✦ 原代培养

一、准备工作

1、仪器设备

CO2 培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅或水浴摇床，医用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科镊。

2、试剂耗材

小鼠正常肝类器官培养基、基质胶（低因子，无酚红）、60mm细胞培养皿、100μm滤筛、15ml离心管、1.5ml EP管若干、24孔细胞培养板、金属冰盒、眼科剪刀、眼科镊。

二、操作流程

1、类器官操作流程--样本准备

1）将组织放入含有预冷的（2-8°C）组织保存液 E 的取样瓶中（浸没整个组织），4℃从医院/实验室取回。

2）将取样瓶消毒，组织取出放入培养皿样本拍照，并登记，大小，颜色，软硬程度，组织类型等信息。

2、类器官操作流程--清洗、剪碎

在60mm细胞培养皿里用2-3ml原代培养缓冲液 B浸泡。用原代培养缓冲液 B清洗三次（每次更换培养皿）后剪碎，剪成大约1-3mm3的组织块，静置2次。

3、类器官操作流程--消化、过滤

1）向EP管中加入适量小鼠正常肝原代组织消化液 C（消化液是组织体积的3-5倍）在37℃进行消化10-15min（消化过程中随时观察消化情况）。

2）取少量液体在显微镜下观察，镜下观察到较多的单个细胞或 70um 以下的细胞簇后， 加入3倍体积原代培养缓冲液 B 终止消化，用枪头轻柔吹打可以看到液体变浑浊。

3）使用100μm滤筛进行过滤，取少量滤液在镜下进行观察。将滤液收集到15ml离心管，于300g 4℃ 富集离心5min后移去上清（清洗一次），添加1ml左右原代培养缓冲液 B转移到1.5mlEP管，重新重悬离心（清洗二次）。

4、类器官操作流程--离心、加胶

基质胶计算：第3步后观察收集到的组织体积，添加25倍组织体积的基质胶重悬铺板（金属冰盒或冰上操作）。

5、类器官操作流程--点胶、加液

以24孔细胞培养板为例，每孔点胶25ul组织基质胶混合物进行铺板（金属冰盒或冰上操作），将铺好的培养板放入37℃培养箱中10-15min成胶，添加500-750μl 小鼠正常肝类器官培养基 A（恢复室温）进行培养。

6、类器官操作流程之--观察

✦ 传代培养

一、类器官传代培养--样本收集

1、移液器吸去培养基，每孔添加 1-2ml左右4℃类器官传代培养缓冲液G放置 2min。

2、移液抢轻柔吹打基质胶，收集在 15ml 离心管中，4℃静置 10min(每 6-8 孔为一组) 。

二、类器官传代培养--样本消化

1、类器官数量不足或体积较小时：300g 4℃ 离心 5min 弃去上清，添加1ml类器官传代培养缓冲液 G重悬移入 1.5ml 离心管，300g4℃ 离心 5min（如图5）弃去液体进行第3步。

2、类器官数量较多或体积较大时：300g 4℃ 离心 5min 弃去上清，添加适量类器官传代消化液 D（是类器官悬液的1-2倍）超净台内消化 2-3min（中间可以吹打1-2次）（如图6） ，添加适量类器官传代培养缓冲液 G（缓冲液G：传代消化液D=5:1）终止消化，300g 4℃ 离心 5min 弃去上清，添加1ml类器官传代培养缓冲液 G重悬移入 1.5ml（ 如图7） 离心管，300g 4℃ 离心 5min 弃去液体进行第3步。（如图4）

三、类器官传代培养--铺板

类器官收集后，添加25倍基质胶重悬（基质胶体积：细胞沉淀体积=25:1），每孔25μl（如图8） 基质胶铺在 24孔细胞培养板中，放置培养箱中 10-15min 添加 500μl-750ul（如图9）小鼠正常肝类器官培养基 A。

四、类器官传代后增殖现象

✦ 类器官冻存

1、移液器吸去培养基，每孔添加 1-2ml 左右4℃类器官传代培养缓冲液G放置 2min。

2、移液抢轻柔吹打基质胶，收集在 15ml 离心管中，4℃静置 10min(每 6-8 孔为一组) 。

3、300g 4℃ 离心 5min 弃去上清，添加1ml类器官传代培养缓冲液 G重悬移入 1.5ml 离心管，300g4℃ 离心 5min（如图5）弃去液体。

4、添加适量类器官冻存液 F，轻柔吹打重悬，以24孔细胞培养板为例：密度为2个孔冻存 1管（500个/ml密度冻存），每管体积1.4ml。

5、冻存方法

1）将冻存管放入梯度冻存盒然后保存至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐。

2）4℃冰箱放置30 min，转移至-20℃放置1 h，最后移至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐。

✦ 类器官复苏

1、实验前准备

1）将水浴锅预热至37℃；

2）细胞实验室进行常规消毒，用预防喷雾喷涂并且使用紫外线照射40min的超净工作台台面；

3）在超净工作台中按次序摆好消过毒的离心管、吸管、培养板等。

2、取出冻存管

1）根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

2）从液氮罐中取出冻存盒，取出所需的冻存管，同时核对冻存管外的编号。

3、迅速解冻

迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中解冻，并要不断地摇动，使管中地液体迅速融化。约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管地外壁，再拿入超净台内。

4、将类器官组织液移入15ml离心管，添加类器官传代培养缓冲液 G 10ml重悬，轻柔吹打混匀，300g 4℃ 离心 5min。

5、弃上清，添加1ml 类器官传代培养缓冲液 G重悬将沉淀转移至1.5ml EP管，300g 4℃ 离心 5min，弃去上清。

6、添加25倍基质胶重悬（基质胶体积：细胞沉淀体积=25:1），每孔25μl基质胶铺在 24孔细胞培养板中，放置培养箱中 10-15min 添加 500μl-750ul 小鼠正常肝类器官培养基 A。

✦ 类器官鉴定

一、类器官鉴定--类器官收集

1、类器官收集；

2、清洗1-3遍，洗去大部分基质胶，离心弃去大部分上清。

二、类器官鉴定--琼脂糖凹槽制备

三、类器官鉴定--固定

四、类器官鉴定--包埋

五、类器官鉴定--HE染色

六、类器官鉴定--HE染色结果（以肺癌为例）