形态学检验对微生物鉴定具有导航作用，是每一位微生物检验技术人员必须掌握的技能。在实际工作中经常需要保存涂片标本，以供复检、备检、交流、温习及教学等。革兰染色、抗酸染色、瑞氏染色等涂片通常用封片胶（中性树脂）直接封片保存。此封片方法同病理片封片法，但只适用于干片的封片，对于湿片（指压片制片镜检后的片子，如墨汁染色、碘染找原虫及虫卵、丝状真菌乳酸酚棉蓝染色等）就无法应用。笔者经过多年的研究和工作探索，总结出一种简单实用的湿片封片方法，可长期保存各类湿片，十多年后复检效果如初。本文介绍具体的操作方法。

材料与方法

超净高级封片胶（不含二甲苯，BA-7004，珠海贝索公司），一得阁墨汁（北京一得阁墨业公司），生理盐水、卢戈氏碘液、乳酸酚棉兰染液、10%中性福尔马林固定液均自配[1]，改良 Huber 聚乙烯醇封固剂MYCO-PERM BLUE(美国Scientific Device Laboratory 公司)。

一次性滴管，载玻片(一端为毛玻璃)，盖玻片(22mm×22mm和20mm×20mm)。

图１ 乳酸酚棉蓝染色的双层套封片法流程

加1滴MYCOPERMBLUE(PVA封固剂)到涂有真菌的玻片上，盖上盖玻片。如为小培养盖玻片，可直接将封固剂滴在盖玻片上，再反扣至载玻片上，见图2。有些菌丝生长丰富的真菌用此法封片会产生很多气泡，为避免此现象发生，封片前在小培养的盖玻片上可滴加酒精，使菌丝伏在盖玻片上，再加封固液。将封固后的玻片放置于水平位置晾干2~4d。所有暴露真菌孢子及菌丝的开放式操作过程均在生物安全柜中进行。

充分晾干后的真菌片子可以先行消毒剂浸泡消毒后再归档。玻片归档前应检查玻片信息标注是否完整。湿片封固后最好平放(但平放占地较大，管理较困难)，长时间竖放后大颗粒成分(如细胞、虫卵、孢子等)位置会下沉，但不影响镜检效果。应隔开一定间隙摆放，不可叠放。玻片尽量避光保存，以减缓褪色时间。标本量大的单位可专门设计智能玻片保存柜进行管理，调取方便快捷。

结果

乳酸酚棉蓝染色片双层套封片法封片后直接镜检效果良好，见图3。归档后定期镜检观察封固效果，发现染液未干涸，菌体未褪色，虫体(及卵)细胞未发生固缩、碎裂、溶解等。部分镜检结果见图4~6。

Huber聚乙烯醇封片法封片直接镜检及保存后镜检的效果观察 标本直接涂片经干燥热固定后用PVA封固剂直接封染后的镜检效果见图7。

改良Huber聚乙烯醇封片法直接封片可用油镜观察，见图8。封片前滴加酒精处理，可避免气泡产生，见图9。

讨论

采用双层套封片法封片可长期保存湿片，对于保存少见或难培养的病原形态，提供了一个较为实用的方法。笔者最长观察了14年，染液、菌体以及镜检效果均与初制时无异。影响保存质量最大的因素是封片时封片胶在第一层小盖玻片四周的密封程度，建议初学者使用18mm×18mm盖玻片与22mm×22mm盖玻片搭配，这样可以增加封边的宽度，但对于真菌小培养，18mm×18mm盖玻片有时会影响培养效果，因此技术熟练的操作者可以使用

20mm×20mm盖玻片与 22mm×22mm盖玻片搭配，以满足某些菌株培养的需要。封片加胶量应根据滴管口粗细而定，太少封不住，太多会溢出而在保存时粘连片盒。

用双层套封片法制出来的片子因双层盖玻片太厚，只能在低倍和高倍镜下观察，不能用油镜，这是该方法的不足之处。有些真菌产生的孢子较小，高倍镜下看不清楚，或是要观察某些细微结构就必须使用油镜。为解决这一问题，笔者查阅文献找到了[2]改良Huber聚乙烯醇封片法 ，封片后可以进行油镜观察，经固定的真菌结构可保存数年不变。由于MYCOPERMBLUE试剂为进口试剂，价格昂贵，笔者正在进行国产化试验，希望国内同行能在短期内使用到国产改良Huber聚乙烯醇封固剂。

参考文献

[1]陈东科,孙长贵.实用临床微生物学检验与图谱[M].北京:人民卫生出版社,2011:7785.

[2]DaviseH.Larone.Medicalyimportantfungi:aguidetoidentification[M].5thEd.Washington,DC:ASMpress,2011:371372.