排尿需要通过副交感、交感和躯体运动神经元对膀胱和尿道括约肌进行精确控制。这一过程涉及一个脊髓-脑干-脊髓的调控回路，其中包含脑桥的巴林顿核。表达促肾上腺皮质激素释放激素的脑桥-脊髓谷氨酸能神经元构成了巴林顿核中最大的细胞群之一。巴林顿核CRH神经元能够引发膀胱收缩，但目前尚不清楚它们仅作为一个简单开关，还是提供高保真的类副交感运动驱动，也不明确激活它们是否真能引发排尿。

研究人员在氨基甲酸乙酯麻醉的CRHCre小鼠中，结合光遗传学与化学遗传学操控以及多位点胞外电生理记录，结果显示，巴林顿核CRH神经元提供一种概率性驱动，根据排尿周期所处的阶段，能够产生协调的排尿或非排尿性收缩。CRH本身对这一过程提供负反馈调节。这些研究结果揭示了一个新的自主排尿推理模型，并强调了脊髓门控回路状态在排尿产生中的重要性。

一、引言

作为尿液，液态废物的产生、储存和排出的调控过程（排尿）在维持生物体健康方面起着关键的内稳态作用。与呼吸类似，这一过程涉及自主神经（副交感和交感）与躯体运动驱动的精确协调，并同时具有随意和自主（非随意）两种控制机制。自主驱动的强大力量，从任何人在远离社会可接受的排尿场所而“内急”时所面临的挑战中可见一斑。自主排尿障碍（导致非随意排尿）常见于膀胱过度活动症、遗尿症以及额叶病变后。巴林顿核，也称为脑桥排尿中枢，是控制排尿的关键部位。目前关于排尿神经调控的主流观点是，来自膀胱的传入信息通过脊髓传递到脑干和中脑的导水管周围灰质，在此处与来自高级中枢（如下丘脑和皮层）的信息进行整合。来自这些中枢的突触驱动被传递至巴林顿核，该核团似乎是排尿的关键指令点。

当膀胱充盈时，达到一个阈值，排尿的神经指令便从巴林顿核传递至腰骶副交感神经元和尿道括约肌运动神经元。损毁巴林顿核或急性离断脑桥会消除排尿。相反，在猫、大鼠或小鼠中，上丘去大脑或离断导水管周围灰质并不会终止排尿。类似地，在麻醉状态下（此时随意排尿的情境因素被去除），也能观察到协调的排尿。这即是自主排尿。电刺激或化学刺激巴林顿核可诱发膀胱收缩。人类和大鼠的功能成像研究发现，在排尿期间脑桥背侧存在活动。因此，巴林顿核在排尿反射中至关重要，它是构成自主排尿的最小脊髓-脑干-脊髓回路的一部分，并被认为是类副交感控制中枢。

巴林顿核中最大的神经元群体之一表达促肾上腺皮质激素释放激素，这一特征在人类和啮齿类动物中均有发现，它们的轴突终止于骶副交感神经元附近。这些巴林顿核内CRH阳性神经元的作用最近通过使用CRHCre小鼠进行特异性光遗传学和化学遗传学操作得到了探索。这些研究表明，巴林顿核CRH神经元是谷氨酸能神经元，其激活可引起膀胱收缩，并且增加其兴奋性会提高排尿的概率。巴林顿核中另一个较小的亚群，即雌激素受体1型阳性神经元，已被证明在尿液社交标记这一随意行为中对控制尿道括约肌起重要作用。此外，初级运动皮层中的一组第5层锥体神经元通过其向巴林顿核的投射，在随意排尿的下行控制中发挥作用。这些功能研究中一个常见的特点是，它们大多聚焦于随意排尿行为，例如雄性在雌性存在下进行的尿液标记行为，这依赖于下行输入至脑干以触发排尿行为。这导致了关于巴林顿核CRH神经元在清醒小鼠排尿过程中作用的不同假说，一些研究得出结论认为它们在排尿产生中起辅助而非主要作用。

在大鼠和猫的巴林顿核附近记录排尿相关神经元的单细胞电活动，显示出多种不同的活动模式，在膀胱收缩期间有些神经元放电增加，有些则减少。这些结果被认为反映了巴林顿核内部的神经异质性，和/或源于附近脑干区域涉及其他盆腔内脏功能调控的复杂神经回路。最近在大鼠脑桥背侧的微丝电极记录报告了巴林顿核附近具有更同质放电模式的神经元，其特征是紧张性活动伴随周期性爆发，这种爆发在时间上与排尿周期的排尿期相关联，但它们也在排尿间歇期显示出爆发活动，这些活动与膀胱压升高无关。这些脑桥神经记录的一个常见技术限制是在记录期间或之后难以识别特定的细胞群体。针对巴林顿核的特定神经元群体，通过在小鼠中使用基因编码钙指示剂的光纤光度法，这一限制得到了解决，研究显示巴林顿核CRH神经元和巴林顿核ESR1神经元的活动分别在排尿/尿液标记前后增强。然而，该指示剂和技术的时空分辨率有限，限制了探究这种活动是驱动还是跟随排尿行为及其伴随的膀胱压升高的能力。因此，关于巴林顿核CRH神经元在排尿，特别是在自主排尿中的确切作用仍不清楚——尽管最近有研究提示，在麻醉小鼠中，它们可能在促进排尿方面扮演更突出（但相对微弱）的角色。通常认为它们作为一个中央控制中心，产生对膀胱的类副交感驱动，但它们是否能通过作用于脊髓回路而单独产生协调的排尿尚不明确。

在此，我们利用光遗传学和化学遗传学干预，以及对已识别巴林顿核CRH神经元在体放电活动的记录，研究了巴林顿核CRH神经元在麻醉小鼠自主排尿周期中的作用。这些研究促成了一个模型的建立，该模型表明这些巴林顿核CRH神经元向脊髓回路提供一个概率性信号，该信号经门控后，要么触发非排尿性膀胱收缩（从而可以推断膀胱充盈程度），要么在达到压力阈值时触发排尿。

二、结果

01.巴林顿核CRH神经元调节排尿

近期研究对于巴林顿核CRH神经元在随意排尿调控中的作用和重要性得出了看似矛盾的结论。为了进一步明确其作用，研究人员利用Cre依赖性腺相关病毒载体，在CRHCre小鼠的巴林顿核CRH神经元中选择性表达了光激活阳离子通道ChR2（图1A–C，图1—附图补充1）。向氨基甲酸乙酯麻醉小鼠的膀胱内持续灌注生理盐水，可产生规律的自主排尿周期（排尿间隔约5分钟，平均灌注速率为23 ± 4 µl/min）。单侧持续性激活巴林顿核CRH神经元（5–20 Hz，20 ms脉宽，465 nm光脉冲，持续三个完整的排尿周期）可提高排尿频率（10 Hz刺激后达到基础值的153.2 ± 15.6%，图1D），表现为排尿间期显著缩短，同时排尿阈值压力降低（10 Hz时为基础值的84.0 ± 4.7%，图1E）。在对照小鼠（注射了AAV-DIO-hm4Di-mCherry而非ChR2的CRHCre小鼠）中给予相同的光照刺激，对排尿频率没有影响。

图1.巴林顿核CRH神经元的光激活缩短排尿周期

（A）将AAV-DIO-ChR2-mCherry注射至CRHCre小鼠的脑桥背侧，三周后通过光纤进行光激活（465 nm）。（B）在氨基甲酸乙酯麻醉小鼠中进行在体记录，光纤定位于脑桥巴林顿核上方，在排尿周期中连续充盈膀胱，同时监测膀胱压和尿道外括约肌活动。（C）立体定位注射AAV-DIO-ChR2-mCherry后的组织学验证，显示脑桥背侧切片中巴林顿核CRH神经元被成功转导。mCherry免疫组化（品红色）显示被转导的巴林顿核神经元，酪氨酸羟化酶（绿色）标记相邻的蓝斑核。（D）对巴林顿核CRH:ChR2进行持续单侧光激活（以5、10和20 Hz频率、20 ms脉宽光脉冲，持续三个排尿周期）可提高排尿频率。（E）持续光激活（5、10和20 Hz）可逆地缩短排尿间期（n = 7只小鼠）。类似地，5 Hz和10 Hz刺激可逆地降低了排尿阈值压力（Friedman检验，Dunn多重比较与刺激前状态比较，*p<0.05，**p<0.01，图1—源数据1）。NVC——非排尿性收缩。膀胱测压图数据见图1—附图补充2。

通过表达抑制性DREADD实现了巴林顿核CRH神经元的化学遗传学抑制（图2A，向CRHCre小鼠双侧注射AAV-DIO-hM4Di）。在持续灌注方案中，给予氯氮平-N-氧化物（CNO，5 mg/kg，腹腔注射）可导致排尿频率持续降低（20分钟时降至对照组的66.8 ± 6.3%，图2B）。同时，阈值压力、充盈量和排尿压均出现升高（图2C）。

