1山西医科大学生理学系，细胞生理学教育部重点实验室，山西省太原市 030001；

2中国医学科学院血液病医院/中国医学科学院血液学研究所，天津昂赛细胞基因工程有限公司/细胞产品国家工程研究中心，天津市 300041；

3出生缺陷与细胞再生山西省重点实验室，山西医科大学生物化学与分子生物学系，山西省太原市 030001

实验方法

1 氯化壳聚糖-β-甘油磷酸钠水凝胶的制备

称取0.4 g氯化壳聚糖粉末溶于20 mL DMEM/F12培养基中，冰浴下600 r/min充分搅拌，得到质量分数为2%的氯化壳聚糖溶液，性状为均一的淡黄色胶冻状液体，记为A液；称取4.5 g β-甘油磷酸钠粉末于10 mL DMEM/F12培养基中，冰浴下600 r/min充分搅拌，用0.22 µm滤器过滤除菌，得到质量分数45%的β-甘油磷酸钠溶液，性状为淡红色清亮液体，记为B液；冰浴下，将5 mL B液逐滴加入600 r/min搅拌下的20 mL A液中，继续搅拌，使其充分混匀，调节pH值至7.35-7.45，得到温敏性氯化壳聚糖-β-甘油磷酸钠溶液，4 ℃保存备用。

2 人脐带间充质干细胞在水凝胶中的种植、培养 将1.4.1制备的水凝胶溶液加入24孔板中，每孔1 mL，放入37 ℃恒温烘箱中使其成胶待用。室温下，将培养至第3代的人脐带间充质干细胞重悬于DMEM/F12完全培养基中，调整细胞浓度为2×107 L-1，接种于水凝胶上，每孔1 mL细胞悬液，对照组人脐带间充质干细胞用完全培养基培养，置于37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中分别培养1，3，5 d，使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖率，根据吸光度值(450 nm)绘制生长曲线。

3 1型糖尿病模型小鼠的构建

C57小鼠适应性喂养1周左右，通过腹腔注射现配的链脲佐菌素溶液(0.01 mL/g)，连续注射5 d，每次注射前禁食不禁水12 h；在第6，7天连续2 d采用尾静脉采血方式测量空腹小鼠血糖值，选择血糖高于11 mmol/L的小鼠纳入实验。

4 小鼠背部皮肤创面模型的构建

经链脲佐菌素注射液致高血糖的小鼠随机分为3组：生理盐水对照组、水凝胶组、复合水凝胶组，每组5只。小鼠经异氟烷吸入麻醉后，固定于手术台上，用体积分数为75%乙醇消毒背部皮肤，除去背部的毛发，确定伤口位置和大小，在小鼠背部用打孔器打一个直径为8 mm的圆形创面，切除皮肤全层。

5 水凝胶敷胶治疗

把孵育完成的水凝胶、负载人脐带间充质干细胞的复合水凝胶切成直径约1 cm、高约5 mm的圆柱体敷在小鼠背部创面上，医用纱布固定，对照组给予等量生理盐水治疗。术后单独喂养，每天对小鼠进行观察，每3 d更换1次新的敷料以确保敷料的完整性，并测量体质量、血糖。

6 创面的形态学观察

根据术后第1，7，14天获得的照片确定每个糖尿病小鼠创面的大小，并通过Image J软件分析各组小鼠的创面愈合率。收集3组小鼠皮肤伤口样本，其中一部分组织用于制备石蜡切片，一部分组织用于提取RNA。

7 苏木精-伊红染色

在敷胶治疗后的第7，14天，沿着小鼠伤口外缘剪取约5 mm的组织标本，固定脱水后，石蜡包埋，切片厚度5 μm，按文献[20]中步骤进行苏木精-伊红染色：脱蜡、脱水，苏木素染色5 min，自来水冲洗，分化液分化30 s后在自来水中浸泡15 min，伊红染液染色2 min，自来水中浸泡5 min，切片梯度乙醇脱水，透明及封固。用显微镜观察皮肤组织形态学变化，Image J软件统计分析肉芽组织新生率。

8 Masson染色

将石蜡切片脱蜡至水，铁苏木素染色8 min，酸性乙醇分化液分化10 s，自来水冲洗1 min，Masson蓝化液返蓝4 min，蒸馏水冲洗1 min，丽春红品红染色液染色8 min，弱酸(2%乙酸溶液)工作液冲洗1 min，磷钼酸溶液洗1.5 min，弱酸工作液冲洗1 min，苯胺蓝染色液染色1.5 min，弱酸工作液冲洗1 min，体积分数为95%乙醇、无水乙醇脱水3次，每次10 s，二甲苯透明3次，每次2 min，中性树胶封固，显微镜下观察。

9 CD31、CD45免疫组织化学染色

将石蜡切片脱蜡，PBS冲洗2次，每次10 min，在98 ℃预热的EDTA抗原修复液中加热20 min后冷却至室温，PBS冲洗3次，每次10 min，内源性过氧化物酶避光孵育20 min，PBS冲洗3次，每次10 min，孵育anti-CD31/anti-CD45(1∶100)一抗4 ℃过夜，第2天室温孵育30 min，PBS冲洗3次，每次10 min，二抗反应增强液避光孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min，二抗避光孵育1 h，PBS冲洗3次，每次10 min，DAB显色液显色，PBS冲洗1次，每次5 min，苏木素染液染色35 s，蒸馏水冲洗1 min，分化液分化反应3 s，PBS冲洗，体积分数为80%乙醇、90%乙醇、无水乙醇各脱水2次，每次5 min，二甲苯透明2次，每次2 min，中性树胶封固，显微镜下观察。

10 免疫荧光染色

将石蜡切片脱蜡后用体积分数为5%正常山羊血清封闭1 h，4 ℃下孵育一抗：兔来源一抗anti-CD68(1∶200)和鼠来源一抗anti-CD86(1∶200)用于鉴定M1型巨噬细胞，兔来源一抗anti-CD68(1∶200)和鼠来源一抗anti-CD206(1∶200)用于鉴定M2型巨噬细胞，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次，每次5 min，加入对应的荧光二抗(1∶200)，避光孵育 1 h，PBS清洗，滴加DAPI避光孵育20 min，荧光显微镜采集图像。

11 qRT-PCR检测创面中白细胞介素10、白细胞介素6的mRNA水平

敷胶治疗后的第7，14天，采用Trizol法提取皮肤伤口组织中的总RNA，检测RNA的浓度与纯度，反转录为cDNA，按照两步法PCR扩增程序进行Real-time PCR反应，β-actin作为内参。目的基因的相对表达量采用 2-ΔΔCT法计算，引物序列，见表1。

主要观察指标

① 各组小鼠创面的愈合情况；

② 各组小鼠创面组织中血管新生和炎症反应；

③ 各组小鼠创面局部胶原沉积和血管再生情况；

④ 各组小鼠创面局部肉芽组织的形成情况；

⑤ 各组小鼠创面中白细胞介素10、白细胞介素6的mRNA水平。