目标。经过在人类和动物模型中数十年的研究，关于电刺激对神经元和非神经元元素—例如神经毡、细胞体、胶质细胞等—的作用如何导致神经调节疗法的治疗效果，仍然缺乏共识。为了进一步理解神经调节疗法，迫切需要使用最先进的神经科学工具的新方法学方法，在疾病临床前模型中研究神经调节疗法。方法。在本手稿中，我们概述了一种这样的方法，结合了在病理小鼠模型中的慢性行为单光子微内窥镜记录与常见深部脑刺激靶点的电刺激。我们详细描述了实现这种方法所需的步骤，并讨论了将这种实验范式扩展到其他深部脑刺激靶点以用于不同治疗适应症的关键考虑因素。此外，我们根据经验提出了实施和验证所需程序组合的建议，包括：通过注射程序诱导病理模型（6-羟基多巴胺帕金森病模型）、注射病毒载体以诱导GCaMP表达、植入梯度折射率透镜和刺激电极、以及安装用于安装微内窥镜的基板。我们主动识别了由于电刺激和光学记录结合而产生的独特数据分析混淆，并概述了解决这些混淆的方法。主要结果。为了验证这种独特实验方法组合的技术可行性，我们提供数据证明（1）尽管有复杂多方面的外科手术，结合刺激的数百个细胞的慢性光学记录在长达数周的时间内是可实现的（2）这种方法能够测量麻醉和清醒条件下深部脑刺激诱发的神经活动差异，以及（3）这种技术组合可用于在病理小鼠模型行为期间测量电刺激诱导的神经活动变化。意义。这些发现旨在强调最小约束光学记录在阐明疾病动物模型中深部脑刺激疗法机制的可行性和潜在效用。

一、引言

众多神经和精神疾病影响着全球多达十亿人，高达30%的确诊神经系统疾病患者对传统的药物、行为和手术干预仍然无效。为了针对这部分患者人群，过去30年来，应用电刺激神经系统以产生治疗效果的设备疗法，即神经调节疗法，其应用范围已显著扩大，并已成为治疗这些神经和精神疾病患者的既定方法。例如，对深部脑结构进行电刺激，即深部脑刺激，已获得美国食品和药物管理局批准用于治疗晚期帕金森病、震颤和癫痫。此外，人道主义设备豁免也已授予用于治疗肌张力障碍和强迫症。尽管深部脑刺激疗法在临床上广泛应用，但其任何特定治疗用途的作用机制仍知之甚少。

阐明深部脑刺激作用机制的研究主要集中在使用非侵入性功能成像和电生理记录技术测量诱发的生理反应。不幸的是，这些技术存在固有的局限性，使得难以解析深部脑刺激在执行复杂行为期间可能改变神经回路活动的多模式机制。功能成像技术—如功能磁共振成像和正电子发射断层扫描—具有较低的空间分辨率和时间分辨率，并且只能在限制整体运动的简单行为范式期间进行。来自单单元或多单元群体的电生理记录提供了高空间和时间分辨率，但仅限于稀疏采样，提供的关于记录细胞类型及其确切空间位置的信息有限或不可靠，并且随时间推移信号稳定性低，这限制了对深部脑刺激诱导的回路功能可塑性变化的研究。由于深部脑刺激会引发电磁串扰并干扰记录电极/电解质界面，电刺激还会产生可能类似于电生理反应的伪迹。

深部脑刺激的预期治疗效果和意外副作用很可能是通过多种机制介导的，可能由多种细胞类型驱动，从而改变神经回路的功能。每种机制的相对贡献可能在刺激过程中演变，这是由于电极/组织界面的变化、刺激诱导的电极附近神经元和非神经元细胞的可塑性、刺激诱导的突触后可塑性、行为状态的变化以及辅助用药状态所致。神经调节疗法在癫痫、抑郁症和图雷特综合征等多种病症中的临床应用一致表明，患者结局在数周至数月的时期内缓慢出现显著改善。这些缓慢的治疗反应是安慰剂效应、植入物局部组织变化、更广泛网络适应，还是所有上述因素组合的结果，目前仍不清楚。因此，用于阐明深部脑刺激治疗机制的实验范式，理想情况下需要能够在数周至数月的时间范围内，以高空间和时间分辨率记录数百个基因特异性细胞的稳定群体。这些测量需要在与研究临床适应症相关的行为期间进行，以了解局部、回路和系统水平依赖性在神经对深部脑刺激反应中的作用。

通过头戴式微型显微镜进行的单光子钙成像先前已在行为动物中得到验证，可用于在数周至数月的时间范围内记录大量稳定的基因特异性细胞群体，但尚未扩展到神经调节疗法的研究中。为此，本文我们介绍了在诱导疾病病理的行为小鼠中，将深部脑结构电刺激与慢性单光子成像相结合的方法（图1(A), (B)）。在深部脑刺激的病理模型中加入单光子显微镜，给实验程序增加了几个侵入性组成部分，这引入了更多潜在的失败点。因此，我们根据实施这种组合方法的经验提供建议，说明如何分别优化和验证每个组成步骤以实现组合程序。由于电刺激诱发的同步神经活动干扰了一些最先进的微型显微镜分析技术，我们对不同的分析技术进行了定性评估，以强调在神经调节背景下验证神经元钙轨迹准确识别的重要性。由于这些多个复杂组件的集成可能会影响记录质量，我们提供数据以验证在同样植入电极以向底丘脑核提供刺激的6-羟基多巴胺帕金森病小鼠模型中，长时间维持数百个纹状体细胞稳定光学记录的技术可行性（图1(C)）。我们还展示了我们初步的动物内研究发现，即底丘脑核刺激诱发的反应在麻醉状态与清醒状态之间，以及在清醒状态下的休息与运动之间存在显著差异。这些初步数据说明了在清醒、行为病理模型中研究深部脑刺激机制的必要性。这些动物内差异是否能在队列中阐明深部脑刺激疗法的基本机制，将在未来的研究中探索。

