1、样本制备
1.1血液样本
推荐新鲜标本尽快检测。
外周血可提取PBMC进行流式检测，或者表面染色后再裂红。
备注：红细胞裂解液（货号555899）工作温度为室温。若血样来源于小鼠或大鼠，工作温度建议升至37℃，适当增加孵育时间。
1.2 细胞样本
悬浮细胞，离心收集。
贴壁细胞，酶消化法收集细胞。
1.3 组织样本
尽量采用新鲜样本
制备方法：机械法（剪碎/网搓/研磨） & 酶法（Accutase/Collagenase/Dispase/Trypsin/Hyaluronidase/Accutase/DNase I等）
机械法：样本量大，较柔软的组织，如肝、脾、淋巴结、胸腺、胚胎组织等
酶法：大部分实体组织，适合富含结缔组织的样本，如食管瘤、乳腺瘤、皮肤瘤等
2、细胞计数
每种试剂都对样本的细胞数量都有明确要求。在饱和抗体浓度下，细胞数量差异不会产生染色差异。在非饱和抗体浓度下，细胞数量差异会对染色强度产生影响。
3、染色
如何确定抗体用量呢？
通常来说商品化的流式抗体提供建议用量（https://www.bdbiosciences.com/zh-cn官网查询，或者产品说明书）。厂家建议预实验时进行抗体滴定，以获得最佳的实验结果。
4、常见染色流程
4.1 表面染色
FVS死活染色（可选）→Fc Block封闭（可选）→表面染色→红细胞裂解（可选）→洗涤上机分析
Fc Block封闭（可选）→表面染色→红细胞裂解（可选）→洗涤→核酸染料（7-AAD、PI）死活染色（可选）→无需洗涤，上机分析
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FVS死活染色
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FVS为粉末状，需贮存于-80℃中。FVS管子先将粉末染料离心至管底，根据说明书要求的量加入DMSO(室温)配备工作液，分装-20℃或者-80℃避光储存。
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1.使用不含叠氮钠和蛋白的1X PBS清洗细胞一次(300 g，5 min)，调整细胞浓度至106个/mL。
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2.向1mL细胞悬液中加入1 uL FVS工作液(1:1000)并立即涡旋混匀(工作浓度最好滴定确定)。
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3.室温下孵育10-15 min，或37℃孵育5-7 min，或2-8℃孵育30-60min。
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4.加入2 mL BD Stain Buffer，离心清洗两次(300 g，5 min)。(该Stain Buffer含蛋白成分,可以中和游离的FVS)
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5.弃上清，重悬细胞后进行后续实验操作。
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推荐工作液浓度 ※※※※
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外周血裂红白细胞 1:1000
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原代细胞 1:1000-1:4000
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细胞系 1:4000-1:10000
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Fc Block封闭
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细胞重悬50-100ul，Fc Block进行封闭。单核细胞，B细胞，DC细胞，NK，巨噬细胞，粒细胞，肿瘤细胞等高表达FcR，封闭FcR，避免假阳性的结果。
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Human BD Fc Block，0.5 mg/ml，1X10e6 cells（50-100ul），推荐5uL/test
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Mouse BD Fc Block，0.5 mg/ml，1X10e6 cells（50-100ul），推荐2uL/test
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室温孵育10min。无需洗涤，直接进行下一步。
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表面染色
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表面标记（样本无红细胞，或者已经裂红去除）
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1、细胞重悬50-100ul，加入相应表染抗体，轻柔涡旋混匀，室温避光孵育15min，或者4℃ 30min。
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2、加入2mL Stain Buffer，300g离心5min，去上清。
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进行下一步胞内/核内染色，或者重悬上机。
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| 3、重悬上机：轻柔涡旋混匀细胞沉淀，加入350uL Stain Buffer重悬细胞后，上机检测。 |
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表面标记（染色后裂红）
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1、取新鲜抗凝（常规是EDTA或肝素抗凝）外周血，上下颠倒混匀10次。
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2、取50或100uL外周血到流式管中，再加入相应表染抗体，轻柔涡旋混匀，室温避光孵育15-30min。
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3、红细胞裂解：加入2mL的1X lysing buffer（最好现配现用，555899），轻柔混匀后，室温避光孵育5-10分钟，然后300g离心5min，去上清。
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4、洗涤：轻柔涡旋混匀细胞沉淀，加入2mL Stain Buffer，300g离心5min，去上清。
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进行下一步胞内/核内染色，或者重悬上机。
