1、化学发光磁酶免疫分析法检化学发光磁酶免疫分析法检 测梅毒螺旋体抗体测梅毒螺旋体抗体 答辩人：答辩人： 杨璐杨璐 导导 师：师： 崔亚丽崔亚丽 教授教授 李如琳李如琳 副教授副教授 西北大学西北大学 Contents 梅毒梅毒 梅毒螺旋体梅毒螺旋体 严重性传播疾病严重性传播疾病 发病率不断上升发病率不断上升 20102010年年4 4月国家卫生部全国法定月国家卫生部全国法定 传染病疫情报告：传染病疫情报告： 全国乙类法定传染病发病第全国乙类法定传染病发病第位位 梅毒检测梅毒检测：孕前检查孕前检查 供血者血液常规筛选检查供血者血液常规筛选检查 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 19

2、96199820002002200420062008 发病率（发病率（10-5） 年份年份 西北大学西北大学 v医院常用梅毒螺旋体免疫学检测方法医院常用梅毒螺旋体免疫学检测方法 快速血浆反应素环状卡片实验试验（快速血浆反应素环状卡片实验试验（RPR）和甲苯胺）和甲苯胺 红试验红试验(TRUST) 初筛初筛 假阳性高假阳性高 判断主观判断主观 梅毒螺旋体血球凝集试验（梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）和和梅毒螺旋体明胶梅毒螺旋体明胶 凝集试验（凝集试验（TPPA） 确认确认 判断主观判断主观 操作繁琐操作繁琐 要求严格要求严格 梅毒梅毒ELISA实验实验 灵敏度有待进一步提高灵敏度有待进一步提高

3、 西北大学西北大学 化学发光免疫分析技术化学发光免疫分析技术 免疫分析系统免疫分析系统 化学发光分析系统化学发光分析系统 （抗原、抗体，免疫反应）（抗原、抗体，免疫反应） 免疫分析高特异性免疫分析高特异性及及化学发光高灵敏度化学发光高灵敏度于一体于一体 （酶的化学发光底物或氧化剂）（酶的化学发光底物或氧化剂） 西北大学西北大学 梅毒螺旋体抗体化学发光法检测梅毒螺旋体抗体化学发光法检测 灵敏度极高灵敏度极高 自动化自动化 化学发光技术化学发光技术 灵敏度极高灵敏度极高 较宽线性范围较宽线性范围 精密度高精密度高 容易实现自动化容易实现自动化 广泛应用于医学、食广泛应用于医学、食 品、分析化学等领

4、域品、分析化学等领域 西北大学西北大学 v化学发光法检测梅毒的商品化试剂盒化学发光法检测梅毒的商品化试剂盒 国外国外： Abbott：ARCHITECT Syphilis TP 磁粒磁粒 国内国内： 北京科美东雅生物技术有限公司：梅毒螺旋体抗北京科美东雅生物技术有限公司：梅毒螺旋体抗 体化学发光试剂盒体化学发光试剂盒 酶标板酶标板 西北大学西北大学 聚乙烯酶标板聚乙烯酶标板 板表面包被面积板表面包被面积 有限有限 反应空间有限反应空间有限 灵敏度受限灵敏度受限 化学发光化学发光 固相载体的选择固相载体的选择 磁性微粒磁性微粒 比表面积大比表面积大 分散性好分散性好 易分离易分离 灵敏度更高灵敏

5、度更高 西北大学西北大学 v金磁微粒化学发光检测方法金磁微粒化学发光检测方法 西北大学西北大学 包被包被 反应反应 检测检测 实验原理实验原理 西北大学西北大学 第一部分第一部分 方法的优化方法的优化 HRP标记抗原稀释液的确定标记抗原稀释液的确定 包被抗原最佳用量及酶标包被抗原最佳用量及酶标 抗原最佳工作浓度的确定抗原最佳工作浓度的确定 样本稀释液的确定样本稀释液的确定 保护剂的选择保护剂的选择 西北大学西北大学 HRP标记抗原稀释液的确定标记抗原稀释液的确定 a PBST+20%小牛血清小牛血清 b PBST+0.1%BSA c PBST+0.5%BSA d PBST+1%BSA e PB

