流行性感冒是由流感病毒引发的急性呼吸道传染病，具有明显的季节性和流行性特点[1]。流感病毒是引发流行性感冒的病原体，根据核蛋白和基质蛋白不同，分为甲、乙、丙、丁4型，其中甲型流感病毒变异能力较强，易引起大规模流行[2]。大青龙汤出自张仲景的《伤寒论》，是由麻黄、桂枝、甘草、杏仁、石膏、生姜、大枣7味中药组成的解表剂，常见于治疗外感风寒、表里俱实，现代临床主要应用于治疗呼吸系统疾病，如流行性感冒、支气管炎及哮喘等[3-6]。在《流行性感冒诊疗方案（2020年版）》中，大青龙汤被列为流感轻症治疗方案之一。尽管大青龙汤在流感的临床应用中取得了显著疗效，但其抗病毒作用机制尚未明确。

在T细胞抗原受体和刺激信号结合后，T细胞会经历一个分化程序，转化为多种辅助T细胞亚群，形成特定的细胞因子组合[7]。酪氨酸蛋白激酶ZAP-70（tyrosine-protein kinase ZAP-70，ZAP70）控制T淋巴细胞的细胞骨架修饰、黏附和移动性，是调节T细胞活化的关键因子。ZAP70是通过控制功能性免疫突触的形成与抗原递呈细胞相互作用所必需的因素，确保细胞因子等效应物靶向递送到抗原递呈细胞[8]。但ZAP70对T细胞活化的作用是双向的，开启T细胞激活的ZAP70也通过调节T细胞表面的受体表达参与了T细胞激活的关闭[9]。活化T细胞核因子5（nuclear factor of activated T-cells 5，NFAT5）通过与核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）协同作用，诱导NF-κB下游靶点诱导型一氧化氮合酶的激活，表现出抑制病毒复制的作用[10]。研究发现NFAT5是病毒诱导的I型干扰素（interferon-I，IFN-I）产生的转录抑制因子，防止IFN-I过度表达引发的破坏性的炎症反应[11]。本研究旨在探讨大青龙汤对甲型流感病毒（H1N1/PR8）感染小鼠的治疗作用，并探讨其对ZAP70和NFAT5表达的调控作用，为临床应用提供理论依据和实践参考，并为今后防控流感病毒的感染和治疗提供新方法。

1材料

1.1 动物

1.2 病毒株

甲型流感病毒（H1N1/PR8），编号VR-1469，购自美国ATCC，由本实验室传代，−80 ℃冰箱保存。本实验室为具有中国合格评定国家认可委员会认证的ABSL-2级生物安全实验室，实验操作严格按照ABSL-2级生物安全实验室管理制度及规范化操作规程进行。

1.3药品与试剂

1.4 仪器

Vanquish型液相色谱仪、Orbitrap Exploris 120型质谱仪、Applied Biosystems QuantStudio 5型Real-time PCR仪、MSC1.8型A2型生物安全柜、ULT Freezer型超低温冰箱（美国Thermo公司）；Quantum GX2型小动物活体CT成像机、Enspire型多功能酶标仪（美国Perkinelmer公司）；Accuri C6 Plus型流式细胞仪（美国BD公司）；5810R型低温高速离心机（德国Eppendorf公司）。

2方法

2.1大青龙汤的UPLC-QE-HF-MS/MS分析

2.1.1样品处理将大青龙汤煎煮液进行冻干处理，精确称量适量样本于离心管中，加入含2-氯-L-苯丙氨酸的甲醇，涡旋振荡30 s；放入组织研磨器中55 Hz研磨60 s；室温超声15 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液经0.22 μm膜滤过，滤液加入到检测瓶中，用于LC-MS检测。

2.1.2色谱条件超高效液相系统使用Acquity UPLC®HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 µm），体积流量0.3 mL/min，柱温40 ℃，进样量2 μL。正离子模式，流动相为0.1%甲酸乙腈（B2）和0.1%甲酸水溶液（A2），梯度洗脱：0～1 min，8% B2；1～8 min，8%～98% B2；8～10 min，98% B2；10～10.1 min，98%～8% B2；10.1～12 min，8% B2。负离子模式，流动相为乙腈（B3）和5 mmol/L甲酸铵水溶液（A3），梯度洗脱：0～1 min，8% B3；1～8 min，8%～98% B3；8～10 min，98% B3；10～10.1 min，98%～8% B3；10.1～12 min，8% B3。

2.1.3质谱条件正离子喷雾电压为3.50 kV，负离子喷雾电压为−2.50 kV，鞘气体积流量40 arb，辅助气体积流量10 arb。毛细管温度325 ℃，以分辨率60 000m/z100～1 000，并采用HCD进行二级裂解，碰撞能量为30%，二级分辨率为15 000，采集信号前4离子进行碎裂。