图2.巴林顿核CRH神经元的化学遗传学抑制延长排尿周期

（A）利用AAV-DIO-hM4Di-mCherry将抑制性DREADD转导至巴林顿核CRH神经元，通过mCherry免疫细胞化学（品红色）和酪氨酸羟化酶（绿色）标记蓝斑核进行验证。（B）给予DREADD配体CNO（5 mg/kg，腹腔注射）可减慢持续膀胱生理盐水灌注下的排尿频率。（C）与基线相比，巴林顿核CRH:hM4Di神经元的化学遗传学抑制导致排尿阈值（129.7 ± 8.9%）、排尿前灌注量（161.9 ± 16.9%）和排尿压（131.7 ± 6.9%）均升高（RM-ANOVA，Holm-Sidak事后检验，*p<0.05，**p<0.01），而对照小鼠（巴林顿核CRH:ChR2，每组n=9）中CNO无显著影响。在每种情况下，CNO效应在给药后约20分钟达到峰值，随后缓慢逆转。（D）采用间歇性膀胱灌注方案（最大膀胱压为15 mmHg），CNO给药可抑制排尿，（E）排尿潜伏期（从灌注开始至排尿的时间）大幅延长——相当于尿潴留（n=5）（RM-ANOVA，Holm-Sidak事后检验，*p<0.05，**p<0.01）。源数据见图2—源数据1。

02.巴林顿核CRH神经元并非简单充当膀胱压的高保真控制器

为了评估巴林顿核CRH神经元是否作为紧密耦合的前运动驱动作用于膀胱副交感神经元，研究人员在单侧光激活巴林顿核（9.5 ± 0.3 mW，465 nm）的同时记录膀胱压。在初始实验中，单侧光激活巴林顿核CRH神经元（20 ms × 20 Hz，持续5 s）诱发了非排尿性膀胱收缩（eNVC，图3A和B，此时膀胱充盈至阈值容量的一半，n = 7只小鼠）。

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这些eNVC与研究人员之前注意到的由光激活巴林顿核CRH神经元引发的短暂膀胱收缩相似。改变刺激频率和脉冲宽度可产生程度适中的eNVC分级变化，其中20 ms × 20 Hz的方案产生接近最大幅度的反应（3.9 ± 0.8 mmHg，图3C和D）。eNVC从刺激开始到发作的潜伏期稳定在1.3 ± 0.1 s，达峰时间为6.0 ± 0.3 s，平均持续时间为8.2 ± 0.6 s。在每种刺激参数下均存在“失败”情况，即未检测到膀胱反应（图3E）。eNVC的发生概率随刺激频率增加而提高（2.5 Hz时为71.4 ± 7.6%，20 Hz时为97.1 ± 2.5%），其中20 Hz最可靠。持续时间较长的单次光脉冲（1–3 s）也能可靠地产生eNVC。相比之下，对照小鼠（注射了AAV-DIO-hm4Di-mCherry而非ChR2的CRHCre小鼠）的光照刺激对膀胱压没有影响（20 Hz × 20 ms光激活后压力为激活前的101.4 ± 0.6%，n = 3只）。

图3.阶段性光激活巴林顿核CRH诱发膀胱收缩

（A）单侧光激活时的膀胱压记录。（B）阶段性光激活（20 ms × 20 Hz，持续5 s）巴林顿核CRH神经元可诱发非排尿性收缩（eNVC，此时膀胱约为半充盈状态，静态）。这些eNVC具有固定的波形形态和相对恒定的潜伏期。此外，存在“失败”情况，即相同刺激未能诱发反应。（C）巴林顿核CRH诱发的非排尿性收缩参数。阈值按幅度的20%计算，持续时间在阈值压力处测量。潜伏期取从刺激开始至压力达到阈值的时间。（D）eNVC的幅度随刺激频率（脉冲宽度20 ms，持续5 s）和脉冲宽度（频率20 Hz，持续5 s）的增加而增大（n = 7只小鼠）。更高频率的刺激（50 Hz × 10 ms）未显著增加eNVC幅度。单次较长的光脉冲（1–3 s）也能产生分级变化的eNVC。（E）产生eNVC的概率随刺激频率（脉冲宽度20 ms，持续5 s）和脉冲宽度（频率20 Hz，持续5 s）的增加而提高。较长的光脉冲（1–3 s）也能可靠地产生eNVC。（RM-ANOVA，Dunnett事后检验或Friedman检验，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001）。源数据见图3—源数据1。

先前利用伪狂犬病毒进行逆行示踪的解剖学研究提示，支配远端结肠的传入神经元与巴林顿核之间存在通讯通路，并且进一步发现巴林顿核神经元可因远端结肠扩张而被激活。这引发了关于巴林顿核可能同时控制下消化道和下尿路的推测。事实上，有研究报道，在小鼠中光激活巴林顿核CRH神经元后，偶尔（但未进行定量分析）观察到排便现象，暗示其在运动控制中发挥作用。为了探究巴林顿核CRH与远端结肠活动之间可能的关系，在预实验中研究人员置入球囊导管监测压力（n = 2只小鼠）。在正常排尿周期中，远端结肠压力与膀胱压力并不同步（图3—附图补充1B）。此外，尽管光遗传学激活巴林顿核CRH神经元能够引发膀胱eNVC，但并未改变远端结肠压力（图3—附图补充1C和D）。这一初步证据表明，巴林顿核中的这一CRH神经元群体并不参与结肠的运动控制。

研究人员推测，同步募集更多数量的巴林顿核CRH神经元可能更有效地触发幅度更大或更可靠的膀胱收缩。为此，通过双侧表达ChR2并使用双光纤套管，实现对一侧、另一侧或双侧巴林顿核的独立激活（图4A–C）。双侧激活巴林顿核CRH所产生的eNVC幅度（20 ms和20 Hz条件下为7.1 ± 2.0 mmHg，n = 7只小鼠）大于单侧激活任一侧面（右侧或左侧分别为2.9 ± 0.5 mmHg和3.1 ± 0.8 mmHg），尤其是在较高刺激频率下（图4D和E）。双侧刺激对eNVC幅度的影响呈相加效应而非协同效应。双侧刺激提高了产生eNVC的概率（在较低刺激频率下尤为明显，在2.5 Hz时，双侧相较于右侧单独刺激提高154 ± 18%，相较于左侧单独刺激提高158 ± 17%，图4E）。值得注意的是，在膀胱充盈至阈值容量一半的条件下，双侧巴林顿核CRH刺激从未触发排尿。

图4.双侧阶段性光激活巴林顿核CRH诱发的非排尿性收缩幅度大于单侧光激活

（A）单侧或双侧光激活下的膀胱压记录。（B）双侧注射AAV-DIO-ChR2-mCherry。（C）双侧巴林顿核CRH:ChR2转导及光纤靶点的确认（mCherry免疫组化——品红色，TH——绿色）。（D）膀胱压反应，显示单侧或双侧阶段性光激活（20 ms × 20 Hz，持续5 s）巴林顿核CRH神经元诱发的非排尿性收缩（eNVC，此时膀胱约为半充盈状态，静态）。（E）单侧与双侧刺激效果比较显示，双侧刺激诱发的收缩事件幅度更大，可靠性较任一单侧更高（每个点代表单只小鼠数据，n = 7只小鼠，RM-ANOVA，Dunnett事后检验或Friedman检验，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001）。源数据见图4—源数据1。

这些发现支持了巴林顿核CRH神经元能够选择性地产生膀胱收缩的观点，并表明这是一个存在失败情况的概率性过程，而非对膀胱的简单高保真前运动驱动。

03.膀胱压对巴林顿核CRH驱动的反应随排尿周期进程而增强

这引出了一个问题：排尿周期的阶段是否会影响膀胱压对巴林顿核CRH光激活的反应，因为周期相位可能调节巴林顿核CRH神经元的兴奋性。在持续膀胱充盈过程中，研究人员注意到巴林顿核CRH诱发的eNVC幅度随排尿周期进程而逐渐增加（比较排尿周期第2个五分之一阶段与第5个五分之一阶段获得的eNVC，增加了17.0 ± 3.9倍，图5A–D）。这一现象在研究人员此前的记录中也可以观察到（尽管未进行量化或评论）。类似地，通过光激活获得膀胱收缩的概率也随膀胱充盈程度的增加而提高，大多数“失败”情况发生在膀胱充盈度低于40%时（图5E）。eNVC的同一相位依赖性在双侧刺激巴林顿核CRH时也同样明显（图5—附图补充1A和B）。

图5.排尿周期中巴林顿核CRH诱发事件的动态变化

（A）巴林顿核CRH神经元单侧光激活的实验装置。（B）持续灌注膀胱测压，在排尿周期的不同阶段施加阶段性光激活（20 Hz × 20 ms，持续5 s），随着周期进程，诱发的eNVC幅度逐渐增加。（C）随着排尿周期进程，eNVC的幅度显著增加（比较周期第2个五分之一阶段与第5个五分之一阶段的eNVC，增加了17.0 ± 3.9倍）（RM单因素方差分析，Dunnet检验，*p < 0.05，**p < 0.01）。（D）在周期不同阶段施加相同光遗传学刺激（×3）时叠加的膀胱压反应，可触发无反应、eNVC或完全排尿性收缩，这些反应呈现固定的形态和潜伏期。（E）对触发各类反应所处的排尿周期阶段进行分析显示，排尿性收缩在周期后期被诱发的可能性显著更高（每个符号代表单只小鼠中此类事件的平均位置，n = 8）（RM单因素方差分析，Tukey检验，##p < 0.01，####p < 0.0001）。（F）在巴林顿核CRH诱发排尿与自发排尿中，尿道外括约肌活动的爆发模式相似。源数据见图5—源数据1。