6、ST+1.5%BSA 降低非特异性吸附降低非特异性吸附 ： 加入非特异性蛋白与表面活性剂加入非特异性蛋白与表面活性剂 阴性样本的发光值阴性样本的发光值 西北大学西北大学 包被抗原和酶标抗原最佳工作浓度的确定包被抗原和酶标抗原最佳工作浓度的确定 抗原抗原包包 被被量量(ng/孔孔) 酶标酶标 抗原稀释度抗原稀释度 70140210280350 1:2000 P N 660 27 1652 56 2954 60 3945 67 7336 67 1:3000 P N 217 42 744 57 1735 50 2494 64 4947 60 1:4000 P N 137 46 543 50 1538

7、 50 1816 56 3171 54 1:5000 P N 140 42 478 50 1181 42 554 34 2943 34 1:6000 P N 121 42 319 38 657 42 494 34 2019 27 最佳抗原包被量最佳抗原包被量：210ng/孔；孔；最佳酶标抗原工作浓度最佳酶标抗原工作浓度：1：3000 西北大学西北大学 样本稀释液的确定样本稀释液的确定 阳性血清阳性血清 稀释倍数稀释倍数 检测结果检测结果 1PBS生理盐水生理盐水 PBS+0.1%BSA 正常人血清正常人血清 1:25+ 1:50+ 1:100+ 1:200+ 1:400+ 1:800+ 1:1

8、600+ 1:3200+ 1:6400+ -+ -+ 1:12800-+ 1:25600-+ -+ - 1:51200- 最佳样本稀释液：最佳样本稀释液： PBS+0.1%BSA 检测灵敏度与正常人检测灵敏度与正常人 血清相当血清相当 西北大学西北大学 保护剂的选择保护剂的选择 保护剂保护剂X X对对HRP标记抗原的保护作用良好标记抗原的保护作用良好 HRP标记抗原置于标记抗原置于37、放置、放置6天天 西北大学西北大学 保护剂保护剂X X对包被抗原金磁微粒的保护作用对包被抗原金磁微粒的保护作用 包被抗原金磁微粒置于包被抗原金磁微粒置于3737、放置、放置6 6天天 稳定性很好稳定性很好 西北

9、大学西北大学 保护剂保护剂Proclin300与保护剂与保护剂X的对比实验的对比实验 选定浓度为选定浓度为0.05%的的Proclin300作为保护剂作为保护剂 西北大学西北大学 保护剂保护剂Proclin300对对HRP标记抗原的保护作用标记抗原的保护作用 含含0.05%Proclin300的的 HRP标记抗原置于标记抗原置于37、放置、放置6天天 西北大学西北大学 第一部分实验小结第一部分实验小结 在初步建立的化学发光检测梅毒螺旋体在初步建立的化学发光检测梅毒螺旋体 抗体方法的基础上进一步优化，确定各最佳抗体方法的基础上进一步优化，确定各最佳 工作条件如下：工作条件如下： 1. HRP标记

10、抗原稀释液：标记抗原稀释液：PBST+1% BSA作为作为HRP 标记抗原稀释液；标记抗原稀释液； 2. 抗原包被量：抗原包被量：210 ng/孔孔(7 g/mg )； 3. 酶标抗原稀释浓度：酶标抗原稀释浓度：1: 3000时，发光强度达到最时，发光强度达到最 佳；佳； 4. 血清样本稀释液：血清样本稀释液：PBS+0.1%BSA； 5. 保护剂：浓度为保护剂：浓度为0.05%Proclin300的的PBS缓冲液。缓冲液。 西北大学西北大学 参考值参考值 对比实验对比实验 稳定性稳定性 标准曲线标准曲线 精密度精密度特异性特异性 第二部分第二部分 实验方法的评价实验方法的评价 西北大学西北大