2.2 动物分组、造模与给药

选取ICR小鼠78只，其中60只按体质量随机分为对照组、模型组、奥司他韦（27.5 mg/kg）组和大青龙汤高、中、低剂量（23.10、11.55、5.78 g/kg）组，每组10只。另外18只小鼠随机分为对照组、模型组和大青龙汤中剂量（11.55 g/kg）组，每组6只，用于蛋白质组学研究。除对照组外，将其余各组小鼠用异戊烷轻度麻醉，以15个半数致死量（LD50）甲型流感病毒（H1N1/PR8）滴鼻感染，35 μL/只[13-15]。感染1 h后ig相应药物（20 mL/kg），对照组和模型组ig等体积的蒸馏水，1次/d，连续给药4 d。第5天称定体质量后，眼球取血并脱颈椎处死，解剖取出肺组织。

2.3小鼠肺部影像学检查

在动物感染第4天，将小鼠用异氟烷轻度麻醉后，用小动物活体CT成像仪进行小鼠肺部影像学检查。

2.4小鼠肺组织炎症因子检测

用预冷的PBS冲洗小鼠肺叶，去除残留血液，称定质量后将组织剪碎。将剪碎的组织装入匀浆管中，按1∶10的比例加入PBS，匀浆后取上清液，按照试剂盒说明书检测肺组织中炎症因子TNF-α、IFN-γ和IL-6水平。

2.5肺组织病毒载量检测

取1片完整肺叶于匀浆管中，加入TRIzol试剂1 mL，匀浆后按说明书进行RNA提取，−80 ℃冰箱保存。按PCR试剂盒说明书配制扩增体系，进行核酸检测，45 ℃逆转录10 min，95 ℃预变性15 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，循环40次，在仪器上选用FAM和VIC通道，荧光信号采集阶段位于每个循环的60 ℃期间。

2.6外周血淋巴细胞水平测定

摘眼球取血200 μL于抗凝管中，按流式抗体及红细胞裂解液说明书进行染色和红细胞裂解，加入PBS 10 mL终止裂解，于4 ℃、2 000 r/min离心5 min，弃上清。加入含2%胎牛血清的PBS及4%甲醛溶液各100 μL重悬细胞，于4 ℃避光保存[16]，用于T细胞和B细胞的检测。

2.7小鼠肺组织病理学观察

取小鼠左肺上叶固定在4%多聚甲醛溶液中，组织经固定、脱水、石蜡包埋、切片、苏木素-伊红（HE）染色后，在显微镜下观察小鼠肺组织中肺泡、间质和支气管的损伤程度。

2.8肺组织蛋白质组学分析

对小鼠肺组织进行蛋白提取，BCA法测定蛋白含量后，进行SDS-PAGE电泳。蛋白酶解后，用HLB使肽段脱盐，肽段定量后采用色谱仪进行肽段分离，然后通过Astral-DIA质谱仪进行质谱分析。将DIA原始数据导入Spectronaut™软件系统进行分析。所有数据均上传到美吉云平台（cloud.majorbio.com）进行分析。采用R语言中的t检验函数计算组间差异显著性P值和差异倍数。显著性检验P＜0.05，同时差异倍数＞1.2倍的蛋白为差异表达蛋白[17]。

2.9Western blotting检测肺组织NFAT5、ZAP70蛋白表达

提取小鼠肺组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品经10% SDS-PAGE凝胶电泳，转至PVDF膜，于5%牛血清白蛋白-TBST中封闭1 h，加入一抗，4 ℃孵育过夜；次日TBST洗膜3次，加入二抗，室温孵育40 min，ECL反应3 min后曝光显影。用Image J软件分析条带灰度值。

2.10统计学分析

数据采用SPSS 26.0软件进行统计学处理，符合正态分布者以表示，使用单因素方差分析。

3结果

3.1大青龙汤的UPLC-QE-HF-MS/MS分析

UPLC-QE-HF-MS/MS分析采用正、负离子2种模式。大青龙汤的基峰强度色谱图如图1所示。在正离子模式下鉴定出52种化合物（表1），包括(+)-去甲麻黄碱、伪麻黄碱、肉豆蔻素、表儿茶素、丁香酚等。在负离子模式下鉴定出25种化合物（表1），包括缬草酸、反式阿魏酸、苦杏仁苷、儿茶素、木犀草素等。这些化合物具有多种药理作用，如抗炎、抗病毒和免疫调节[18-20]。

3.2 大青龙汤对感染小鼠肺组织结构影像学的影响

在小鼠感染流感病毒第4天进行CT影像学检查，CT图和肺部影像三维渲染图（3D图）显示，对照组小鼠两肺纹理清晰，走向分布无异常，肺实质未见渗出或占位性病变；模型组小鼠肺部出现块状浸润阴影，可见大片的实变影和弥漫性磨玻璃影，提示肺纤维化；与模型组相比，各给药组肺部结构较为完整，磨玻璃影分布减少（图2）。