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5、重悬上机：轻柔涡旋混匀细胞沉淀，加入350uL Stain Buffer重悬细胞后，上机检测。
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备注：
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可通过测试确定最佳的抗体使用量。根据荧光抗体活性的不同，染色时间可适当延长（> 45 min）。
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1X lysing buffer：555899，1份10X lysing buffer+9份去离子水。
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如果不能及时上机检测，可将已染色的细胞在多聚甲醛（或 BD Cytofix Buffer，货号： 554655，详细操作请见说明书）中 4℃固定 15-30 min，清洗细胞，之后用适量 Stain Buffer 重悬细胞，4℃ 避光保存。固定的细胞需要尽快上机检测。
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4.2 胞内染色（554714）
FVS死活染色（可选）→Fc Block封闭（可选）→表面染色→红细胞裂解（可选）→洗涤→固定破膜→胞内染色→洗涤上机分析
备注：细胞因子在静息状态下几乎不表达。样本需进行刺激阻断，再进行胞内染色。
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推荐细胞因子刺激培养流程
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吸取100ul外周血（肝素抗凝）+400ul培养基（需提前半小时从4℃冰箱拿出平衡至室温）到流式管中，并加入1ul PMA、离子霉素与高尔基体阻断剂的cocktail（货号：550583）
混匀后， 37℃ CO2培养箱避光孵育4-6小时。
（备注：由于加1ul刺激剂误差很大，建议将刺激剂按比例加入IMDM培养基，颠倒混匀后，再按400ul分装至流式管，然后再加入血样。）
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固定破膜（胞内，货号 554714）
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1、固定破膜：弃上清，轻轻涡旋使细胞重悬，加入250 ul Fixation/Permeabilization solution，涡旋混匀，2-8 ℃避光孵育20min。
注意：加入 Fixation/Permeabilization solution 之前 vortex 振荡混匀以避免细胞聚集。
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Perm/Wash：加入1 mL 1× BD Perm/Wash buffer，500 g离心5min，弃上清。
备注：1× BD Perm/Wash buffer：1份10 X Perm/Wash Buffer+9份去离子水。
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3、Perm/Wash：重复第3步。
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4、胞内染色：弃上清，在剩余体积的1× BD Perm/Wash buffer中重悬沉淀（通常为80-100 μL），加入推荐量胞内流式抗体，4℃避光孵育30min。
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5、Perm/Wash：加入1 mL 1× BD Perm/Wash buffer，500g离心5min，弃上清。
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6、重复第5步。
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7、弃上清，加入350uL Stain Buffer，涡旋混匀后上机检测。
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4.3 核内染色(562574)
FVS死活染色（可选）→Fc Block封闭（可选）→表面染色→红细胞裂解（可选）→洗涤→固定破膜→核内染色→洗涤上机分析
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固定破膜（核内 ，货号562574）
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1、固定破膜：弃上清，轻轻涡旋使细胞重悬，加入1 mL新鲜配制的Fix/Perm buffer工作液，涡旋混匀，2-8 ℃避光孵育40-50 min。
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2、Perm/Wash：直接向样本管中加入1 mL Perm/Wash工作液，2-8 ℃离心清洗一次（500 g离心6 min）。
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3、Perm/Wash：弃上清，加入2 mL Perm/Wash工作液，2-8 ℃离心清洗一次（500 g离心6 min）。
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4、胞内染色：弃上清，在剩余体积的Perm/Wash工作液中重悬沉淀（通常为80-100 μL），加入适量胞内荧光抗体，涡旋混匀10秒，2-8 ℃避光孵育40-50 min。
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5、Perm/Wash：轻轻涡旋混匀，加入2 mL Perm/Wash工作液，2-8 ℃离心清洗一次（500 g离心6 min），弃上清。
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6、重复步骤5。
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7、弃上清，加入350uL Stain Buffer，涡旋混匀后上机检测。
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备注：
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Fix/Perm buffer 工作液=1份TF Fix/Perm Buffer (4X)+3份TF Diluent Buffer。
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Perm/Wash工作液=1份TF Perm/Wash Buffer (5X)+4份去离子水。
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