图1. 实验目标。 (A) 使用微型头戴式显微镜对6-羟基多巴胺损伤小鼠深部脑结构中GCaMP标记的神经元进行可视化。通过注射6-羟基多巴胺损伤黑质致密部，以创建帕金森病动物模型。通过植入纹状体的梯度折射率透镜，对用GCaMP标记的细胞进行钙成像；GCaMP是一种常用于检测神经活动的基因编码钙指示剂。此外，将双绞双极电极插入底丘脑核以传递深部脑刺激。(B) 在旷场行为期间进行光学成像和底丘脑核的电刺激，同时追踪动物的位置，以评估行为变化。(C) 分别在上方左右面板中显示的神经活动的空间属性和时间属性，从记录的微型显微镜视频中提取，并使用针对微内窥镜数据的约束非负矩阵分解进行分析，以确定在刺激期间发生的纹状体活动变化。此图不包含在CC-BY许可中。经梅奥医学教育与研究基金会许可使用。保留所有权利。

二、方法

在行为6-OHDA损伤小鼠身上通过电刺激获取钙成像的实验方案，需要成功实施四个独立的组成部分：通过向纹状体单侧注射AAV9病毒载体诱导钙指示剂表达（图2(A)、(B)）；将梯度折射率透镜放置到纹状体正上方的目标记录位置（图2(A)、(C)）；通过向黑质致密部单侧注射6-OHDA诱导帕金森病表型（图2(A)、(B)）；以及在底丘脑核内放置双极刺激电极以施加电刺激（图2(A)、(C)）。该实验方案的每个组成部分均首先经过单独测试，以尽量减少实施完整实验所需的时间和故障排除。

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图2. 在清醒、自由活动的帕金森病动物中进行底丘脑核电刺激期间，记录纹状体神经活动钙成像所需的实验流程。 (A) 在钙成像实验开始前的一个月内，小鼠分期接受了多巴胺能损伤、病毒转染、梯度折射率透镜和深部脑刺激电极的手术植入，以及显微镜基板的安装程序。(B) 在第0天，在异氟烷麻醉下向背侧纹状体进行单侧微量注射AAV9-GCaMP6m，以诱导成像所需的GCaMP报告基因表达（1）。在同一手术期间，向同侧黑质致密部注射6-OHDA溶液，以造成多巴胺能损伤，从而产生帕金森病表型（2）。(C) 在第14天，在异氟烷麻醉下分别将深部脑刺激电极（1）和梯度折射率透镜（2）植入底丘脑核和背侧纹状体。两个植入物均通过颅骨螺钉和牙科粘固剂固定于头骨。特别注意避免覆盖前囟和梯度折射率透镜的位置。右侧面板显示了用于安装显微镜的基板。(D) 将带有附接基板的显微镜置于清醒、头部固定的动物（位于跑轮上，未显示）的梯度折射率透镜上方，并调整显微镜与透镜之间的距离以优化焦平面，从而显示最活跃且对焦清晰的细胞体。随后通过牙科水泥将显微镜基板固定于动物，并在头帽上涂抹黑色指甲油以防止外部光源污染。然后将动物从头部固定跑轮装置上取下，准备进行行为成像实验。此图不包含在CC-BY许可中。经梅奥医学教育与研究基金会许可使用。保留所有权利。

2.1 受试对象

总共使用了30只体重约25–30克的成年C57BL/6 J雄性小鼠，用于测试实验方案的每个组成部分。这些动物用于验证6-OHDA损伤和行为，以及在健康小鼠和帕金森病小鼠中进行慢性记录。在十只帕金森病小鼠中，有四只因手术并发症和植入/表达问题而被排除在分析之外，其余小鼠用于麻醉状态下的数据收集。在这六只进行麻醉记录的小鼠中，有两只被排除在本文呈现的分析之外，因为死后组织学检查表明它们的电极未正确放置在底丘脑核内。此外，在其中两只动物身上也进行了清醒状态下的钙成像研究。排除标准和实验结果在表1中描述。

表1. 动物结局。 用于验证小鼠背侧纹状体内慢性钙成像的动物队列结局，以及包括注射AAV9以诱导GCaMP6m表达（图2(A)），结合植入梯度折射率透镜（图2(B)）、6-OHDA损伤（图2(A)）和植入双极刺激电极（图2(B)）在内的全部实验程序的结局。

动物群养于标准光/暗周期下，自由获取食物和水。所有实验程序均经相关机构动物护理和使用委员会批准，并按照美国国家研究委员会《实验室动物护理和使用指南》执行。

2.2 病毒载体注射与多巴胺能损伤

小鼠在诱导室中用5%异氟烷麻醉，随后在立体定向手术期间持续给予1%-2%异氟烷-氧气混合气体维持麻醉。行中线切口暴露头骨，并在背侧纹状体和黑质致密部上方钻取颅骨孔。使用由立体定位仪安装的微驱动器控制的汉密尔顿注射器，以约10微米/秒的速率降至右侧背侧纹状体，并以100纳升/分钟的速率注射500纳升 AAV9.CAG.GCaMP6m.WPRE.bGHpA（图2(B)）。在单侧AAV注射前，令脑组织静置一分钟。注射后，让病毒额外扩散五分钟，再以约10微米/秒的速率移出针头。

AAV注射后，立即使用另一支汉密尔顿注射器，在三个深度向黑质致密部注射6-OHDA（图2(B)）。每个位点的注射量为650纳升，输送速率为100纳升/分钟。在这三个深度中的每一个进行注射前，均等待一分钟让脑组织稳定，注射后等待五分钟让药物扩散。注射针的插入、取出和移动均以约10微米/秒的速率进行。在首次6-OHDA注射前约30分钟，注射盐酸地昔帕明以防止6-OHDA被单胺神经元摄取。在缝合皮肤切口前，用Kwik-Sil密封颅骨孔。注射酮洛芬和卡洛芬以减轻炎症并提供镇痛。每只动物在加热的家养笼中单独恢复，直至完全恢复活动能力，然后放回群养笼中。