3.3大青龙汤对感染小鼠肺组织炎症因子水平的影响

如图3所示，与对照组比较，模型组小鼠肺组织中TNF-α、IFN-γ、IL-6水平显著升高（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，各给药组TNF-α水平显著降低（P＜0.05、0.01），奥司他韦组IFN-γ、IL-6水平显著降低（P＜0.05），大青龙汤高剂量组抗病毒蛋白IFN-γ水平显著升高（P＜0.05）。

3.4大青龙汤对感染小鼠肺组织病毒载量的影响

如表2所示，与对照组比较，模型组小鼠肺组织中病毒载量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组肺组织中病毒载量均显著降低（P＜0.01）。

3.5大青龙汤对感染小鼠外周血淋巴细胞比例的影响

如图4所示，与对照组比较，模型组小鼠外周血T淋巴细胞CD4+/CD8+明显降低（P＜0.05），B淋巴细胞比例显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组CD4+/CD8+显著升高（P＜0.05、0.01），奥司他韦组B淋巴细胞比例显著升高（P＜0.01）。

3.6大青龙汤对感染小鼠肺组织病理变化的影响

各组小鼠肺组织HE染色结果（图5）显示，对照组小鼠肺组织结构清晰，肺泡表面光滑，无明显变形或破裂，呼吸道上皮细胞排列整齐，间质未见纤维组织增生和炎症细胞浸润。与对照组比较，模型组小鼠肺组织可见大量肺泡出血、水肿、坏死，肺泡间隔轻微至中度增厚，伴大量炎症细胞浸润，以淋巴细胞和单核细胞为主，支气管黏膜上皮细胞变性、坏死，管腔可见大量坏死脱落的上皮和炎症细胞。与模型组相比，各给药组小鼠肺部病变均有一定程度的减轻。其中，奥司他韦组及大青龙汤高、中剂量组的肺泡炎、肺间质炎和支气管损伤较模型组均有所减轻；大青龙汤低剂量组与模型组比较炎性细胞有所改善。

3.7大青龙汤对感染小鼠肺组织蛋白表达的影响

3.7.1差异表达蛋白的表征经蛋白质组学分析和数据库检索，对照组、模型组和大青龙汤中剂量组共鉴定出1 834个差异表达蛋白。与对照组相比，模型组共鉴定出786种差异蛋白，其中上调蛋白557种，下调蛋白229种（图6-A、C）。与模型组相比，大青龙汤中剂量组共鉴定出416个差异蛋白，其中上调蛋白352种，下调蛋白280种（图6-B、C）。与对照组相比模型组上调，且与模型组相比大青龙汤组下调的蛋白共有148种；与对照组相比模型组下调，且与模型组相比大青龙汤组上调的蛋白共有85种（图6-D）。

3.7.2基因本体（gene ontology，GO）注释分析如图7所示，生物过程注释表明，大青龙汤治疗病毒性肺炎小鼠的差异表达蛋白主要与细胞过程、生物调控、代谢过程、对刺激的反应、发育过程、定位、多细胞生物过程、免疫系统过程、生物体种间相互作用的生物学过程相关。细胞成分注释表明，差异表达蛋白主要与细胞解剖实体和含蛋白质复合物有关。分子功能注释表明，差异表达蛋白主要参与结合、催化活性、分子功能调节活性、转运活性、转录调节活性和分子转换器活性。

3.7.3京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析KEGG通路富集分析（图8）显示，大青龙汤对病毒性肺炎小鼠的作用主要参与IgA产生的肠道免疫网络、Th1、Th2和Th17细胞分化、吞噬体（P＜0.05）。

3.7.4 蛋白质-蛋白质相互作用分析如图9所示，差异表达蛋白主要与转运及免疫系统相关，这些蛋白包括鞭毛内转运蛋白81（intraflagellar transport protein 81 homolog，Ift81）、ZAP70、NFAT5、甲基巴豆酰基辅酶A羧化酶α亚基（methylcrotonoyl-CoA carboxylase subunit alpha，Mccc1）、生物素-蛋白质连接酶（holocarboxylase synthetase，Hlcs）、核蛋白10（nucleolar protein 10，Nol10）和核受体辅激活因子6（nuclear receptor coactivator 6，Ncoa6）。此外，这些差异表达蛋白位于PPI网络的关键节点，表明大青龙汤对病毒性肺炎小鼠的作用机制可能涉及对免疫系统的抗病毒和抗炎作用。

3.8大青龙汤对感染小鼠肺组织NFAT5、ZAP70蛋白表达的影响

如图10所示，与对照组比较，模型组小鼠肺组织ZAP70蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），NFAT5蛋白表达水平呈降低趋势；与模型组比较，大青龙汤中剂量组小鼠肺组织中ZAP70蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），NFAT5蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。