配对抗体指的是可以在一个抗原分子上的两个抗体。通常，配对抗体筛选的方法是双抗夹心ELISA法。本期分享“Antibody Pairs for ELISA”protocal前三节内容。重点介绍了HRP-Streptavidin 配对系统。
本文中心内容是为想要使用抗体对获得结果，且经验丰富的ELISA实验人员介绍一种易于操作的实验手册。在手册中，研发人员记录了他们使用成对抗体进行ELISA的方案，并投入了大量精力来详细说明有助于获得有意义数据的线索。在特定情况下，还提供了缓冲配方和制备样品的具体配方。
文中给出了研究人员在遵循这个实验手册时产生典型结果时的具体数据。灵敏的抗体对试剂盒能根据经验丰富的ELISA研究人员的不同需求，创建优化的检测方法。
本文为使用抗体对来测量天然和重组细胞因子开发夹心ELISA法介绍了两种方法，以使用匹配的抗体对来测量天然和重组细胞因子，以下将详细讨论每一种方法，并给出优化指南。
第一种方法：HRP-Streptavidin：将生物素标记的检测抗体与专有的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素结合在一起。产生的信号将提供非常灵敏和高度特异的数据。
第二种方法 ：应用亲和素包被的平板和直接结合的HRP抗体，该方法特别适用于血清、血浆等生物样品的测定。（见下期）
第一章 抗体配对系统
一、HRP-Streptavidin 配对系统
将生物素标记的检测抗体与专有的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（HRP-Streptavidin）结合在一起能产生非常灵敏和具有高度特定性的数据。：
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单克隆或寡克隆捕捉抗体 0.5mg |
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生物素标记的单抗检测抗体 0.1 mg |
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10瓶一次性重组标准样品 |
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HRP-Streptavidin结合物和易于遵循的滴定图表，利用实际批量数据，足以容纳40个板 |
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通用ELISA和特定批次程序 |
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特定批次的标准曲线示例 |
该方法灵敏度一般可与相应的EASIA™或Cytoscreen™参数相媲美，并且可以从标准曲线中预估。
注意：特定批次的链霉亲和素-HRP滴定图如下：
一般程序
（一）材料和设备：
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包被抗体 |
洗涤缓冲液 |
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故障排除 |
微孔(每片96个) |
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检测抗体 |
精密移液器 |
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规格 |
4°C冷藏 |
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稀释剂 |
37°C 孵化 |
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Streptavidin-Horseradish |
微型板洗涤装置 |
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过氧物酶 |
板盖 |
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中止液 |
带震动功能酶标仪 |
（二） Plate Coating
1. 将包被缓冲液中的包被抗体稀释到随附的试剂盒信息表上推荐的浓度。包被抗体浓度参照小瓶标签。储存或稀释抗体时，避免使用聚苯乙烯容器。如果标准曲线信号不像期望的那样高，可以尝试更高浓度的包被抗体。
2. 在聚苯乙烯微孔板每孔中加入100微升稀释包被抗体。(例如，DyneX Immulon 2 HB或Nunc Maxisorp)，其他聚苯板也可能适用。
3. 盖上盘子，在2-8℃下孵化一夜(12至18小时)
4. 从孔中抽出涂层抗体并轻拍吸水纸以去除多余的液体。
5. 每孔加入400微升洗涤缓冲液，孵育15-30秒，然后吸气。
6. 每孔加300微升封闭液。盖上盘子，在室温下孵化1到2个小时。应避免过度封闭。如果背景比预期的要高，可以尝试用酪蛋白或小牛血清来代替封闭溶液中的牛血清白蛋白。
7. 从孔中抽出封闭液并轻拍吸水纸以除去多余的液体。可以使用反应板。如果不能立即使用反应板，则应在室温下干燥过夜，并在28°C条件下，与干燥剂一起在塑料袋中储存一周。
8. 在开始化验之前，用每孔400微升的洗涤缓冲液清洗3至6倍的微孔板，并在最后一次洗涤后轻拍吸水纸以除去所有多余的液体。任何时候都不要让孔完全干燥。
（三） ELISA 方法
1. 在标准稀释剂/分析缓冲液中或在样品最相关的分析基质中(例如，含有10%胎牛血清的细胞培养液、混合血清、尿液等)稀释标准和样品。请注意，使用不同的标准稀释剂将极大地改变分析物的斜率、稀释极限和回收率。本文引用了标准稀释剂/分析缓冲液配方的指南。使用其他稀释配方需要重新优化分析时间、温度、浓度。
2. 在适当的孔中添加100微升的标准物、样品和对照物质，一式两份。对照包括试剂空白和基质空白。
注：在加入生物素化检测抗体之前，某些检测可能需要先单独孵育(步骤4)标准、样品和对照，有关具体说明，请参阅随附的试剂盒信息表。
3. 将生物素化检测抗体在标准稀释剂/分析缓冲液中稀释至随附的试剂盒信息表建议的浓度。
4. 在除显色原空白外的每个孔中加入50或100微升的稀释检测抗体，盖上培养皿，并按随附的试剂盒信息表上所建议的时间和温度孵育。
5. 从孔中抽出溶液。
6. 用每孔400微升的洗涤缓冲液清洗3至6倍的微孔板，并轻拍吸水纸，在最后一次洗涤后清除所有多余的液体。
7. 按说明书稀释链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物。如果包装插页未另有说明，可在标准稀释剂/检测缓冲液中稀释链霉亲和素-HRP。
8. 每孔加入100微升稀释的链霉亲和素-HRP，盖上微量板，在室温下孵育15至45分钟。(注：稀释和孵化时间视批次而定)。
9. 从孔中抽出溶液。
10. 用每孔400微升的洗涤缓冲液清洗3至6倍的微孔板，在最后一次清洗后轻拍吸水纸以清除所有多余的液体。
11. 按说明书制备TMB(四甲基联苯胺)。
12. 在每个孔中加入100微升的TMB，并按照制造商的说明在室温下黑暗中培养10至60分钟(一般为30分钟)。(注：孵化时间因制造商和批次而异)。
13. 在每个孔中添加50或100微升的终止液(目录号SS01)来停止反应。
14. 在加入终止液后30分钟内，在450 nm处读取微孔板。在停止彩色显影之前，可以在650 nm处读取，以确定是否已获得所需的吸光度值。
15. 计算所有标准、对照和样品在450 nm处的平均光密度。通过在半对数图形纸上绘制每个标准光密度(纵坐标)与标准浓度(横坐标)的关系来构建标准曲线。对于具有自动标准曲线计算能力的板材读取器，对数-对数或四参数曲线拟合算法可以提供最佳的曲线拟合。
16. 根据标准曲线确定每个未知样品的浓度。
表1：缓冲液配方