2.3 梯度折射率透镜与深部脑刺激电极的植入

由于用于向底丘脑核施加电刺激的电极和梯度折射率透镜都需要嵌入动物的牙科水泥头帽中，因此两者在同一外科手术过程中植入。单独植入梯度折射率透镜的详细步骤已有文献详细描述，且本研究中纹状体成像的透镜植入位置依据相关研究选定。尽管深部脑刺激电极的植入位点、电极尺寸和刺激参数已在大鼠模型中有所描述，但在小鼠中进行的工作要少得多。为此，底丘脑核刺激电极的尺寸和植入位置是基于小鼠脑图谱，并参考相关大鼠研究进行调整的。为确保有足够时间进行病毒转染，在注射病毒载体和多巴胺能损伤两周后，按上述方法准备第二次手术。在背侧纹状体和底丘脑核上方钻取颅骨孔（图2(C)）。植入三颗骨螺钉，以为用于固定植入物的C&B Metabond牙科水泥增加结构支撑。通过底丘脑核的颅骨孔，用显微解剖镊手术切开硬脑膜以便插入电极。将一个带有500微米裸露尖端、触点间距500微米的双绞双极特氟龙绝缘铂金深部脑刺激电极，以约10微米/秒的速率插入底丘脑核（图2(C)）。通过纹状体颅骨孔，吸除纹状体背侧表面上方直径1毫米的柱状脑组织，为透镜植入清理出路径。为防止吸引深度超过预定目标，将一根钝的27号针头在距尖端2.1毫米处弯曲（这大约是从颅骨表面到背侧纹状体顶部的深度），并用此针头吸引组织，直至通过莱卡外科手术显微镜目视识别出胼胝体白质。随后通过吸引小心移除一小部分白质，以暴露纹状体背侧表面用于成像，同时尽量减少组织损伤。然后，使用定制的透镜夹持器，将一个长4毫米、直径1毫米的梯度折射率透镜通过纹状体颅骨孔插入至硬脑膜下-2.35毫米的深度（图2(C)）。该定制夹持器由切割后的微量移液器吸头制成，以牢固夹持约500微米的透镜。在植入梯度折射率透镜和深部脑刺激电极后，使用Kwik-Sil密封两个颅骨孔。安装一个头杆，使其从动物颅骨的对侧（相对于植入物）横向延伸，以便在安装显微镜基板时固定动物头部（图2(D)）。使用C&B Metabond将头杆、深部脑刺激电极和梯度折射率透镜固定于颅骨，形成头帽。使用由微量离心管底部尖端制成的定制塑料帽，并用KwikCast附着，以保护透镜表面。术后护理方法同前。

2.4 显微镜基板安装

为了在使用nVoke微型显微镜进行行为期间执行钙成像，需要在梯度折射率透镜上方安装一个基板。基板被永久固定在小鼠头帽上，其位置需使得对焦清晰的活跃神经元数量最大化。由于纹状体神经活动具有运动依赖性，该位置通过可视化清醒、头部固定小鼠的活跃神经元来确定。此程序在梯度折射率透镜植入两周后、动物恢复后进行（图2(A)）。首先使用先前安装的头杆固定小鼠头部，并将其置于定制的跑轮上以允许运动。运动能增加纹状体神经元活性，从而更容易确定使对焦清晰神经元数量最大化的安装位置。初始设置显微镜的聚焦旋钮于其范围中部附近，以最大限度地提高校正基板在牙科水泥固化期间可能发生移动的能力。接着，将附有基板的nVoke显微镜置于透镜表面上方（图2(D)）。通过确保透镜边缘整个圆周都对焦清晰，使显微镜相对于梯度折射率透镜表面调至水平。然后打开激发LED，以便观察荧光指示剂。在钙信号最强的组织区域上缓慢调整微型显微镜的背腹侧位置，直至找到具有对焦清晰活跃细胞的成像平面（图2(D)）。根据需要调整显微镜的内外侧和前後侧位置，以最大化视野中的活跃细胞数量。一旦找到该位置，使用C&B Metabond将基板附着到头帽上。最后，用黑色指甲油涂抹头帽，以防止环境光透过牙科水泥污染记录信号（图2(D)）。

2.5 麻醉小鼠钙成像

使用异氟烷对小鼠进行麻醉以执行钙成像。将显微镜连接到基板上，并调整显微镜聚焦旋钮的位置至基板安装过程中确定的成像平面。记录此新的旋钮位置，并将其用于所有后续的成像会话。使用 Master-8 刺激器配合 Iso-Flex 隔离器，以1分钟的间隔施加一系列持续10秒、频率130 Hz、脉冲宽度140微秒的双相刺激序列。刺激幅度逐渐增加，直至观察到诱发的钙信号变化。随后分别以30 Hz、80 Hz和130 Hz的频率施加刺激序列，并各重复三次。这些刺激频率的选择基于先前在6-OHDA损伤大鼠模型中的研究，该研究表明高频刺激（80 Hz和130 Hz）具有治疗效果，而低频刺激（30 Hz）则无效。刺激的触发以及与光学记录的同步，是通过nVoke显微镜系统的数字I/O接口实现的。

2.6 深部脑刺激期间的旷场钙成像

将小鼠放置于45厘米 × 45厘米的旷场中，并连接好微型显微镜和深部脑刺激电极。通过顶置摄像头记录动物运动。nVoke显微镜通过其数字IO盒提供的同步信号用于触发顶置摄像头的帧采集。对于未损伤且未植入深部脑刺激电极的动物，在安装显微镜基板两天后进行一次30分钟的记录，此后每周重复一次，持续四周。对于植入深部脑刺激电极的6-OHDA损伤小鼠，在安装显微镜基板四天后，进行一次类似于前述麻醉状态下进行的深部脑刺激参数选择会话。在参数选择会话期间，以3分钟的间隔施加持续1分钟的130 Hz双相脉冲（140微秒）刺激序列，同时增加刺激幅度以确定诱发不良反应的刺激阈值。最常观察到的不良反应是异常运动活动或肌肉收缩。随后，在基板安装后的第6天和第8天，分别进行两次50分钟的记录。

2.7 神经信号识别

钙成像数据被导入数据处理软件进行预处理，随后通过针对微内窥镜数据的约束非负矩阵分解方法进行神经信号识别。所有数据首先进行空间下采样（因子为2），这是常见做法以减少后续分析的处理时间。对于麻醉动物获取的数据集，无需使用运动校正算法。然而，对于在清醒动物中记录的钙成像数据集，则使用IDPS中实现的Turboreg运动校正算法进行运动校正。为了在应用CNMF-E期间改善处理时间和内存使用，在IDPS内将数据额外下采样3倍，总有效下采样倍数为6倍。随后将数据从IDPS导出为TIF文件，并加载到Matlab®中。为了识别神经元，将Matlab实现的CNMF-E应用于数据，遵循推荐的流程，并在Neuroscience Gateway高性能计算资源上进行计算。简而言之，基于计算节点可用内存（128 GB），使用尽可能大的块大小在块模式下进行分析。对所有数据集使用背景荧光的环状模型。根据数据集选择神经元和环的尺寸，使得环直径约为最大神经元直径的1.5倍。