11、学 稳定性稳定性 化学发光试剂分别置于化学发光试剂分别置于4冰箱和冰箱和37生化培养箱中放置生化培养箱中放置6天天 将阳性血清分别稀释将阳性血清分别稀释50倍、倍、100倍、倍、200倍、倍、400倍后进行检测倍后进行检测 西北大学西北大学 精密度精密度 国家标准国家标准 （15%） 批内差批内差： 2.86%5% 次数次数检测结果检测结果阳性阳性检测检测 平均值平均值 RSD （%） 1 P N 5423 15 5735 23 6249 15 6057 15 5747 15 5949 23 58605 2 P N 5998 23 5923 23 6394 15 6125 15 5876 23

12、 5972 15 60483.10 3 P N 6074 15 6249 15 6302 23 6515 15 6156 15 6022 15 62192.86 4 P N 6287 15 6166 23 6743 23 6534 15 5983 23 6012 23 62884.77 5 P N 5923 23 5799 15 6401 15 6137 23 6117 15 6093 23 60783.38 西北大学西北大学 批间差：批间差： 5.1%9.7% 西北大学西北大学 次数次数 检测结果检测结果 批次批次1 批次批次2 批次批次3 阳性检测阳性检测 平均值平均值 RSD （%） 1

13、 P N 3895 15 3918 8 4829 15 4822 15 4487 8 4692 15 44419.7 2 P N 4329 15 4052 8 4723 15 4810 15 4541 15 4752 8 45346.5 3 P N 3987 8 4189 15 4428 8 4783 8 4431 15 4246 8 43446.2 4 P N 3995 8 4096 8 4624 15 4742 8 4267 8 4368 15 43496.7 5 P N 4016 15 3979 8 4572 15 4226 8 4146 15 4144 15 41815.1 质控标准品

14、质控标准品1010次重复测定结果次重复测定结果 质控品：抗质控品：抗-TP标准物质（标准物质（2NCU/mL） 相对标准偏差：相对标准偏差：5.42% 西北大学西北大学 标准曲线标准曲线 将梅毒螺旋体抗体质控标准品（将梅毒螺旋体抗体质控标准品（4 NCU/mL）梯度）梯度 稀释，在稀释，在0.25 4 NCU/mL范围内线性良好范围内线性良好 Y = 599.1X-165.9 R2 = 0.9980 西北大学西北大学 参考值（临界值确定）参考值（临界值确定） 检测检测100100例临床阴性血清样本例临床阴性血清样本 临界值：临界值： P/N2.8，计算得出该方，计算得出该方 法的临界值为：法的

15、临界值为： COV=72.8 PX+3SD，计算可得临，计算可得临 界值为：界值为：COV=47.6 P/N2.1，计算可得临界，计算可得临界 值为：值为：COV=54.6 发光值发光值=54.6 =54.6 西北大学西北大学 特异性特异性 阴性符合率均为阴性符合率均为100% 8080例临床血清样本例临床血清样本 20 20例乙肝阳性血清例乙肝阳性血清 样本（样本（TPTP阴性）阴性） 20 20例丙肝阳性血清例丙肝阳性血清 样本（样本（TPTP阴性）阴性） 本次实验：本次实验：COV=N2.1=54.6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0204060801

16、00 COV=54.6 8080例阴性血清样本例阴性血清样本 发光值发光值 西北大学西北大学 乙肝阳性样本检测结果乙肝阳性样本检测结果丙肝阳性样本检测结果丙肝阳性样本检测结果 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0102030 COV=54.6COV=54.6 发光值发光值 发光值发光值 乙肝血清样本乙肝血清样本丙肝血清样本丙肝血清样本 阴性符合率均为阴性符合率均为100% 西北大学西北大学 化学发光磁酶免疫化学发光磁酶免疫 分析法与分析法与商品化化商品化化 学发光试剂盒学发光试剂盒