04.巴林顿核CRH刺激可条件性触发完全排尿

尽管持续性刺激巴林顿核CRH可提高排尿频率，但在膀胱充盈至50%的情况下，即使采用双侧刺激，阶段性巴林顿核CRH刺激也无法触发完全排尿性收缩。然而，通过在排尿周期中的不同时间点系统地施加刺激，在周期后期（充盈度>50%）激活巴林顿核CRH神经元则可以触发完全协调的排尿（图5B–D）。诱发的膀胱收缩模式和幅度与自发排尿相似，其潜伏期与eNVC相近。此外，排尿是完全的，每次排尿后空虚的膀胱松弛至基础压力水平。

小鼠尿道外括约肌在自发排尿期间表现出爆发性活动，这有助于尿液排出。将伪狂犬病毒注射至膀胱或尿道外括约肌的研究显示，在巴林顿核附近存在标记，表明它是尿道外括约肌控制回路的一部分。然而，近期证据表明，投射至L4-5局部回路中间神经元以调节尿道外括约肌运动神经元的可能是巴林顿核ESR1神经元而非巴林顿核CRH神经元，这一机制类似于腰椎协调中枢。因此，研究人员记录了尿道外括约肌的活动，以探究排尿相关的爆发性活动与巴林顿核CRH激活之间的关系。巴林顿核CRH诱发的eNVC（无论其幅度大小）均未伴随尿道外括约肌活动（图5B和D）。

然而，当巴林顿核CRH激活诱发排尿性收缩时，总能观察到尿道外括约肌的爆发性活动（图5D和F）。这些巴林顿核CRH诱导的排尿，其尿道外括约肌活动在爆发持续时间（自发排尿4.4 ± 0.9秒对比光诱导排尿4.4 ± 1.0秒，n=7，配对t检验，无显著性）和频率（自发排尿22.7 ± 2.7 Hz对比光诱导排尿21.5 ± 3.0 Hz，n=7，配对t检验，无显著性）方面与自发排尿无法区分。这些结果表明，巴林顿核CRH神经元可以触发排尿，且这些排尿在各个方面均与自发排尿相似，但可以在正常排尿周期中更早地被触发。

05.来自巴林顿核CRH神经元的脊髓驱动足以产生eNVC和排尿

研究注意到，巴林顿核CRH神经元的轴突为骶副交感神经元提供特异性支配，但并不支配Onuf核水平的腹角（图6A，图6—附图补充1）。为了探究光遗传学刺激巴林顿核CRH的脊髓轴突是否足以直接产生eNVC，研究人员在脊髓上方放置光纤，并在施加光刺激的同时记录膀胱压。对脊髓施加的光遗传学刺激（20 ms × 20 Hz持续5 s，或单次1 s脉冲）可靠地诱发了膀胱收缩（图6B–D，p=0.025，膀胱半充盈）。这些eNVC的潜伏期往往比直接从脑桥刺激诱发的eNVC更短（1.0 ± 0.2秒对比1.26 ± 0.1秒，n=5）。类似地，在持续膀胱充盈过程中，脊髓激活可以触发完全排尿（图6E）。这些数据支持以下原理：巴林顿核CRH神经元可通过其脊髓投射同时诱发排尿和eNVC。

图6.巴林顿核CRH轴突的脊髓光激活可产生eNVC和排尿

（A）使用AAV-EF1α-DIO-ChR2-mCherry对巴林顿核CRH神经元进行单侧转导。在脊髓L5节段进行免疫细胞化学染色，mCherry（红色）标记转导的巴林顿核CRH轴突，胆碱乙酰转移酶（绿色）标记躯体运动神经元和自主神经运动神经元。巴林顿核CRH轴突呈现侧向化分布，靶向L5节段的副交感节前神经元区域。（B）暴露T11-12椎体水平的脊髓，通过置于脊髓上方的光纤进行光照。（C）光激活（20 Hz × 20 ms持续5 s，或单次1 s脉冲）产生eNVC（相关样本Friedman秩和检验）。（D）两种光刺激模式在eNVC的幅度或可靠性方面无差异（n = 5只小鼠）。（E）在持续充盈膀胱测压过程中，光刺激（20 Hz × 20 ms持续5 s）既可产生完全排尿性收缩，也可产生eNVC。源数据见图6—源数据1。

06.脊髓CRH抑制膀胱对巴林顿核CRH激活的反应

此前有研究提出，巴林顿核神经元在脊髓水平释放的CRH会增强膀胱压反应，但也有其他研究报告了相反的作用，而巴林顿核神经元中CRH表达的基因敲除则未表现出明显表型。如果在排尿周期中CRH的释放确实增加，那么这预计会作为一种正向前馈机制，增强副交感神经反应，进而增强膀胱压对巴林顿核CRH驱动的反应。为验证这一假说，研究人员通过鞘内注射Astressin（一种广谱CRH拮抗剂，5 µg溶于5 µl）评估了其在排尿周期中对巴林顿核CRH诱发的eNVC的影响。与预测相反，Astressin显著且可逆地增加了eNVC的幅度，且这种作用在膀胱充盈时更为明显（给药后20分钟时增加333 ± 75%，p=0.008，n=7，图7）。鞘内注射Astressin还减少了触发排尿所需的灌注量（图7D）。

图7.脊髓CRH抑制膀胱对巴林顿核CRH神经元光激活的反应

（A）评估鞘内注射Astressin（CRH拮抗剂）对双侧光激活巴林顿核CRH神经元所致膀胱压反应的影响。（B）鞘内注射Astressin（5 µg）可逆地增加了巴林顿核CRH诱发的eNVC幅度（n = 7只小鼠）。（C）鞘内注射Astressin对eNVC作用（与溶剂对照相比）的汇总数据，显示幅度的增强在排尿周期末期尤为显著（相关样本Friedman秩和检验，#p < 0.05，##p < 0.01）。（D）即使不进行巴林顿核CRH光刺激，与基线和鞘内注射溶剂对照组相比，Astressin也可逆地提高了排尿频率（n = 9）（与基线比较采用相关样本Friedman秩和检验，与溶剂对照组比较采用Mann-Whitney U检验，*p < 0.05，**p < 0.01）。源数据见图7—源数据1。

07.巴林顿核CRH神经元活动在排尿周期中先于膀胱压变化

来自猫和大鼠的神经记录研究表明，一些推定的巴林顿核神经元在储尿期呈间歇性放电，并在排尿前后放电增加，这与介导驱动膀胱副交感神经元的作用一致。近期使用基因编码钙指示剂GCaMP6对巴林顿核CRH神经元进行的光纤光度法记录表明，这些神经元的活动与排尿周期“同相位”。然而，光纤光度法无法解析巴林顿核CRH神经元在体动作电位发放模式。因此，此前一直无法直接评估巴林顿核CRH神经元放电与膀胱压之间的功能关系。

研究人员使用32通道硅探针记录巴林顿核附近的神经元活动，以检验排尿周期中巴林顿核CRH神经元兴奋性的变化是否能够解释观察到的膀胱压诱发反应的变化。在巴林顿核上方放置一根光纤，用于光遗传学鉴定（图8A）。记录了正常排尿周期中（同时监测膀胱压和尿道外括约肌肌电活动）以及响应光刺激时的细胞活动。通过对巴林顿核附近记录到的信号进行聚类分析，共鉴定出113个独立神经元（n=3只小鼠，图8B、D）。巴林顿核CRH神经元的确切光鉴定（n=12）依据是：对光刺激（20 ms脉冲）表现出可靠的短潜伏期尖峰夹带（图8C），并对较长光脉冲（≥1 s）产生时间锁定、持续性的放电反应（图8C）。

图8.已鉴定巴林顿核CRH神经元的多单位记录

（A）单侧刺激和记录巴林顿核，同时监测膀胱和尿道外括约肌的示意图。（B）免疫组化（mCherry – 品红色，TH – 绿色）确认记录电极的位置（按比例显示，尖端位于组织学轨迹末端）。单个神经元的尖峰波形示意性地显示在其探针记录位点旁。注意，巴林顿核CRH神经元（黄色）聚集在巴林顿核内的位点，而未鉴定的神经元（绿色）位于巴林顿核的上方和下方。第三类未光鉴定神经元以蓝色显示（标记为类巴林顿核CRH），其放电模式与巴林顿核CRH神经元非常相似。（C）巴林顿核CRH神经元通过对短暂光脉冲（20 ms）的短潜伏期反应进行光鉴定，左上方显示一个代表性单个神经元的数据。下方显示已鉴定巴林顿核CRH神经元的群体反应（n=12，通过将尖峰与标准差为10 ms的高斯函数卷积生成的平滑平均放电率曲线）。右侧显示对1 s光脉冲的反应，包括同一单个神经元以及所有巴林顿核CRH神经元的群体反应。注意，它们表现出初始高频反应，随后衰减至约20 Hz的平台期，这可能反映了ChR2电流的动力学特性。（D）三个光鉴定巴林顿核CRH神经元的自相关和互相关图（bin大小为1 ms），其平均尖峰波形显示了良好的分离性以及短潜伏期下一定程度的互相关性。

这些巴林顿核CRH神经元在排尿周期中表现出特征性的活动模式，在排尿时出现爆发性放电（图9A，峰值放电频率为20.5 ± 4.1 Hz）。研究人员记录到第二类神经元群体，其活动模式相似（但不受光激活），在此称为类巴林顿核CRH神经元（n = 32，图9B和图10A、B），以区别于其余未鉴定的神经元（n = 69）。这些类巴林顿核CRH神经元与巴林顿核CRH神经元之间存在短潜伏期的同步性，这在互相关图中显而易见（图9—附图补充1）。巴林顿核CRH神经元和类巴林顿核CRH神经元均显示出与膀胱压明确的时间关系（图9C），其放电在排尿期间先于压力升高并随压力增加而增加。

