phospho-ERK）表达上调的影响。图示各组脊髓磷酸化ERK标记细胞（红色）：假手术联合鞘内注射溶媒组（a）、慢性压迫损伤联合鞘内注射溶媒组（b）、慢性压迫损伤联合鞘内注射TGF-β1（5纳克）组在注射后0.5小时（c）、3小时（d）和6小时（e）的表现。磷酸化ERK免疫反应定量分析（f）显示TGF-β1显著抑制慢性压迫损伤诱导的脊髓磷酸化ERK上调。图f中各柱状图代表每组六只大鼠的均值±标准误。标尺：所有图像（a-e）均为100微米。*与假手术联合溶媒组相比P<0.05；#与慢性压迫损伤联合溶媒组相比P<0.05。

通过双免疫荧光染色进一步观察鞘内注射TGF-β1对神经病理性大鼠磷酸化ERK表达细胞特异性的影响。假手术联合溶媒组中，磷酸化ERK未定位于神经元（图5a）、小胶质细胞（图5d）或星形胶质细胞（图5g）。相比之下，慢性压迫损伤术后14天，在小胶质细胞（图5e）和星形胶质细胞（图5h）中观察到脊髓磷酸化ERK表达上调，而鞘内注射TGF-β13小时后能显著抑制这种上调。

慢性压迫损伤术后14天可见小胶质细胞（图5e）和星形胶质细胞（图5h）活化，鞘内注射TGF-β1也能显著抑制这两种胶质细胞的活化表现。

图5.鞘内注射转化生长因子-β1（TGF-β1）对慢性压迫损伤术后14天脊髓神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞中磷酸化细胞外信号调节激酶（phospho-ERK）表达上调的影响。图示假手术联合溶媒组（a、d、g）、慢性压迫损伤联合溶媒组（b、e、h）及慢性压迫损伤联合TGF-β1组（c、f、i）在鞘内注射3小时后腰椎脊髓背角磷酸化ERK（红色）分别与NeuN（神经元特异性标志物，绿色）、OX-42（小胶质细胞标志物，绿色）和GFAP（星形胶质细胞标志物，绿色）的双重免疫荧光染色合并图像。结果显示慢性压迫损伤联合溶媒组中脊髓磷酸化ERK表达主要定位于小胶质细胞和星形胶质细胞（黄色合并信号；白色箭头），而鞘内注射TGF-β1可抑制该表达。标尺：所有图像均为50微米。

四、讨论

01.研究发现总结

本研究显示，鞘内注射5纳克TGF-β1可持续6小时抑制慢性压迫损伤诱导的热痛觉过敏。慢性压迫损伤后脊髓背角磷酸化p38和ERK表达上调，而鞘内注射TGF-β1能逆转这一现象。值得注意的是，p38和ERK在慢性压迫损伤后活化的小胶质细胞和星形胶质细胞中均出现上调，其中星形胶质细胞中的表达更为显著。此外，神经元中p38的上调程度高于ERK，且鞘内注射TGF-β1也能抑制神经元中磷酸化p38的表达。

02.脊髓p38与ERK在神经病变中的作用

临床神经病理性疼痛综合征以诱发性疼痛为特征，在大鼠慢性压迫损伤模型中表现为热痛觉过敏。脊髓背角中枢敏化是神经病变相关疼痛行为的重要机制。小胶质细胞和星形胶质细胞的活化促进脊髓神经炎症，加速中枢敏化及神经病理性疼痛的发展与维持。本研究证实慢性压迫损伤术后14天可诱导这两种胶质细胞活化。p38通过Tyr-182和Thr-180位点磷酸化激活，假手术组中磷酸化p38仅见于神经元，而慢性压迫损伤后在神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞中均出现上调。ERK通过Thr-202和Tyr-204双位点磷酸化激活，假手术组中未见其特异性定位，慢性压迫损伤后主要在小胶质细胞和星形胶质细胞中表达上调。双重免疫染色结果进一步证实，星形胶质细胞是磷酸化p38和ERK上调的主要来源，这一发现支持星形胶质细胞在维持神经病理性疼痛中起关键作用的假说。

03.p38与ERK在TGF-β1镇痛机制中的贡献

慢性压迫损伤可导致脊髓TGF-β1蛋白表达下调。与本团队既往研究一致，鞘内注射TGF-β1能显著缓解慢性压迫损伤诱导的热痛觉过敏。研究发现TGF-β1通过抑制活化小胶质细胞和星形胶质细胞中磷酸化p38和ERK的上调，发挥镇痛作用。虽然鞘内注射0.5小时时TGF-β1尚未抑制磷酸化p38和ERK的上调，但其镇痛效应此时已达峰值；在3小时和6小时时间点，TGF-β1对激酶活化的抑制与其持续维持50%以上镇痛效应的时间段相符。值得注意的是，TGF-β1抑制磷酸化p38和ERK上调的持续时间与其此前报道的抑制肿瘤坏死因子-α上调的效应时段一致。因此研究人员提出，脊髓磷酸化p38和ERK的抑制主要与TGF-β1在神经病理性疼痛中镇痛效应的维持阶段相关，而非起始阶段。

五、结论

基于本研究结果及既往发现，研究人员提出TGF-β1通过双重机制发挥镇痛作用（图6）：其一，TGF-β1本身具有直接镇痛效应；其二，神经损伤通过上调脊髓胶质细胞中磷酸化p38和ERK表达诱导神经病理性疼痛，而TGF-β1能直接抑制这些激酶的表达，减轻神经炎症从而缓解疼痛行为。这表明TGF-β1具有作为神经病理性疼痛治疗策略的巨大潜力。

图6.鞘内注射转化生长因子-β1（TGF-β1）在神经病理性疼痛中镇痛作用的可能机制示意图。鞘内注射TGF-β1可减轻周围神经损伤诱导的热痛觉过敏（通路1）。磷酸化p38和磷酸化细胞外信号调节激酶（phospho-ERK）的上调是神经损伤诱导疼痛的机制之一（通路2）。鞘内注射TGF-β1可能通过抑制神经损伤诱导的磷酸化p38和phospho-ERK上调来发挥镇痛作用（通路3）。

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