2.8 钙事件率评估

为证明此方法组合在自由行为小鼠深部脑刺激研究中的实用性，根据在旷场行为期间收集的数据计算了归一化至静息状态的钙事件率变化，并使用CNMF-E进行分析。钙事件率的计算及归一化至同一动物静息状态钙事件率的方法如前人所述。简而言之，每帧的瞬时钙事件率计算为在该帧内发生的、由CNMF-E输出的事件总数。然后，根据使用Ethovision XT评估的运动速度对帧进行分箱。将钙事件率归一化至静息状态的平均事件率，以便在动物之间比较结果，静息状态定义为动物瞬时速度小于0.5厘米/秒时。随后，将钙事件率按运动速度相同（速度区间在0.5–2.5厘米/秒内）进行分箱，在较低速度使用更细的分箱，在较高速度使用更粗的分箱。 对于施加深部脑刺激期间的钙事件率计算，将运动期间（运动速度 > 0.5厘米/秒）的钙事件率归一化至同一动物在记录中未受刺激期间的静息平均事件率。

2.9 灌流与组织制备

安乐死后，进行经心灌流，先用50毫升0.9%生理盐水，随后用50毫升溶解于0.1 M NaKPO₄的4%多聚甲醛。取出灌流后的脑组织，在4%多聚甲醛中后固定过夜，并储存于30%甘油沉降溶液中。使用滑动式显微切片机进行40微米厚度的冰冻切片。切片储存于含0.1%叠氮钠的0.1 M磷酸盐缓冲溶液中。

2.10 6-OHDA损伤与立体定位靶点的组织学评估

冠状切片在含0.2% Triton X-100的0.01 M磷酸盐缓冲盐水中漂洗，并在含10%正常山羊血清的PBS-Tx中封闭1小时。随后，将切片与悬浮于10%正常山羊血清中的一抗（抗酪氨酸羟化酶，兔多克隆抗体，1:4000）共同在4°C摇床上孵育过夜。每次漂洗持续两分钟，重复三次。一抗孵育后，将切片在PBS-Tx中连续漂洗三次，每次两分钟。然后将切片在室温下与二抗（偶联荧光染料Alexa Fluor 647的山羊抗兔IgG，1:200）在10% NGS中孵育2小时。随后制备玻片，根据取出脑组织前移除植入物所留下的低信号伪影位置，评估梯度折射率透镜和底丘脑核电极导线的放置位置。通过目视确认梯度折射率透镜放置于背侧纹状体内，这是一个大且易于识别的靶区。底丘脑核导线尖端的放置位置，通过将小鼠脑图谱叠加到显示其遗留低信号伪影的切片图像上来确认。通过组织学分析评估，若两个刺激电极触点均未位于底丘脑核内，则将动物排除在分析之外。二抗孵育后，用0.1 M磷酸缓冲液将切片连续漂洗三次，每次两分钟，随后贴附于涂有明胶的玻璃载玻片上，并使用含DAPI的ProLong Antifade封片剂盖上盖玻片。使用显微镜、LED光源和Elements软件对冠状切片进行成像。为评估6-OHDA损伤，对酪氨酸羟化酶表达进行了定量。使用Tx Red滤光块立方体、4毫秒快门速度和50% LED功率获取图像。在使用ImageJ进行半径为50像素的"滚动球"背景扣除后，将阈值设定在（30–255）。按照相关文献描述的方法，手动计数黑质中的TH阳性细胞体。在背侧纹状体中，使用ImageJ量化TH信号的平均像素强度，计算为像素值总和（0–255）/方形像素数量。组织学观察中受梯度折射率透镜轨迹影响的纹状体区域未纳入平均像素强度分析。

三、结果

这项原理验证性研究的目标是建立一个方法学框架，以克服在自由活动动物中将电刺激与钙成像相结合所伴随的实验和数据分析挑战。该实验方案包括注射AAV9以诱导GCaMP6m表达（图2(A)），结合植入梯度折射率透镜（图2(B)）、6-OHDA损伤（图2(A)）以及植入双极刺激电极（图2(B)），这些步骤首先在不同的动物队列中分别进行了验证。

6-OHDA损伤、GCaMP表达及植入物定位的组织学验证

对十只小鼠执行了完整的实验范式，包括6-OHDA损伤、AAV9注射、梯度折射率透镜植入和底丘脑核刺激电极植入。两只小鼠因手术并发症死亡，一只因梯度折射率透镜损坏无法成像，一只因GCaMP表达不足无法成像。另外两只小鼠因死后组织学评估发现刺激电极误置于底丘脑核之外而被排除在所有分析之外。这些排除标准在表1中描述。通过注射AAV9.CAG.GCaMP6m.WPRE.bGHpA诱导的GCaMP6m钙指示剂表达，经组织学分析证实，显示背侧纹状体中存在绿色荧光细胞体（图3(B)）。大多数表达GCaMP的细胞未显示任何核表达，这是细胞健康的一个重要指标（图S3）。通过在同侧半球进行的单侧6-OHDA损伤实现的多巴胺能损伤，经由酪氨酸羟化酶的免疫组织化学标记以及随后对TH阳性细胞和平均像素强度的定量分析得到证实（图3(A)）。观察到损伤半球与非损伤半球之间，在背侧纹状体平均像素强度（图3(D), p < 0.05；韦尔奇不等方差t检验）和黑质致密部TH阳性细胞数量（图3(E), p < 0.05；韦尔奇不等方差t检验）上均存在显著降低。

图3. 组织学与行为学评估。 (A) 纹状体层面组织学分析的冠状面视图，显示透镜放置位置、GCaMP6m表达（绿色标记，插图）及酪氨酸羟化酶染色（红色标记），证明纹状体存在单侧多巴胺能损伤（对比健康动物）。(B) 指示深部脑刺激电极在底丘脑核植入位置的冠状面视图。(C) 冠状图谱视图显示六只动物的深部脑刺激导线放置位置（橙色圆点表示位于底丘脑核内的电极，蓝色圆点表示位于底丘脑核外的电极）与底丘脑核位置的对比。(D) 背侧纹状体TH阳性平均像素强度（0-255）计算结果（韦尔奇不等方差t检验, p < .05, n = 10），以及(E) 损伤半球与非损伤半球黑质致密部TH阳性细胞定量结果（韦尔奇不等方差t检验 p < .05, n = 12；总计1866个细胞），表明6-OHDA损伤成功。