图9.巴林顿核CRH神经元放电在排尿周期中先于膀胱压变化

（A）巴林顿核CRH神经元表现出与膀胱压同步的爆发性放电模式。本次记录中所有巴林顿核CRH神经元的z-score标准化反应可见相似的活动模式（上方显示单个代表性放电率图）。（B）在同一记录中（及相邻探针位点），观察到另一组神经元（n = 4）表现出与排尿周期同步的类似爆发性放电模式。这些神经元被称为类巴林顿核CRH神经元。类巴林顿核CRH神经元与巴林顿核CRH神经元的自相关和互相关图（见图9—附图补充1）显示它们具有相似特性，并且存在与其他类巴林顿核CRH神经元以及巴林顿核CRH神经元短潜伏期相关的证据。（C）类巴林顿核CRH神经元和巴林顿核CRH神经元（同一实验）放电活动的增加（a），先于并预见了膀胱压的变化（b），且发生在以尿道外括约肌肌电突然增加为标志的排尿开始之前（c）。

图10.巴林顿核CRH与类巴林顿核CRH神经元的群体动态

（A）来自多只小鼠（n=3）探针记录的放电率热图，其中光鉴定巴林顿核CRH神经元（n=12，每只小鼠分别为8、3和1个）和类巴林顿核CRH神经元（n=32，每只小鼠分别为9、19和4个）在与排尿周期相关的放电模式上表现出高度相似性（下方显示归一化压力和跨六个周期的时间）。（B）放电活动相对于排尿周期相位的玫瑰图显示，与未鉴定神经元不同，巴林顿核CRH和类巴林顿核CRH神经元在排尿前的相位十分位数内放电增加（**p < 0.01，单因素方差分析后Tukey-Kramer检验）。（C）绘制放电率与归一化膀胱压的关系图显示呈分级S形关系，放电率增加对应于更高的膀胱压。脑桥背侧其他神经元未见此种关系（虚线标记曲线的95%置信区间，条形表示放电率的标准误）。（D）巴林顿核CRH（及类巴林顿核CRH）神经元与膀胱压之间的互相关在滞后3秒处最强，表明膀胱压变化跟随神经元放电变化（阴影区域表示平均互相关的标准误）。（E）巴林顿核CRH与类巴林顿核CRH神经元群体中成对神经元之间的皮尔逊互相关系数彩色图在排尿期始终最强。

对于巴林顿核CRH神经元和类巴林顿核CRH神经元而言，膀胱压与神经元放电之间存在强烈的S形关系（图10C），而在未鉴定的神经元群体中未观察到这种关系。通过检查放电率与膀胱压之间的互相关来研究这种影响的指向性——结果表明，这两类神经元的放电频率增加均先于膀胱压升高约3秒（图10D）。这些数据表明，巴林顿核CRH和类巴林顿核CRH神经元的放电模式均可预见膀胱压的变化，这符合作为膀胱副交感神经元上游的前运动群体的预期。

记录探针轨迹从其外侧边缘经过蓝斑附近，这增加了部分记录的（非光鉴定）神经元可能是蓝斑神经元的可能性。已有研究显示，在大鼠中蓝斑神经元在排尿前放电增加，因此它们可能属于类巴林顿核CRH群体。为了验证这种可能性，研究人员在相同记录条件下记录了接受CAV2-PRS-ChR2-mCherry直接注射至蓝斑的小鼠的蓝斑神经元，这导致ChR2仅在蓝斑细胞中选择性表达。共记录了29个经光鉴定的蓝斑神经元（n=3只小鼠）。它们表现出特征性的自发放电模式以及对足部夹捏的阶段性爆发活动。蓝斑细胞在排尿前后放电增加——这种模式在单个放电率图和z-score标准化放电热图中均很明显（图10—附图补充1A和B）。然而，这种排尿期周围的激活显著弱于类巴林顿核CRH（和巴林顿核CRH）神经元中观察到的放电增加（图10—附图补充1C）。这表明类巴林顿核CRH神经元极有可能是巴林顿核CRH神经元群体的一部分，只是探针记录到的其中一部分神经元暴露于足够的光照下从而被正式光鉴定。

08.巴林顿核CRH神经元的兴奋性在排尿周期中未发生改变

对巴林顿核CRH神经元在排尿周期中的自发放电率进行分析，显示出与膀胱压高保真控制器预期一致的活动模式。然而，这与光遗传学激活的发现不一致。为了解决这一矛盾，研究人员更详细地研究了周期相位与光诱发巴林顿核CRH活动及排尿之间的关系。

在排尿周期的所有阶段，都可以光兴奋巴林顿核CRH神经元（图11A），并且放电频率的增加（无论是绝对值还是相对值）均不受排尿周期相位的影响（图11B，各排尿阶段范围为22.4 ± 7.7 Hz至24.0 ± 6.5 Hz）。这些数据表明，巴林顿核CRH神经元的固有兴奋性在整个排尿周期中保持不变，而膀胱压反应的增强（17.0 ± 3.9倍）发生在巴林顿核放电输出的下游。

图11.巴林顿核CRH神经元活动条件性驱动膀胱压

（A）光遗传学刺激巴林顿核CRH神经元，显示在排尿周期不同时间点施加光脉冲（1 s × 465 nm，淡蓝色线）诱发的瞬时放电增加。（B）来自巴林顿核CRH神经元的汇总数据（n=6，分布于三只小鼠）显示，在排尿周期的各个阶段，光诱发的放电（无论是峰值放电率（上图）还是放电变化量（下图，蓝色圆点））均无差异。相比之下，eNVC的幅度（见图3）随排尿周期进程显著增加（红色方块）。（C）使用峰值识别算法（幅度0.1–4 mmHg，绿色虚线圆圈）识别出自发性非排尿性收缩（sNVC），并观察到这些收缩之前均伴有巴林顿核CRH活动的爆发。（D）以sNVC为触发点的巴林顿核CRH和类巴林顿核CRH神经元平均放电率图（底部为平均膀胱压轨迹）显示，在sNVC开始前1.5–3秒存在一致的放电爆发（与未鉴定神经元群体不同）。注意，这种关系在打乱的数据中未观察到。（平均放电率 ± 标准差，0.5秒间隔）。（E）线性回归显示，每次巴林顿核CRH爆发中的尖峰数量与后续sNVC的幅度仅呈弱相关（斜率0.03 mmHg/尖峰）。如果排除一个离群点（圈出），这种弱相关关系消失。源数据见图11—源数据1。

为了进一步探究这一命题，研究人员分析了自发性非排尿性收缩与巴林顿核CRH神经元放电之间的关系。sNVC被定义为在充盈性膀胱测压中观察到的膀胱内压阶段性升高，与尿液排出无关，在许多小鼠尿动力学研究中均有报道。在sNVC发生前1.5–3.0秒，巴林顿核CRH神经元出现放电爆发——提示这些收缩是由来自脑桥的信号触发的（图11C和D）。然而，每次巴林顿核CRH爆发的强度与相关sNVC的幅度之间仅存在微弱的关系（见图11E）。对这些数据的线性拟合表明，爆发大小增加20个尖峰（接近观察到的最大范围）仅能解释sNVC大小0.5 mmHg的差异（不到观察到的幅度范围的20%）。即使这种微弱的关系，也依赖于接近排尿时发生的一次大NVC的单一离群值（圈出）。这一发现再次与巴林顿核CRH提供触发信号而非决定膀胱收缩幅度的前运动驱动的观点相一致。

09.膀胱扩张开启巴林顿核CRH驱动的脊髓门控

这提示了一个自主排尿模型，其中脊髓回路门控着向膀胱的输出（示意图见图12A）。该回路中巴林顿核CRH–副交感神经–膀胱传入组成部分，利用现有的节前神经元模型以及来自巴林顿核的下行快速兴奋性突触驱动与膀胱传入突触驱动（基于既往研究中骨盆神经传入记录）的组合，在NEURON环境中进行了建模。随着膀胱充盈，传入驱动频率增加，导致时间总和以及持续的膜去极化，从而提高副交感神经的兴奋性（图12B）。

图12.排尿周期中巴林顿核CRH驱动至膀胱副交感神经元的整合模型

（A）副交感节前神经元模型（在NEURON中实现），接受来自巴林顿核的突触驱动和来自膀胱传入神经元的第二路突触输入。（B）随着膀胱扩张，传入神经元放电频率增加（传入输入来源于既往研究记录），模型副交感节前神经元发生去极化，产生逐渐增强的突触兴奋（亚阈值，不触发尖峰放电）。在周期开始时，对巴林顿核CRH神经元进行20 Hz的同步刺激（蓝色箭头，模拟光激活）不诱发副交感神经尖峰输出，但在周期结束时，这一输出增加至8–10 Hz（上方为扩展时基的轨迹）。

由此产生的由巴林顿核CRH驱动（模拟20 Hz光遗传学驱动）的副交感神经元输出，强烈依赖于排尿周期的相位，在整个排尿周期中输出增加约10倍，与实验数据高度吻合。同时需要注意的是，在排尿周期的早期阶段，巴林顿核CRH输入无法诱发动作电位——从而产生“失败”现象。