17、对比对比 灵敏度比商品化化灵敏度比商品化化 学发光试剂盒提高学发光试剂盒提高 4倍倍 阳性血清阳性血清 稀释倍数稀释倍数 检测结果检测结果 商品化试剂盒商品化试剂盒 化学发光磁酶免法化学发光磁酶免法 (MECLIA) 1:100+ 1:200+ 1:400+ 1:800+ 1:1600+ 1:3200+ 1:6400-+ 1:12800-+ 1:25600-+ - 1:51200- 西北大学西北大学 化学发光磁酶免法化学发光磁酶免法 （COV=N2.1=53.2） 商品化化学发光试剂盒商品化化学发光试剂盒 COV=N2.1=26151） 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

18、 100 0102030 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 0102030 特异性对比实验：特异性对比实验：二者相当，阴性符合率均二者相当，阴性符合率均100% 发光值发光值 发光值发光值 20例阴性血清样本例阴性血清样本 20阴性血清样本阴性血清样本 COV=53.2 COV=26151 西北大学西北大学 西北大学西北大学 第二部分实验小结第二部分实验小结 国家法规国家法规： 体外诊断试剂注册管理办法体外诊断试剂注册管理办法 分析性能评估资料：分析性能评估资料：分析灵敏度、分析特异性、检测范围分析灵敏度、分析特异性、检测范围 批内不精密度、批间不精密度

19、等项目批内不精密度、批间不精密度等项目 参考值（参考范围）确定参考值（参考范围）确定 稳定性研究资料稳定性研究资料 发光免疫分析试剂生产及质量控制技术指导原则发光免疫分析试剂生产及质量控制技术指导原则 根据各个试剂盒的企业标准或者制检规程进行检验，检根据各个试剂盒的企业标准或者制检规程进行检验，检 验指标一般包括准确性、灵敏度、特异性、精密性（批内验指标一般包括准确性、灵敏度、特异性、精密性（批内 差）、相关性等，均应达到相应的质量标准。差）、相关性等，均应达到相应的质量标准。 v稳定性：稳定性：4，及，及37加速破坏性实验，均显示保加速破坏性实验，均显示保 存稳定性存稳定性良好良好； v精密

20、度：精密度： 批内差在批内差在2.865%，批间差在，批间差在5.1 9.7%，对质控品重复，对质控品重复 10 次检测，变异系数为次检测，变异系数为 5.42%，均达到国家标准（，均达到国家标准（ 15%） 方法评价结果方法评价结果 西北大学西北大学 v标准曲线：在标准曲线：在0.25 4 NCU/mL范围内线性范范围内线性范 围良好围良好 v临界值：临界值为阴性对照血清均值的临界值：临界值为阴性对照血清均值的2.1倍倍 v特异性：检测临床特异性：检测临床TP抗体阴性血清，抗体阴性血清，阴性符合率阴性符合率 为为100%，特异性良好，特异性良好 v对比实验：灵敏度较商品化化学发光试剂盒提高对

21、比实验：灵敏度较商品化化学发光试剂盒提高 4倍，特异性二者相当倍，特异性二者相当 西北大学西北大学 稳定性稳定性 精密度精密度 线性范围线性范围 参考值参考值 特异性特异性 对比实验对比实验 HRP标记抗原稀释液标记抗原稀释液 抗原包被量抗原包被量 酶标抗原稀释浓度酶标抗原稀释浓度 血清样本稀释液血清样本稀释液 保护剂保护剂 对方法进行比较全面的评价对方法进行比较全面的评价 方法的进一步优化方法的进一步优化 初步建立的化学发光磁酶免疫分析法初步建立的化学发光磁酶免疫分析法 全文总结：全文总结： 西北大学西北大学 中试放大中试放大 梅毒抗体梅毒抗体 临床科研临床科研 血清盘血清盘 梅毒螺旋梅毒螺旋 体抗体诊体抗体诊 断试剂国断试剂国 家参考品家参