慢性钙成像

在未植入刺激电极的健康小鼠中，对纹状体内的钙成像进行了初步验证（图4）。在五只动物跨越33天的六次记录会话中，通过CNMF-E识别出的细胞数量保持稳定（图4(B)）。这表明可以对同一脑区进行长期记录，不过在多次记录会话之间观察到视野存在轻微差异（图4(C)）。此外，在一次记录会话中显微镜受损及随后的维修，导致会话间的焦平面发生轻微变化，包括90°的旋转（图4(C)）。

图4. 健康小鼠的慢性钙记录。 (A) 健康小鼠纹状体冠状面视图，显示透镜放置位置、GCaMP6m表达（绿色，插图），但酪氨酸羟化酶染色（红色）显示多巴胺能细胞未见多巴胺能损伤。(B) 在五只小鼠队列中，使用针对微内窥镜数据的约束非负矩阵分解方法识别出的细胞数量在33天内保持稳定（p = 0.89；单因素方差分析）。(C) 代表性小鼠显示在研究期间通过CNMF-E识别的纹状体神经元数量（注意第0天和第12天之间显微镜视野发生了旋转）。(D) 通过CNMF-E提取的十个细胞随机选择的钙轨迹。(E) 这些实验的时间线。

神经信号识别

在开展清醒行为实验之前，首先在六只麻醉动物中验证了记录底丘脑核刺激在纹状体内诱发反应的能力。两只动物未在纹状体内表现出刺激诱发反应；事后经死后组织学验证，这两只动物的双绞双极电极对均未位于底丘脑核内，因此将它们从分析中移除。在四只麻醉动物中观察到了刺激诱发反应，这些动物在持续10秒的30赫兹、80赫兹和130赫兹刺激期间接受了成像。这些刺激时段之间间隔1分钟，以消除先前刺激的残留效应。该序列在每只动物中重复三次。在麻醉状态下，当刺激关闭时纹状体处于静息状态（图5(A)），仅在施加底丘脑核刺激时才变得活跃（图5(B)–(D)）。底丘脑核刺激激活了纹状体内一部分对焦清晰的细胞，并引起了背景荧光的离焦变化（图5(B)–(D)），这可能源于刺激诱发的细胞活性的广泛变化。这些刺激依赖性的离焦信号体现为视野内平均荧光的变化（图5(E)）。这些离焦变化以及多个神经元的同步激活，干扰了通过主成分分析/独立成分分析等标准数据分析技术对钙信号的分析，因为这些技术利用时间特征的差异来识别细胞（图S5(B)）。为了快速评估常用算法在存在刺激诱导的显著平面外钙活动时分离单个细胞活动的能力，我们基于平面外激活模型，将模拟的背景荧光变化添加到了一个实验数据集中（图S1）。随后，对常用数据分析方法和空间滤波技术在识别空间紧凑的神经元及去除模拟污染方面的能力进行了定性比较（图S5）。

图5. 麻醉小鼠的底丘脑核刺激。 (A)-(D) 在麻醉的6-OHDA损伤小鼠中，由不同刺激频率（无刺激(A)、30赫兹(B)、80赫兹(C)和130赫兹(D)刺激）诱发的代表性钙响应。(E) 在一系列刺激期间，整个视野范围内的平均荧光变化。

研究人员评估了感兴趣区域分析、主成分分析/独立成分分析（无论是否使用时空解混）以及CNMF-E在存在真实和模拟背景荧光的情况下提取明确定义细胞体的能力。尽管感兴趣区域分析允许选择明确定义的细胞体，但它是一种主观技术，无法将细胞活动与低空间频率的背景污染分离开。其结果是，在底丘脑核电刺激期间提取的钙轨迹对于视野中的所有细胞几乎完全相同（图S5(A)）。这表明这些轨迹主要是背景污染的结果，而非来自单个神经元的活性。此外，感兴趣区域分析无法去除模拟的背景污染（图S5(A)）。这些结果表明，感兴趣区域分析不太适用于从电刺激期间获得的记录中识别神经元。与感兴趣区域分析类似，主成分分析/独立成分分析未能唯一识别在刺激期间表现出同步放电的细胞，并且无法完全去除人为的背景污染（图S5(B)）。可用于改进主成分分析/独立成分分析细胞识别的时空解混技术，也未带来显著改善（图S5(C)）。感兴趣区域分析和主成分分析/独立成分分析均应用于同一经过空间带通滤波器预处理的数据，该滤波器的截止频率是根据在ΔF/F数据中观察到的细胞体大小（5到31像素）选择的。在这两种情况下，空间滤波改善了对人为背景污染的抑制，但并未完全消除背景污染（图S5(D)-(F)）。相比之下，CNMF-E尽管存在同步神经活动，仍能够识别单个细胞体（图S5(G)），且以客观的方式进行，并且不易受低空间频率背景噪声的影响。因此，我们在本手稿随后的所有数据分析中均使用了CNMF-E。

麻醉动物中底丘脑核电刺激的频率依赖性

基于前一节描述的四只植入电极位于底丘脑核的麻醉小鼠的记录，对底丘脑核刺激在纹状体内诱发的钙反应的频率依赖性变化进行了初步表征。尽管观察到纹状体在麻醉状态下处于静息状态（图5(A)），但随着30赫兹、80赫兹和130赫兹的底丘脑核刺激开始，出现了提示神经元激活的明显钙活动（图5(B)–(D)，视频S1）。此外，神经元的募集以频率依赖的方式发生（图6(A)-(C)），80赫兹和130赫兹刺激所激活的细胞数量多于30赫兹刺激（图6(D), p < 0.05；克鲁斯卡尔-沃利斯单因素方差分析，邓恩多重比较检验）。尽管神经激活总体上具有频率依赖性，但单个神经元对不同刺激的反应存在异质性，如图6(E)所示。例如，有些细胞仅对80赫兹的刺激有反应，而对130赫兹没有反应（即图6(E)中的细胞2），甚至对相同参数的重复刺激表现出异质性反应（即图6(E)中的细胞4）。特定细胞受刺激诱发的行为不一定取决于其在视野中的相对位置，共定位的神经元对相似参数显示出不同的反应（图6(E)）。

