摘要：血凝抑制试验在禽流感和新城疫的防控中有着重要的作用，该方法的影响因素很多，4单位抗原就是其中一个重要的因素。本文通过比较不同的4单位抗原配置方法、校对方法，探究如何又快又准地配置4单位抗原。试验表明，通过稀释法测得的4单位抗原效价更加准确，多重校对法可以直接推算出微调的方法，保证二次校对的准确性，对基层兽医实验室工作者有着重要的意义。

       血凝抑制试验是检测禽流感和新城疫抗体水平的主要方法，在基层动物疫病防控中心实验室中有着广泛的应用。但是，该方法受较多因素的影响，结果常有较大偏差，其中4单位抗原的配置是困扰基层实验室工作者的最大问题。本实验将新城疫试验抗原按不同倍数稀释后，测得其平均效价，配置而得的4单位抗原较准确；本文还介绍了多重校对法，可以直接推算出微调抗原的方法，为4单位抗原的配置和校对节省了较多时间，对基层实验室工作者有较大的帮助。

1  材料

1.1  试剂

      鸡新城疫病毒血凝抑制试验抗原（中国兽医药品监察所，批号：201611）、1%鸡红细胞悬液、PBS溶液（0.1 mol/L，pH值7.2）。

1.2  仪器设备及耗材

      微量振荡器（江苏省金坛市医疗器械厂）、96孔V型反应板、8道或12道移液器（10～100μL）、移液器滴头（美国Axygen）、加样槽等。

2  方法

2.1  抗原的效价测定

2.1.1  原倍法直接测量抗原的效价　将25μL新城疫抗原依次倍比稀释，测定原倍抗原的血凝效价，具体见血凝试验。

2.1.2  稀释法测抗原的平均效价　　将新城疫抗原按照原倍(1)、1/3、1/5、1/7倍进行稀释，分别测量抗原效价，具体见血凝试验。按照公式测定抗原效价的平均值，从而准确地测量抗原的效价。

2.2  4单位抗原的配置　分别按原倍法和稀释法测的抗原配置4单位抗原，抗原的效价值除以4即为稀释倍数。

2.3  4单位抗原的校对

2.3.1  直接校对法　将25 μL的4单位抗原用PBS等量倍比稀释，使每孔含有2 HAU、1 HAU、0.5 HAU、0.25 HAU（见图1，1～5孔），每孔补加25μL PBS，再加入1%红细胞悬液。

2.3.2  多重校对法

      在直接校对法的基础上，增加6～10孔的操作。即6孔中加入50 μL PBS，将25 μL的四单位抗原用PBS等量倍比稀释（6孔弃去25 μL PBS，保证体系一样），使每孔含有4/3 HAU、2/3 HAU、1/3 HAU、1/6 HAU（见图1，1～10孔），每孔补加25 μL PBS，再加入1%红细胞悬液。

3  结果

3.1  抗原效价的测定

      原倍法直接测量新城疫抗原的效价为8log2（如表1）。

      稀释法分别测原倍、1/3、1/5、1/7倍的效价为：28、26、25、24，可以按照表1计算抗原的平均效价为27.49，则该抗原的平均效价为180。

3.2  4单位抗原的配置及校对

　 根据原倍法测得的抗原效价，抗原做64（256/4）倍稀释即可得到四单位抗原；而稀释法将抗原45（180/4）倍稀释。然后对2种方法配置的4单位抗原进行校对，结果原倍法配置的4单位抗原偏小，出现1、6孔完全凝集，其他孔有不同程度的拉线；而稀释法配置的抗原如图1所示，较标准。

3.3  4单位抗原的微调

　　由于原倍法配置的4单位抗原偏小，需进行微调，经推算需再加入1/3的抗原。再次用多重法进行校对，则出现图1的结果，说明微调后的4单位抗原较准确。

4  讨论及结论

      4单位抗原是血凝抑制试验的重要环节，其准确性对试验结果有重要的影响。抗原浓度高时，HI抗体效价就会降低；反之则会有所升高。抗原效价测量是否准确，决定了配置而得的4单位抗原准确性。稀释法测定而得的抗原效价通过稀释多次测量获得抗原的平均值，其结果更加接近准确值。

       4单位抗原需现配现用，且用之前要进行校对，保证其准确性。按照直接法校对的4单位抗原只能判定配置结果是否准确，针对校对结果不准确，并没有好的方法，许多文献均说明要进行微调后进行校准，但是均未说明如何微调。而多重校对法，能够准确地计算出需加入的抗原（PBS）的量，保证了微调后的4单位抗原的准确性。最多2次校对即可准确地配置好4单位抗原，避免了反复校对，影响血凝抑制试验的进度，具有较大的参考意义。