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固定的概念

应用各种方法使病理标本尽量保持其离体前状态的过程称为固定（fixation）。

病理标本（样本）离体后，由于微环境的变化将发生自溶和（或）***，使其结构破坏。固定的目的和机制是：①使蛋白质凝固，终止或减少分解酶的作用，防止自溶，保存组织、细胞的离体前结构状态，包括保存组织或细胞的抗原性，使抗原不失活，不发生弥散。②保存组织、细胞内的蛋白质、脂肪、糖原、某些维生素及病理性蓄积物，维持病变的特异性特征。③使上述物质转为不溶解状态，防止和尽量减少制片过程中人为的溶解和丢失。④起助染作用。

固定方法有：①物理学方法，如低温冷冻，干冰（dryice，即固态无水碳酸）冰冻真空脱水，石蜡渗入法。②化学方法，采用各种化学溶液作固定液，使组织细胞进入固定状态。这是国内最常用的方法。

固定应在标本离体后尽快进行，小标本可在取材后直接放入固定液内，大标本应在手术结束前或结束后迅速放入固定液内。

固定液与标本的比例不得少于标本体积得5倍。有特殊要求者应事先选定相应得固定液，如欲查糖原，应选择无水乙醇作固定液等。

固定得时间应适当，微小标本（如胃粘膜等）2～4h即可，大标本应置放12～24h，但亦不要过久，以免影响抗原性，造成免疫组化操作中得困难。

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常用固定液及其配制

固定液分单纯固定液和混合固定液。

一、甲醛（formaldehyde）

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是无色气体，易溶于水成为甲醛溶液。易挥发，且有强烈刺激气味，常用得是37％～40％得甲醛溶液，商品名为福尔马林（formalin）。用作固定的浓度习惯为10％福尔马林（即1份甲醛溶液加9份水配制而成），实际含甲醛4％。

10％福尔马林渗透力强，固定均匀，对组织收缩少。对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定剂。

经福尔马林固定时间长的组织，易产生黑色的沉淀，称福尔马林色素。

二、乙醇

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无色液体，易溶于水，它除可作为固定剂外，还可作为脱水剂，对组织有硬化作用。固定用一般是80%~95%浓度，乙醇渗透力校弱，它能溶解脂肪，核蛋白被沉淀后，仍能溶于水，因此核的着色不良。

三、中性甲醛液（混合固定液）

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甲醛（浓）120ml，加蒸馏水880ml,磷酸二氢钠（NaH2PO4?H2O）4g，磷酸氢二纳（Na2HPO4）13g。此液固定效果比单纯10％福尔马林要好。

四、AF液（混合固定液）

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95％乙醇90ml，甲醛(浓)10ml。也有配方是95％乙醇85ml，甲醛（浓）10ml，冰醋酸5ml。

此液除有固定作用外，兼有脱水作用，因此，固定后可直接入95％乙醇脱水。

以上4种固定液中，以中性甲醛为首选，其次为10％福尔马林，乙醇应尽量不用。

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免疫组化常用固定液选择问题

*取材后的组织需立刻投于固定剂中

-固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态；

-对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。

*常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同，各有优缺点。

-醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）

-醇类（常用乙醇）

-其它 （丙酮）

(1) 醛类

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*甲醛(福尔马林)应用最广

-原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。

-优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。

-缺点：

*甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；

*醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍；

*分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。

可造成假阴性的染色结果。

-注意事项：

*缩短固定时间，降低固定温度(4℃)，为此组织块不宜过厚。

*改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.2～7.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10％甲醛固定液，减少固定液pH的变化。

*固定后充分水洗以减少分子间交联。

*切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现(抗原修复)。

*戊二醛：

-穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。

*多聚甲醛(常用4%)：

-可用于免疫电镜；

也可用于免疫荧光染色。

*主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。

(2) 醇类

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* 最常用的醇类固定剂是乙醇。

-其固定作用：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。

-优点：穿透性强、抗原性保存好。

-缺点：

*脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。

*乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。

(3) 其它固定剂

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*丙酮：

-对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少 用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。
（1）10%甲醛：对组织渗透性强，固定均匀。对组织膨胀约5%，经酒精脱水时有较大的收缩。能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，长期用其固定的组织使组织变为酸性，不利于染色，特别是细胞核的着色。经自来水冲洗6~24小时后，可以使其酸碱中和，并减少结晶。

（2）4%多聚甲醛：对组织穿透性好，组织收缩小，对大多数抗原物质保存较好，特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好。固定的时间不宜太长，以24小时以内为宜，适用于免疫组织化学染色。

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