10.自主排尿的推理模型

上述观察结果为构建自主排尿周期的新整合模型提供了基础，该模型整合了观察到的巴林顿核CRH神经元的驱动作用以及已知的膀胱传入反馈（图13A，方法部分包含支持该模型的证据总结）。这种传入反馈既调控脊髓副交感神经元的兴奋性（如上文NEURON模型所示），也调控驱动巴林顿核CRH活动的突触发生器的输出。由此产生的反馈回路（示意图见图13B）能够高度再现观察到的排尿周期特征，包括分级变化的NVC、周期性排尿以及巴林顿核CRH的放电模式。

图13.自主排尿的推理模型

（A）从巴林顿核至膀胱副交感神经元的下行输入示意图。副交感神经元接收来自膀胱传入的兴奋性输入——图中显示为通过节段性兴奋性中间神经元中继。注意，巴林顿核CRH神经元既具有快速兴奋性递质（推测为谷氨酸），也通过脊髓释放的CRH介导抑制性作用——可能通过局部抑制性中间神经元发挥作用（未显示）。插图中的方框显示了将巴林顿核CRH神经元活动和脊髓兴奋性与当前膀胱压相关联的逻辑关系（源自B中的模型）。（B）流程图，显示排尿推理模型中的处理步骤。（C）模型输出，显示在三个排尿周期中伴随NVC的膀胱压递增变化，以及产生NVC和排尿的相关巴林顿核CRH放电。

整合模型中脊髓副交感神经元兴奋性的变化，通过一种压力调节的逻辑关系来表征，该关系决定了在给定巴林顿核CRH放电水平下所产生的膀胱压变化。传入驱动也决定了在特定时间区间内巴林顿核CRH高频放电的概率。巴林顿核CRH的膀胱压依赖性突触驱动被表示为一种逻辑关系。通常认为这种突触发器通过导水管周围灰质中继，但也有证据表明（在大鼠中）存在直接投射至巴林顿核的脊髓输入，同样可以充当发生器。此外，近期精巧的研究表明，还存在来自皮层和下丘脑的直接功能性输入。

这种回路组织产生了NVC：其幅度和频率随排尿周期进程而增加的动态扰动。随着压力升高，这些收缩变得更加频繁且幅度更高——最终总和起来，导致膀胱压持续升高。这反过来又提高了巴林顿核CRH的放电率，使得进一步收缩更有可能发生，并将系统推入正反馈循环，压力迅速升高。当压力达到15 mmHg时，发生排尿，推测通过脊髓机制实现，随后排尿周期重新开始。

与实验数据一致，降低巴林顿核CRH放电的变异性（这是NVC的基础）会延迟排尿时间——表明其在此过程中的重要性（图13—附图补充1A）。类似地，增强脊髓副交感神经对巴林顿核CRH驱动的敏感性（如鞘内注射Astressin的实验所见）会增加NVC的幅度并缩短排尿间期（图13—附图补充1C）。我们注意到，额外的巴林顿核CRH神经元驱动（如伴随随意排尿来自高级中枢的驱动）会增加变异性，并可能更早触发排尿。这种效应通过模拟巴林顿核CRH神经元的驱动（20 Hz × 1 s，图13—附图补充1B）得以体现，该驱动既会产生失败、eNVC，也会比原本更早地在周期中触发排尿。

三、讨论

这些发现表明，巴林顿核CRH神经元在排尿中确实起着关键作用。然而，巴林顿核CRH神经元的活动既不是一个简单的排尿开关机制，也不提供对膀胱压的直接驱动（而这正是自主神经指令神经元可能具备的特征）。相反，这些神经元扮演着更为微妙、概率性的角色。它们对膀胱的影响取决于下游副交感运动回路的预激活状态。这表明巴林顿核CRH神经元是一个推理回路的传出支，该回路在排尿周期的储尿期反复评估膀胱状态。当达到排尿阈值时，它们通过一个正反馈回路产生高保真运动信号，驱动排尿所需的膀胱收缩。

这一运行原理与排尿回路组织的模块化层级假说相吻合，即初级脊髓回路提供基本功能，这在新生啮齿动物乃至包括人类在内的其他哺乳动物中都很明显，但其情境敏感性控制较弱。未成熟啮齿动物的排尿时机通常由母体刺激会阴触发（但有趣的是，当膀胱充盈度不足50%时，这种刺激无效）。随着发育，脊髓排尿机制逐渐受巴林顿核的下行控制（包括随意排尿和自主排尿）。我们提出，这种下行控制提供了一个内化信号，取代了额外外部外周感觉输入的需求，从而触发排尿。这种下行控制系统的功能障碍（如脊髓损伤后所见）会导致随意控制丧失，初期出现完全失禁，但随着脊髓排尿反射的重新出现（尽管协调性差），失禁往往会得到改善。本研究通过化学遗传学抑制巴林顿核CRH神经元在实验中模拟了这种情况——导致排尿间期延长和膀胱进行性扩张下的残余尿量增加——表明这是排尿回路中一个必要且关键的组成部分。

我们使用麻醉小鼠的膀胱测压法，在无行为影响的情况下专门研究了巴林顿核CRH神经元在自主排尿核心过程中的作用。这产生了一些与先前关于巴林顿核CRH神经元在排尿中作用的光遗传学研究不同的发现，我们将此归因于随意排尿与自主排尿行为之间的差异。然而，一个重要前提是，麻醉剂本身会改变神经元功能，通常表现为抑制活动，并且已有多位作者发现麻醉剂会影响小鼠排尿的多个方面。许多研究小组采用氨基甲酸乙酯，因为它对自主神经的抑制最小，且麻醉平面稳定。本研究中观察到的膀胱测压曲线和尿道外括约肌的特征活动，与清醒小鼠和无麻醉下去大脑动脉灌注制备中的情况相似。此外，我们发现的巴林顿核CRH神经元作用明显增强这一事实，也表明氨基甲酸乙酯麻醉并非造成我们与清醒小鼠研究结果差异的原因。这仍有待明确验证，我们推测巴林顿核CRH神经元在自主排尿中的作用可能在睡眠小鼠而非清醒行为小鼠中表现最为明显。

啮齿动物也会使用尿液进行社交标记，例如雄性小鼠使用策略性的尿液“点渍”来表达其优势和领地所有权。尽管自主排尿和尿液社交标记是相关的过程，可能共享部分生理机制，但排尿模式也存在差异：与主要排尿相比，社交标记的频率更高（每分钟超过10个尿点），每个尿点的尿量更小。近期研究描述了巴林顿核ESR1神经元在雌性尿液诱发的社交尿液标记中的作用。这些巴林顿核ESR1神经元优先靶向一个脊髓中间神经元回路，该回路被认为参与产生对尿道外括约肌的爆发性驱动，同时引起膀胱收缩。相比之下，在同一研究中，据报道巴林顿核CRH神经元在类似条件下（无主动膀胱充盈）产生排尿的效果相对较差。

研究人员得出了类似的结论，他们比较了激活巴林顿核CRH神经元与激活巴林顿核中所有谷氨酸能神经元（包括ESR1神经元）的效果，发现全局性谷氨酸能激活会产生强制性排尿，表现为尿失禁特征。相比之下，激活巴林顿核CRH神经元仅偶尔产生协调性排尿，且有延迟，只有6%的激活能成功，尽管在麻醉小鼠中这一比例略高，达到17%。这些证据使两个研究组均得出结论，认为巴林顿核CRH神经元在排尿产生中仅起次要的、增强性的辅助作用。考虑到大多数脊髓投射的巴林顿核神经元是CRH阳性，这多少有些令人惊讶，引发了为何它们在排尿中作用如此微小的疑问。事后看来，一项研究发现，通过基因白喉毒素介导消融巴林顿核CRH神经元，在清醒小鼠中产生排尿量增加的表型，并在麻醉小鼠膀胱测压中显著延迟排尿，这或许为这一谜题提供了线索。

我们的研究表明，当膀胱充分充盈时，巴林顿核CRH神经元能够有效触发具有尿道外括约肌爆发性活动特征模式的协调性排尿。这种触发不仅仅是巴林顿核CRH神经元激活所产生的压力升高的简单结果（即开关作用）——因为持续激活巴林顿核CRH神经元会降低排尿阈值，提高排尿频率（而化学遗传学抑制则产生相反效果）。事实上，在排尿前出现幅度超过任何估计的后续排尿阈值的大型自发性非排尿性收缩这一观察结果，对存在简单压力阈值触发排尿的观点提出了挑战。相反，我们认为来自巴林顿核CRH的驱动需要在脊髓水平与膀胱传入的反馈进行整合，才能产生完全排尿——因此，诱发排尿的概率取决于膀胱充盈程度。当膀胱部分充盈时，激活巴林顿核CRH神经元会诱发膀胱收缩（eNVC），但无括约肌活动，这表明对括约肌的驱动也依赖于下游模式发生器的状态，并且在排尿周期的所有阶段并非直接由巴林顿核CRH神经元的放电所启动。我们的初步实验未发现巴林顿核CRH神经元参与远端结肠控制的证据，表明它们是膀胱特异性的。

鉴于雄性自主排尿与随意性尿液标记过程之间的机制差异，两种类型的排尿很可能存在不同的回路驱动。这与以下观点一致：从巴林顿核到下游脊髓模式发生器存在并行通路——巴林顿核ESR1神经元介导的标记行为，无论雄性小鼠膀胱充盈程度如何均可触发；而巴林顿核CRH神经元介导的另一通路则条件性地需要膀胱扩张后才能产生排尿。这也可以解释为何化学遗传学抑制巴林顿核ESR1神经元（而非巴林顿核CRH神经元）会阻断标记行为，而在本研究中，类似地抑制巴林顿核CRH神经元则会抑制自主排尿。本研究未旨在确定巴林顿核CRH神经元在排尿功能中的性别差异，因此纳入了两种性别的小鼠。尽管雌性小鼠的膀胱容量较小，且膀胱测压中的基础压和排尿压较高，但它们的其他参数无差异，并且尿道外括约肌肌电图在排尿时的模式在性质上相似。同样，两种性别对巴林顿核CRH神经元激活/抑制的反应相似，这可能与自主排尿过程中潜在的共同机制有关。