图6. 对底丘脑核电刺激的频率依赖性响应。(A)–(C) 分别显示在一只有代表性的麻醉小鼠中，对连续三次30赫兹、80赫兹和130赫兹刺激响应的细胞，叠加在记录的平均背景图像上。(D) 在四只小鼠队列中，对30至130赫兹刺激有响应的激活细胞数量，每种刺激重复三次。克鲁斯卡尔-沃利斯单因素方差分析，邓恩多重比较检验；* 表示 p < 0.05。灰色圆点显示每只动物的动物内反应中位数。分析基于在麻醉状态下刺激期间识别出的总计19、4、7和14个神经元。(E) 一只代表性6-OHDA损伤小鼠中，神经元对30、80和130赫兹刺激响应的异质性。

刺激诱发的行为与钙响应

在四只进行了麻醉状态下刺激诱发记录的小鼠中，有两只还在旷场环境中于刺激期间（参数：200微秒脉冲宽度，30微安幅度；以及200微秒脉冲宽度，80微安幅度）接受了清醒行为成像会话。与同一动物的麻醉记录相比，发现纹状体神经元群体在旷场行为期间高度活跃，并且在动物运动期间活动增加（图7(A)，视频S2）。这可以从动物速度（图7(A) 顶行）与点阵图（图7(A) 第二行）和钙轨迹（图7(A) 第三行）所显示的细胞活动之间的关系中看出。图7(A) 第二行显示的点阵图展示了一个代表性数据集中所有细胞的钙事件发生时间，而第三行的钙轨迹点阵图则显示了数据集中信噪比最高的40个细胞的钙活动。在30赫兹（图7(B), (C)；p<0.0001，克鲁斯卡尔-沃利斯单因素方差分析，邓恩多重比较检验）和130赫兹（图7(B), (C)；p<0.0001，克鲁斯卡尔-沃利斯单因素方差分析，邓恩多重比较检验）刺激下，均观察到钙事件率与动物速度之间的关系存在显著差异。

图7. 神经活动与动物行为（速度）的关系随底丘脑核刺激而变化。 (A) 通过针对微内窥镜数据的约束非负矩阵分解方法识别的纹状体细胞活动（下方面板）与小鼠行为（顶行，以速度衡量）相关，数据跨越受刺激和未受刺激的旷场行为会话。第二行显示了来自一个代表性数据集中所有细胞的已识别钙事件，而第三行代表了同一数据集中信噪比最高的40个细胞的钙轨迹。第四行显示了在未刺激期间，其已识别钙事件与小鼠速度最相关的神经元的细胞轨迹，展示了在运动期间活动增加的示例。(B) 在所有刺激范式之间，归一化至静息无刺激状态（速度 < 0.5 厘米/秒）的钙事件率关系的差异。(C) 在所有刺激范式之间，归一化至静息无刺激状态（速度 < 0.5 厘米/秒）的钙事件率。克鲁斯卡尔-沃利斯单因素方差分析，邓恩多重比较检验；**** 表示 p < 0.0001。灰色圆点显示动物对刺激的动物内反应中位数。分析基于在这两只动物中识别出的208个和344个神经元。

四、讨论

尽管在行为病理动物身上结合光学记录与深部脑刺激具有若干优势，但实现完整的实验范式需要成功完成一系列复杂的程序。为证明此方法实用性所概述的所有实验，均需要实施四个独立的组成部分：通过向纹状体单侧注射AAV9病毒载体诱导钙指示剂GCaMP6m表达（图2(A)、(B)）；将梯度折射率透镜放置到纹状体正上方的目标记录位置（图2(A)、(C)）；通过向黑质致密部单侧注射6-OHDA诱导帕金森病表型（图2(A)、(B)）；以及在底丘脑核内放置双极刺激电极以施加电刺激（图2(A)、(B)）。这些实验组成部分的故障排除复杂性，以及在完整实验范式背景下对每个组成部分进行验证的必要性，是采用此方法研究深部脑刺激效果的一个重大障碍。为了能使其他研究人员采用这种技术组合来研究神经调节疗法，本文我们描述了实施和验证这些实验组成部分的方法，以帮助他人进行类似的实验。

在帕金森病小鼠底丘脑核深部脑刺激期间钙成像实用性的论证

本方法论文中概述的实验的基本目标是证明多组件外科手术程序的技术可行性，并证明在传统深部脑刺激靶点（底丘脑核）的一个常被探索的下游结构（纹状体）中，刺激诱发的反应会随着行为状态（麻醉、清醒静息、清醒运动）的变化而变化。这些数据旨在强调，组合的实验准备能够产生独特的信息，可能对未来研究深部脑刺激机制有用，但此时并非旨在对底丘脑核深部脑刺激治疗帕金森症状的治疗机制做出任何明确的结论。

作为利用单光子钙成像评估深部脑刺激效果的初步探索，我们观察了麻醉小鼠中诱发神经活动的频率依赖性。其他研究表明，电刺激以频率依赖的方式兴奋神经元件，并且对神经调节的治疗反应高度依赖于刺激频率。例如，人类患者中底丘脑核深部脑刺激的治疗效果通常通过120–180 Hz范围内的高频刺激实现。在麻醉期间被刺激激活的神经元群体，仅占在未刺激的清醒行为记录中识别出的神经元的一小部分（图6(A)-(C)）。这种稀疏激活与使用光学技术的其他研究工作一致，这些工作显示刺激电极周围存在稀疏的神经激活。与30赫兹刺激相比，观察到在80赫兹和130赫兹刺激下激活的细胞数量有所增加（图6(D)）。在麻醉状态下的光学记录中，观察到纹状体内神经激活的异质性变化，在显微镜视野中彼此靠近的不同细胞对不同频率的刺激产生反应（图6(E)）。这种异质性可能是由于特定细胞类型的反应差异所致。异质性也可能是刺激诱发的局部神经元/非神经元活动随距离双极电极的细微变化的结果，导致在连接回路的远端点产生不同的反应。

为了说明在清醒行为病理模型中刺激底丘脑核的同时在纹状体进行光学记录的技术可行性，我们进行了一系列记录，其中包括10分钟的30赫兹和130赫兹电刺激时段，并与10分钟的无刺激时段交替进行。在行为小鼠中，发现纹状体的活动性比麻醉状态下高得多（图7(A)）。此外，根据动物速度评估，发现纹状体内的神经元活动随着小鼠的运动而增加（图7(A)-(B)）。与麻醉状态下底丘脑核刺激增加纹状体观察到的活动相反（图6），在两只同时进行了麻醉和清醒记录的动物中，在最小约束行为期间进行底丘脑核刺激降低了纹状体的活动（图7）。鉴于动物数量较少，我们无法就整个群体范围内的深部脑刺激机制得出任何明确的结论；然而，这些数据表明，深部脑刺激的下游效应可能也取决于行为对同一回路的输入，从而强调了需要与深部脑刺激期间无约束行为实验兼容的记录技术。此外，利用钙成像记录基因定义的细胞亚群，将使得在特定神经元细胞类型（例如构成纹状体主要输出的D1和D2中型多棘神经元）背景下研究神经调节效应成为可能。

实施完整实验方案的技术挑战

这些概念验证实验的复杂性导致仅在40%的动物中成功实现了刺激和成像，主要的失败点包括：手术期间与麻醉相关的并发症（20%）、动物群养期间透镜损坏（10%）、GCaMP表达不足（10%）以及未能将底丘脑核刺激电极放置在目标结构内（20%）。这些失败点可以通过实践和对实验程序进行一些简单的修改来改善。然而，由于该程序不同组件存在多个累积的失败点，因此最大限度地减少失败以获得可行的实验产出率尤为重要。为实现此目标，我们建议先分别优化外科手术程序的每个组成部分，以缩短手术时间并减少并发症，然后再尝试组合实施。通过并行优化每个组件，我们能够在项目开始约两个月后完成首批采用完整实验范式的动物实验。

深部脑刺激植入手术的失败率较高，原因在于小鼠模型中定位小脑核团的难度很大。因此，在将其与整体程序的其他组成部分结合之前，练习和优化深部脑刺激植入物的靶向定位非常重要。由于电极位置的验证需待组织学确认后才能进行，若电极定位不准，可能会花费大量时间在最终将被排除分析的动物身上进行实验。我们随后为改进靶向定位所采取的一项措施是改用由铂/铱丝制成的定制电极，以替代本研究中使用的铂电极。在本实验使用的电极尺寸下（直径75微米丝），铂/铱电极比纯铂电极坚硬得多；根据我们的经验，它们在插入过程中偏离目标轨迹的可能性更小。在尝试植入梯度折射率透镜及后续成像之前，应独立验证的另一个组成部分是：目标位置的GCaMP表达是否充足且未显示表明毒性的核表达。适当的GCaMP表达是成功成像的关键因素，无论是在遗传品系还是腺相关病毒诱导模型中，均可在成像前轻松检查。如果使用腺相关病毒，可通过调整病毒滴度来调节表达，这可能有助于针对特定靶点位置进行优化。

我们实验中一个可以避免的失败点是在透镜植入与动物安装基板期间对梯度折射率透镜的保护。在本研究描述的实验过程中，我们使用由微量离心管末端制成并用Kwik-Cast粘合剂固定的塑料保护帽来保护梯度折射率透镜。此后我们已改用牙科水泥将保护帽固定在动物的头帽上，以获得更牢固的连接。无论选择何种方法，都应在尝试完整实验范式之前进行优化，以防止在此阶段损失动物。

微内窥镜光学记录的实施以及通过植入电极进行同步刺激，需要在具体行为实验的背景下仔细规划，因为与仪器的连接既可能限制行为，也可能对连接器和头帽本身造成压力。例如，在我们的实验中，对6-OHDA损伤小鼠的单个记录会话限制在10分钟以内，以防止因损伤动物的偏向旋转行为导致显微镜和刺激电线缠绕。未来，将通过增加滑环来延长记录时间。对电线进行适当控制并使用滑环以实现动物的无约束行为，对于严谨研究深部脑刺激应用期间的行为变化至关重要，因为电刺激所需的额外电线会比仅使用微型显微镜对小鼠行为施加更多限制。

其他在使用行为动物进行单光子和双光子显微镜研究的工作已显示出超过一个月的稳定纵向记录。这些数据表明，在数周的神经调节治疗期间对同一细胞群体进行纵向记录是可能实现的。针对某些神经和精神疾病（如抑郁症和癫痫）的神经调节疗法可能需要数月才能显现治疗效果。因此，通过钙成像在深部脑区对同一组细胞进行数周至数月的纵向记录的能力，对于实现神经调节疗法中可塑性研究的体内研究至关重要，而这通过电生理学或功能成像方法可能难以实现。与电生理记录不同——其中记录电极附近不同神经元随时间测量到的高度相似波形使得难以保证在不同日期获得的记录中追踪到同一单元——光学记录中能够直接可视化神经元胞体并利用其相对位置作为标志物的能力，可能使得随时间推移追踪同一神经元变得更容易。在图4(B)中，我们展示了在一个月内进行六次记录会话期间记录细胞的能力。然而，在记录会话之间可以观察到视野存在轻微差异，以及在实验第0天和第12天之间因维修所用显微镜导致的视野旋转。我们尝试使用相关算法对这些实验数据中的记录会话间的单个细胞进行追踪。然而，由于显微镜放置不一致导致会话间视野变化，此尝试未成功。因此，尽管在接受神经调节疗法的动物中，在长达数周或数月的时间内对齐细胞很可能是可行的，但必须注意这些分析需要仔细放置显微镜以获得记录会话间相同的视野。在实践中这被证明是困难的，但包含电子聚焦功能的新一代显微镜技术可能会改善这一过程。