在此背景下，同样重要的是要认识到排尿模式在不同物种间存在一定差异，人类和猫没有表现出与小鼠相同的“喷射”行为，因为它们的尿道外括约肌会松弛以允许排尿——这可能涉及不同的神经回路。然而，也存在许多相似之处，令人惊讶的是，其中包括排尿所需时间与体型大小无关，这表明许多基本运行原理是保守的。重要的是，巴林顿核的损伤或抑制在包括人类、猫、大鼠和小鼠在内的多个物种中均会消除排尿，这与它是核心回路组成部分的观点一致。

本研究中在麻醉小鼠中通过光遗传学鉴定的巴林顿核CRH神经元的放电活动模式，与先前在清醒大鼠巴林顿核记录中观察到的模式相似，也让人联想到在麻醉或去大脑大鼠和猫中鉴定出的一部分神经元，这些神经元在排尿时表现出斜坡样活动。巴林顿核CRH记录中观察到的爆发性活动明显先于膀胱压变化（其滞后时间与光遗传学激活巴林顿核CRH神经元后膀胱压反应的滞后时间相似），表明它们驱动而非响应压力的变化。巴林顿核CRH神经元表现出的尖峰活动模式，也与在小鼠中使用光纤光度法进行的Ca²⁺成像记录一致，尽管我们能够观察到时间上的先行性以及这种活动在排尿结束时迅速消退。同样值得注意的是，在这些记录中（无论是来自巴林顿核CRH神经元还是其附近的任何神经元），均未观察到任何类似于小鼠和大鼠尿道括约肌高频爆发的活动模式——迄今为止，在巴林顿核的任何记录中均未观察到这种活动，这与它由脊髓运动模式发生器（如腰椎协调中枢）产生的观点一致。

巴林顿核CRH神经元对膀胱压影响的概率性特征，初看似乎与本文（以及先前在大鼠巴林顿核记录的E2类神经元和光纤光度法记录中）观察到的其活动与膀胱压之间的明确关系相矛盾。然而，这种关系仅在排尿周期晚期成立，此时巴林顿核CRH神经元确实充当紧密耦合的直接指令神经元。在排尿周期早期则并非如此，此时巴林顿核CRH神经元的活动与膀胱压之间的关系较弱，极端情况下会导致刺激“失败”，无法诱发任何收缩。我们的记录表明，这种情况发生在巴林顿核CRH神经元下游的脊髓水平，因为光遗传学驱动巴林顿核CRH神经元的能力未变，且脊髓激活巴林顿核CRH轴突也显示出失败现象。我们为此作用提出了一个模型，该模型整合了来自膀胱的、逐渐增加并总和但仍处于阈下的传入驱动作用于副交感节前神经元，使得巴林顿核CRH的阶段性活动爆发能够在膀胱充分充盈时逐步产生更多数量的动作电位，从而引发收缩。支持这一观点的是，先前对大鼠巴林顿核的电刺激研究表明，副交感神经运动输出至膀胱的兴奋程度强烈依赖于膀胱充盈程度。这种副交感控制回路的预激活机制值得在脊髓水平进一步研究。

鉴于巴林顿核CRH神经元对排尿的整体兴奋作用（通过快速谷氨酸能信号介导）以及已知的CRH受体激活在细胞水平上的兴奋效应，巴林顿核CRH神经元释放的CRH在脊髓水平对排尿的抑制作用初看起来有违直觉。然而，已有研究报道了CRH对排尿的类似脊髓抑制作用。这种抑制可能起到抑制脊髓副交感回路中节段性兴奋活动的作用。这一过程也可能参与了新生期不成熟的脊髓排尿回路向依赖巴林顿核信号的上位调控的转变。CRH介导的抑制性作用（代谢型）与快速谷氨酸能兴奋性作用（离子型）在作用时程上的差异，可能使得排尿启动时副交感节前神经元能够快速兴奋，但反过来也可能有助于终止排尿并促进膀胱的无拮抗性松弛。CRH在脊髓回路水平的作用机制构成了一个引人关注的治疗干预靶点，有可能在疾病状态下调节排尿反射的增益。

我们注意到，巴林顿核CRH神经元的爆发性活动既出现在排尿之前，也出现在NVC之前。关于NVC的来源（是膀胱固有产生还是其他）及其功能意义一直存在相当多的争论，尽管有观点认为它们提供了一种推断膀胱充盈程度的手段。NVC频率和幅度的增加与下尿路疾病以及脑干下行控制的丧失有关，这或许与CRH介导的脊髓抑制的丧失有关。也有证据表明，在发育早期，NVC由膀胱外周产生，而在成年膀胱中这种协调性降低。我们提供的证据表明，NVC是由巴林顿核的“噪声”概率性驱动产生的，该驱动在每个排尿周期中反复评估脊髓回路的状态，而膀胱压反应的幅度则反映了排尿周期的相位。由此产生的传入信号提供了一种推断膀胱充盈程度的主动方式（类似于评估直肠充盈度的“采样”），并可能启动神经控制回路，甚至可能提供一系列信息，使个体能够有意识地感知膀胱充盈度，并做出关于排尿需求的随意预测。我们还注意到与其他运动系统发育的同源性，在这些系统中，最初在外周产生的自发运动活动，随着发育成熟逐渐在神经系统中以运动表征的形式核心化。

我们提出的这种回路组织模型——来自膀胱的传入反馈既启动脊髓副交感运动回路，也决定巴林顿核CRH神经元的驱动强度（可能通过作为概率性放电开关的导水管周围灰质进行整合）——重现了自主排尿的许多观察特征。NVC的产生提供了关于膀胱充盈程度的推断，传入信号则推动周期进程。脊髓启动机制使得巴林顿核CRH神经元能够产生再生性爆发活动，驱动排尿收缩，而模型中这种大量放电后随之发生的脊髓CRH释放则起到重置脊髓回路的作用，使被动充盈得以恢复。这种回路组织的一个特点是，近期报道的来自皮层的直接随意驱动作用于巴林顿核CRH神经元时，不受脑干以上水平的概率性放电开关的制约，因此如果行为上合适，可以在周期早期触发排尿，但仍取决于脊髓门控的启动状态。假设来自巴林顿核ESR1神经元的并行突触驱动强于巴林顿核CRH神经元，也可能在不依赖同时传入活动的情况下产生副交感活动——从而绕过门控，在行为需求时产生尿液“点渍”。

基于此，我们得出结论：巴林顿核CRH神经元构成排尿回路的关键组成部分，在周期晚期产生对膀胱的前运动驱动。记录和刺激数据表明，这种驱动并非由该细胞群内部的爆发发生器产生，而是来自膀胱感觉传入和上游中枢（如导水管周围灰质，也包括下丘脑和运动皮层）输入整合的结果。我们预测，在这一关键整合位点的控制失败，很可能与急性下尿路功能障碍（如尿潴留）以及慢性疾病（如夜间遗尿症、逼尿肌-括约肌协同失调和膀胱过度活动症，这些疾病中存在逼尿肌收缩和括约肌松弛的失调）均有关联。

四、材料与方法

01.实验模型与受试对象详情

0101.小鼠

所有实验和操作均符合英国1986年《动物（科学程序）法案》，并获得布里斯托大学动物福利与伦理审查机构的批准，在许可证（PPL3003362）下进行。小鼠以群体方式饲养，可自由获取食物和水，并处于12小时光照/12小时黑暗的周期中。

使用CRH基因座下游带有内部核糖体进入位点连接的Cre重组酶基因的敲入小鼠（雌雄兼有，年龄3–8个月），将基因表达限制在巴林顿核CRH神经元内（CRHCre小鼠，杰克逊实验室 #012704）。

0102.量化与统计分析

所有数据均以均值±标准误表示（除非另有说明）。样本量根据经验估算，与其他已发表研究相似。

所使用的统计检验在图注和正文（见结果部分）中均有说明。当p<0.05时认为差异具有统计学显著性。所有实验均包含在不同窝次动物和不同实验批次中重复进行的同一实验范式。重复次数（n）对于膀胱压记录而言等于小鼠数量，对于电生理实验而言等于细胞数量（如相关图注/正文所述）。根据繁殖情况将雌雄小鼠分配至实验。化学遗传学实验中对实验人员进行了药物盲法处理，但光遗传学/细胞记录研究无法实施盲法。

02.病毒载体

用于光遗传学激活实验的2型重组AAV-EF1α-DIO-hChR2(H134R)-mCherry（1.6 × 10¹²病毒基因组/毫升）购自北卡罗来纳大学病毒载体核心设施。用于化学遗传学抑制实验的2型AAV-hSyn-DIO-hM4Di-mCherry（7 × 10¹² vg/ml）购自Addgene。为了选择性靶向蓝斑进行光遗传学激活，使用了CAV-PRS-ChR2-mCherry（2 × 10¹¹ pp/ml）。