电刺激期间的神经信号识别技术

与双光子显微镜对焦平面外的活动变化不敏感不同，单光子显微镜很容易被离焦的神经活动变化所污染。尽管这些活动变化在某些行为范式中可能不会显著影响神经活动分析，但在施加电刺激时它们可能产生显著影响。因此，在将现有分析技术应用于神经调节范式研究时应加以注意，因为这些技术可能会引入非生理性的神经活动变化。最初，我们应用主成分分析/独立成分分析这一钙成像数据常用分析技术来识别行为动物记录中的细胞活动。使用主成分分析/独立成分分析时，我们观察到附近细胞记录的钙轨迹之间存在人为的高相关性，并且无法区分重叠的细胞体（图S4），这是其他近期研究也已观察到的局限性。这促使我们对不同算法进行了定性分析，以从麻醉动物记录的数据中去除人为添加的刺激诱导的背景荧光变化（图S5）。我们的数据表明，感兴趣区域分析和主成分分析/独立成分分析这些常用于识别钙成像记录中神经信号的算法，并不适合从人为添加的离焦污染中分离出对焦神经元的钙轨迹。与感兴趣区域分析和主成分分析/独立成分分析相比，即使在分析前对数据进行带通滤波，CNMF-E 也能更好地分离出对焦神经元的钙轨迹。这表明 CNMF-E 更适合用于分析在应用神经调节疗法期间获得的数据。这些结果与近期发表的其他背景下比较 CNMF-E 和主成分分析/独立成分分析的结果一致。

单光子显微镜通过在自由行为动物中通过梯度折射率透镜成像，对于在深部脑区获取结果一直很重要，然而通过梯度折射率透镜也可以进行双光子显微镜成像。双光子显微镜最小的离焦荧光可以避免本节描述的许多分析问题，并且具有其他优势，例如对多种指示剂成像，这在使用头戴式单光子系统的研究中尚未普及。使用双光子显微镜的缺点是同时成像的神经元数量较少，并且通常需要固定动物头部，这可能会影响行为实验的结果。

在梯度折射率透镜植入背景下对病理模型和深部脑刺激疗法的验证

为了在小鼠模型中以适当的科学严谨性进行机制研究以阐明底丘脑核深部脑刺激的治疗机制，必须解决一些潜在的干扰因素，包括：在不涉及侵入性留置梯度折射率透镜复杂性的情况下，确立深部脑刺激缓解小鼠模型病理症状的治疗效果；确定留置的梯度折射率透镜对正常和病理行为的影响；以及评估留置的梯度折射率透镜对深部脑刺激治疗功能的影响。

通过头戴式显微镜进行的单光子钙成像主要在小鼠模型中进行，这是因为小鼠遗传品系的可获得性以及在利用病毒载体诱导表达（可用于在特定细胞类型中表达钙指示剂）方面有更广泛的经验。相比之下，历史上的神经调节疗法研究通常使用大鼠或大型动物模型，以便为电极植入提供更大空间，改善对小神经结构的靶向准确性，并减小电极和脑核团尺寸与人类疗法相比的差异。尽管许多通过深部脑刺激治疗的疾病病理模型已在小鼠模型中很好地建立，但在小鼠动物模型中能最好地模拟临床深部脑刺激的电极配置和参数尚不明确。因此，在对深部脑刺激机制进行严谨研究之前，需要验证应用于这些模型中临床相关靶点的深部脑刺激的治疗效果。我们已针对帕金森病6-OHDA小鼠模型中的底丘脑核深部脑刺激开始了这项工作，并在补充方法中提供了初步数据作为参考框架（图S2）。

另一个需要进一步验证的重要考虑因素是组织吸引和梯度折射率透镜植入对神经调节疗法作用机制的影响。例如，该手术过程会破坏运动皮层、纹状体以及其他可能对深部脑刺激治疗效果至关重要的结构内的组织。越来越多的证据表明，在脑内或脑上植入电极所带来的创伤，以及相关外科手术程序造成的创伤，可能导致运动功能缺陷和其他后果。这些缺陷可能仅在采用更复杂的运动功能测量方法时才变得明显。类似地，有证据表明，存在相对较小的慢性留置电极可能会影响远至200微米外附近组织的离子通道表达。因此，理解和预见梯度折射率透镜植入对正常和病理行为以及对治疗干预反应可能造成的潜在干扰至关重要。在某种程度上，可以优化透镜植入的路径，以最小化对推测与所研究行为相关的通路、对该行为的病理影响以及假设参与深部脑刺激治疗效应的回路的影响。人们越来越认为深部脑刺激疗法通过回路机制起作用，该机制除了局部效应外，还依赖于激活电极附近的经过纤维束。例如，目前关于底丘脑核深部脑刺激治疗帕金森病机制的主要理论之一认为，深部脑刺激通过逆向激活运动皮层来破坏基底节-丘脑-皮层运动回路中的病理性同步活动。通常，由于吸引和插入梯度折射率透镜造成的损伤而破坏这些通路，有可能破坏或改变所研究的病理行为或深部脑刺激的治疗机制。

为了解决6-OHDA帕金森病小鼠模型中的这些问题，必须在未来的研究中完成以下工作：直接在目标记录区比较有和无梯度折射率透镜植入的正常行为，以及比较在有和无梯度折射率透镜植入的动物队列中深部脑刺激对病理行为的影响。需要指出的是，改变旨在对同一靶点成像的梯度折射率透镜的接入路径可能会改变病理行为和深部脑刺激的治疗效果；因此，任何对梯度折射率透镜植入路径的更改都需要通过额外的动物队列进行评估。

五、结论

诸如单光子和双光子钙指示剂成像等光学成像技术，作为神经活动的替代指标，已被神经科学家广泛采用，因为这些系统能够记录数百个单细胞，并借助基因编码指示剂提供细胞类型特异性。这些技术特别适合研究协调健康行为的神经活动空间动力学，以及疾病状态下向适应不良动力学的转变。通过头戴式显微镜进行的单光子显微镜具有能够在自由行为动物中进行钙成像的独特优势，并已被用于展示纹状体内细胞类型特异性的空间和时间动力学在帕金森病中如何崩溃以及通过药物治疗如何恢复。尽管本研究描述了应用光学成像，特别是头戴式微型显微镜，来研究底丘脑核电刺激的初步数据，但这些数据仅代表了该技术在研究神经调节对神经元影响方面众多应用的一个例子。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院NINDS R01 NS084975以及The Grainger基金会的支持。

利益冲突声明

DC、MS、JJN和SLO是Inscopix公司的受薪员工。KAL是Galvani Bioelectronics、Neuronoff、NeuroOne和Cala Health的受薪顾问。KAL同时也是Cala Health、Neuronoff、Battelle、BlackFynn和NeuroOne科学咨询委员会的受薪成员。上述财务利益均与本文所呈现的数据无重叠。

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