03.巴林顿核立体定位颅内注射

为了靶向巴林顿核CRH神经元，使用氯胺酮（70 µg/g）和美托咪定（0.5 µg/g）麻醉纯合CRHcre小鼠，并将其置于配备钻孔注射机器人附件的立体定位仪中。在无菌条件下暴露颅骨后，钻开小孔，通过拉制玻璃针以100 nl/min的速率单侧或双侧注射AAV（每侧三次注射，每次200 nl）。巴林顿核的注射坐标为：前囟后5.3 mm，侧方0.70 mm，脑表面下3.25、3.5和3.75 mm。蓝斑的注射坐标相同，但侧方为0.8 mm。手术操作后，所有小鼠均返回原饲养笼恢复至少21天，以使蛋白表达最大化。

04.光遗传学激活

为了靶向巴林顿核，成年CRHCre小鼠注射了AAV-DIO-ChR2-mCherry（1.6 × 10¹² vg/ml）或AAV-DIO-hM4Di-mCherry（作为对照）。为了靶向蓝斑，成年C57Bl/6小鼠注射了CAV-PRS-ChR2-mCherry（2 × 10¹¹ pp/ml）。小鼠在注射载体后至少3周用于实验。用氨基甲酸乙酯麻醉，并按如下所述准备膀胱测压。来自465 nm LED的光以脉冲形式传递，最大占空比为50%。光脉冲序列用于固定间隔刺激（每60秒一次），或以30秒至90秒之间的随机间隔传递。光纤尖端出射的光功率设定为约10 mW，并在每次实验前后进行测量。对于单侧光激活，光通过锥形光纤传递，光纤沿原始载体注射轨迹向下插入。对于双侧同步光激活，使用双光纤植入体，并通过双光纤跳线连接到两个独立的LED。

对于脊髓的光传递，在皮肤切开后，移除T11和T12椎体棘突之间的软组织。使用473 nm激光通过置于脊髓上方的裸光纤进行照射，以20 Hz、20 ms脉冲持续5秒，或以1000 ms的长脉冲进行刺激。光纤尖端的光功率为29 ± 0.3 mW。

05.化学遗传学抑制

为了抑制巴林顿核CRH神经元，将AAV-DIO-hM4Di-mCherry（7.0 × 10¹⁰ vg/ml）双侧注射到CRHcre小鼠的巴林顿核中（如上所述），并使其恢复至少3周（对照小鼠注射AAV-DIO-ChR2-mCherry）。用氨基甲酸乙酯麻醉，并按如下所述准备膀胱测压。在获得超过五次基线排尿周期后，腹腔注射CNO（5 mg/kg，1 mg/ml储备液）或生理盐水（作为对照）。在一组初始实验中，在CNO注射前后持续向膀胱灌注生理盐水，以研究其对小鼠排尿的影响。随后，为了确定CNO对排尿阈值的影响，采用了周期性充盈-保持方案，即在接近排尿阈值时停止生理盐水灌注，并保持该容量10分钟，或直至排尿发生，然后排空膀胱并重新开始灌注阶段。

06.膀胱测压、肌电图和远端结肠测压

用氨基甲酸乙酯（0.8–1.2 mg/kg）麻醉小鼠，通过2 cm腹中线切口暴露膀胱。将带法兰的导管用荷包缝线固定于膀胱内，并连接到注射泵和压力传感器。根据每只小鼠不同的膀胱容量，调整灌注速率（10–40 µl/min），以使充盈至排尿阈值的时间比例相当（通常为600秒）。使用尖端裸露的绝缘不锈钢丝记录尿道外括约肌，通过30G针头双侧插入耻骨联合近端的尿道外括约肌。将球囊导管插入远端结肠，球囊尖端距肛门40 mm。为监测结肠压力，向球囊导管内注入蒸馏水。

一旦建立规律的排尿周期（通常在开始膀胱灌注生理盐水后约1小时），则测量以下变量（并至少在三个排尿周期内取平均值，见图1—附图补充2）：

基础压：取排尿后达到的最低膀胱压。

排尿阈值：尿道外括约肌肌电开始爆发性活动时的膀胱压，表示排尿开始。

排尿压：排尿期间（尿道外括约肌肌电爆发期）达到的峰值膀胱压。

非排尿性收缩：在排尿制备的充盈期观察到的膀胱压离散性升高（>0.1 mmHg）。

膀胱顺应性：定义为膀胱容量 /（排尿阈值 - 基础压）（µl/mmHg）。

07.去大脑动脉灌注小鼠制备

使用去大脑动脉灌注小鼠制备来研究膀胱充盈对盆神经刺激诱发的膀胱收缩的影响。方法如前所述，简而言之，用异氟烷对小鼠进行终末麻醉，通过剖腹术去除内脏，并插管膀胱。然后冷却小鼠，放血，去大脑，并用探针破坏脊髓以去除所有中枢神经控制。随后将其移至记录槽，通过心脏用温（32°C）林格氏液进行灌注。在灌流液中加入Ficoll-70作为胶体渗透剂。调整流速以达到50–60 mmHg的灌注压。识别盆神经，向近端追踪并剪断，将远端吸人双极刺激电极。对神经施加刺激。用生理盐水充盈膀胱进行膀胱测压如上所述，充盈至压力上限为15 mmHg。在不同膀胱充盈程度（0–70 µl）下检查盆神经刺激对膀胱压的影响。

08.胞外记录与信号采集

使用带有32个通道的15 μm厚硅探针（型号：A1×32-Poly3-10mm-25s-177-A32）在氨基甲酸乙酯麻醉小鼠中记录巴林顿核和蓝斑的活动。对于巴林顿核的记录，记录探针沿与载体注射相同的坐标轨迹下降。一根光纤沿相交的轨迹下降，从尾侧方向靶向该核团（前囟 –8.8，中缝侧方0.7或0.8，与垂直方向成45°角，深度4.9 mm）。对于蓝斑的记录，采用相同的配置，但中缝侧方坐标为0.8 mm。每个通道（177 μm²）与相邻通道间隔50 μm。将参考电极（Ag/AgCl）插入头皮。探针连接到放大器-数字化头stage（INTAN，RHD2132）。信号经放大和滤波（100 Hz–3 kHz），并以30 kHz数字化，然后在Open Ephys系统内进行在线处理和可视化。

09.解剖示踪研究

为了研究巴林顿核CRH神经元向脊髓的投射，将Cre依赖性AAV（AAV-EF1α-DIO-ChR2-mcherry）单侧注射到CRHCre小鼠的巴林顿核中。至少四周后处死小鼠，进行灌注固定以用于免疫组化。为了检查巴林顿核CRH神经元向脊髓的投射，从T11至S2切取40 μm厚的横断面切片，进行mCherry和胆碱乙酰转移酶免疫处理（以勾画运动神经元），然后进行共聚焦成像（详见下文）。

10.脑和脊髓的免疫组化

使用过量戊巴比妥（每只小鼠20 mg，腹腔注射）处死小鼠，并用含4%甲醛的磷酸盐缓冲液进行经心灌注固定。取出脑和脊髓，后固定过夜，然后转移至含30%蔗糖的磷酸盐缓冲液中冷冻保护。使用冷冻切片机以40 μm间隔切取冠状组织切片，并留作自由漂浮的荧光免疫组化处理。组织切片在含0.3% Triton X-100和5%正常驴血清的磷酸盐缓冲液中进行封闭和孵育。在摇床上与一抗在室温下孵育14–18小时。洗涤后，切片再与适当的Alexa Fluor二抗孵育3小时。

使用配备Leica DFC365FX单色数码相机和Leica LAS-X采集软件的Leica DMI6000倒置落射荧光显微镜进行宽场显微镜检查。对于共聚焦和拼图扫描共聚焦成像，使用配备多位置扫描台的Leica SP5-II共聚焦激光扫描显微镜。使用的一抗包括兔抗mCherry（1:4,000）、绵羊抗酪氨酸羟化酶（1:1,000；AB1542）和山羊抗ChAT（1:250；AB144P）。使用的Alexa Fluor 488偶联驴二抗分别针对山羊IgG（1:500）和绵羊IgG（1:400）。使用的Alexa Fluor 594偶联驴二抗针对兔IgG（1:1000）。

11.副交感节前神经元模型设计

使用NEURON构建了脊髓中膀胱副交感节前神经元突触驱动整合的模型。节前神经元基于现有节前神经元模型，通过改变漏电导反转电位，使其静息电位约为–65 mV，进行了轻微修改。通过向胞体添加EXPSYN来模拟来自巴林顿核CRH神经元的突触驱动，该突触由NETSTIM产生的动作电位序列（20 Hz × 1 s）驱动，以模拟对巴林顿核CRH的光遗传学刺激。该突触在单独作为输入触发时是阈下的，尽管在20 Hz驱动时有适度的总和作用（约20%）。第二个快速兴奋性突触驱动用于模拟膀胱传入，作为EXPSYN添加到近端内侧树突。该突触由递增频率的动作电位（来自NETSTIM，基于既往研究中骨盆神经传入的记录）驱动，以模拟膀胱扩张诱发的传入放电在5分钟周期内的增加，代表一个典型的排尿周期。模型文件可从data.bris.ac.uk获取（DOI:10.5523/bris.20l920gl27ufi204brn8ilonsf）。

12.自主排尿模型设计

1201.指导模型设计的证据

1. 巴林顿核CRH神经元的激活可产生膀胱收缩。这是一个存在失败情况的概率性过程。产生NVC的幅度和概率均随刺激频率升高而增加。（图3、4和11E）

2. 膀胱压对巴林顿核CRH驱动的反应随排尿周期进程而增强。在相同的巴林顿核CRH刺激下，NVC的幅度随膀胱充盈而增加（图5），这一效应不能用逼尿肌拉伸来解释（图5—附图补充2）。

3. 当膀胱充盈时，巴林顿核CRH刺激可触发排尿（图5）。

4. 巴林顿核CRH神经元活动在排尿周期中先于膀胱压变化（图9和10）。

5. 巴林顿核CRH神经元的兴奋性在排尿周期中未发生改变（图11）。巴林顿核神经元活动的变化可能源于进入巴林顿核CRH神经元的突触驱动增强，而非对恒定驱动反应性的提高（即巴林顿核CRH神经元的内在特性并不产生爆发）。

6. 膀胱扩张开启巴林顿核CRH驱动的脊髓门控。这是对第3点的假设性解释，同时也解释了实验观察结果，即巴林顿核CRH活动水平并不随sNVC幅度的增加而线性上升（图11）（尽管如第1点所示，在使用光遗传学刺激时，更高的巴林顿核CRH放电率能够产生更大的eNVC）。该门控定位于脊髓水平，还体现在对脊髓水平下行轴突的光激活反应中，该反应仍会出现失败、eNVC和排尿（表明这种概率性门控并非发生在脑干，图6）。

7. 巴林顿核CRH神经元高频放电的概率在排尿周期末期增加。探针记录显示，巴林顿核CRH神经元的放电仅在周期的最后10–15%阶段显著升高（图9E和F以及图10B），并总结为S形关系（图10C）。

1202.模型特征

8. 在周期末期，巴林顿核CRH神经元放电率高于基线水平的概率增加（依据第7点）。我们假设这是由于外部驱动的水平更高（与第5点一致），通过一种将膀胱压转化为巴林顿核突触驱动的机制实现。这在模型中由第一个逻辑函数表示，在图13A中标记为“巴林顿核输入”，该函数明确复制了记录数据中观察到的S形关系。

9. 膀胱对巴林顿核CRH活动爆发的反应表现为钟形曲线的压力升高，宽度约为2秒。这代表一个NVC，其依据是显示巴林顿核CRH活动爆发引起NVC的第1点和第4点。反应的形状依据记录中观察到的反应轮廓进行建模。如果快速连续触发，这些NVC会发生总和（如每个排尿周期末期所见）。

10. NVC的幅度由第二个逻辑函数设定（图13A中标记为“脊髓调制”）。该函数产生在相同水平的巴林顿核CRH放电下，随排尿周期进程基线膀胱压增加而增强的反应（依据第2点和第6点）。同样，这些反应仅在周期末期才变得显著（图5），这证明了曲线的逻辑形状。

11. 这些逻辑函数共同在压力与巴林顿核CRH放电之间形成了一个正反馈回路，该回路产生再生性的大幅度巴林顿核CRH爆发，从而产生排尿性收缩，与真实数据中观察到的反应高度吻合。

12. 当压力达到15 mmHg时视为排尿发生（该模型未包含尿道外括约肌的具体表征，因此需要此任意机制）。

1203.模型实现

自主排尿模型采用迭代算法，在每个周期（假定持续1秒）中更新膀胱压和巴林顿核CRH放电率。在每个时间点，膀胱压增加0.015 mmHg（模拟持续灌注）。通过逻辑函数（模拟传入输入）利用膀胱压水平确定巴林顿核CRH放电的最大水平：

其中，( s_{ ext{max}} ) 为最大放电率，( f_{ ext{max}} ) 和 ( f_{ ext{min}} ) 分别代表放电的最大和最小水平——根据单位数据记录中观察到的放电率，此处分别设为 25 Hz 和 4.3 Hz。梯度和均值分别设为 ( k_s = 4 ) 和 ( m_s = 4.5 )。实际放电率随后通过从随机均匀分布中采样生成，其最大值由 ( s_{ ext{max}} ) 设定。

巴林顿核CRH神经元放电所产生的膀胱压变化，由一个受膀胱压调制的逻辑函数决定（该函数代表脊髓水平副交感神经元的兴奋性水平）：

其中，( s ) 为巴林顿核CRH神经元放电率，( Delta P_{ ext{max}} ) 和 ( Delta P_{ ext{min}} ) 分别为膀胱收缩的最大和最小幅度，( k_p = 0.5 )，( m_p = 6 )。压力变化的最大值取决于当前膀胱压，其关系如下：

13.方程输出

上述方程的输出结果如图13及图13—附图补充1所示。膀胱收缩采用高斯凸函数进行建模，其幅度为 (Delta P_{ ext{max}})，方差为2秒。这些收缩的持续时间为6个时间点（近似于实验观察到的非排尿性收缩特征）。在每个周期开始时，当前压力通过将基线压力（包括持续充盈导致的增量）与由当前及过去周期中巴林顿核CRH触发的膀胱收缩所引起的压力增加相加来计算。

当压力达到15 mmHg时发生排尿，此时膀胱压力以每周期2 mmHg的速率递减（模拟膀胱排空），直至达到低于0.3 mmHg的基线压力，随后周期重新开始。该模型使用MATLAB编写。

在模拟光遗传学激活巴林顿核CRH放电的周期中，放电率 ( s ) 设为20 Hz。为模拟鞘内注射Astressin，将 (Delta P(t)) 逻辑曲线的均值降低至 ( m_p = 5 )。为模拟NVC的减弱，巴林顿核CRH放电水平的方差降低80%，但放电平均水平保持不变。

14.数据分析

1401.多单位数据聚类、波形、自相关/互相关及放电率计算

使用32通道硅探针记录多单位数据，并利用尖峰分选框架“Kilosort”进行聚类。分选分析借助布里斯托大学高级计算研究中心的计算设施完成。在“Phy”中对聚类进行人工整理，以仅选择具有清晰不应期的良好分离单元，并去除伪迹。所有尖峰序列和聚类特征的进一步分析均在MATLAB中进行。

每个聚类的中心通道定义为波形记录幅度最大的探针通道。通过从聚类中采样2000个尖峰（若聚类中尖峰数少于2000，则使用所有尖峰），在中心通道上提取代表性波形。通过将尖峰序列按1 ms间隔分箱，并使用MATLAB函数“xcorr”计算自相关和互相关。激光刺激期间的平均放电率通过将尖峰序列与标准差为10 ms的归一化高斯函数进行卷积来计算，使用MATLAB函数“conv2”。当需要z-score标准化放电率时，使用分箱尖峰计数和MATLAB函数“zscore”。

1402.膀胱压与尖峰序列分析

膀胱压和尿道外括约肌肌电在Spike2中记录，并在MATLAB中分析。为比较多次记录中的膀胱压变化，将每次记录中的膀胱压归一化至0到1之间，其中1代表实验期间记录的最大压力。排尿时间点使用MATLAB函数“findpeaks”识别，并通过肉眼确认正确性。当将膀胱压分为排尿周期不同阶段时，连续排尿之间的周期被等分为所需数量的时间间隔。这些阶段中的尖峰计数通过除以相关时间窗的宽度转换为放电率。这使得能够计算排尿周期各阶段的平均放电率（跨多个周期和细胞）。在图10A中，放电率经过z-score标准化，以便比较在不同动物中记录的多个排尿周期。当使用排尿期/排尿间期时，“排尿期”定义为排尿期间膀胱压峰值两侧各15秒的时间窗；“排尿间期”包含所有剩余时间。

尖峰计数与膀胱压之间的互相关图和皮尔逊相关系数通过将两种数据降采样至1 Hz采样率，进行z-score标准化，并使用MATLAB函数“xcorr”和“corr”进行计算。所有曲线拟合均使用MATLAB曲线拟合工具箱完成。在图10C中，数据拟合为S形关系 ( f(x) = a + frac{b}{1 + e^{c(d - x)}} )，其中 ( a, b, c, d ) 为待定常数。随后在MATLAB中使用“confint”函数计算95%置信区间。

1403.尿道括约肌肌电分析

对于图9所示的肌电数据，在MATLAB中移除超过记录标准差50倍的伪迹。然后使用5秒移动窗口对数据进行均方根滤波，并利用MATLAB函数“movmean”在1000个样本（0.32秒窗口）上进行平滑处理。

1404.非排尿性收缩分析

仅在排尿间期中识别NVC（图11C）。对这些期间的压力测量值进行去趋势处理，并使用MATLAB函数“findpeaks”检测NVC峰值，参数设置为仅选择那些高于基线0.1 mmHg以上、宽度在1.5至8秒之间、且与其他此类峰值至少间隔5秒的峰值。这些提供了良好分离的NVC示例以供分析。对每个细胞的尖峰序列进行分箱（图11C中较长时程使用2秒箱宽；图11D中使用0.5秒箱宽），以提取每个NVC周围的放电率估计值，并检查每个NVC前6秒和3秒开始的1.5秒时间窗内尖峰计数的差异。对于打乱的数据，为每次记录生成一个随机时间向量（仅取自排尿间期），并以相同方式进行分析。每次记录中打乱的NVC时间与真实NVC时间数量相等。为了生成图11D中显示的膀胱压轨迹，在每个识别的或打乱的NVC周围10秒时间窗内提取膀胱压。数值以该时间窗内记录的初始压力值为参考，以提取NVC周围的压力变化。然后对窗口化测量值进行平均，以生成每个识别的或打乱的NVC周围的平均膀胱压变化。

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