基因治疗是伴随着分子生物学与细胞生物学发展起来的一种新兴的治疗手段, 旨在通过导入治疗基因、沉默或编辑致病基因等方法对机体进行基因修正, 从而达到治疗目的。眼睛是基因治疗的理想部位, 因为眼球体积相对较小, 基因给药剂量低; 作为相对独立的器官, 眼睛具有免疫赦免特权, 可以在一定程度上减少外源性物质引起的炎症和免疫反应; 局部给药方便, 可以有效避免体内复杂的生理环境对基因递送产生干扰。

据统计, 目前在全球范围内有将近10亿人口受眼部疾病困扰, 其中失明人数约有4 000万, 然而在临床上, 有相当一部分致盲性的眼部疾病如X连锁视网膜劈裂症、老年黄斑变性、Leber先天性黑朦、Leber遗传性视神经病变和无脉络膜症等仍缺乏有效的治疗手段。利用核酸类药物调控基因表达已成为治疗这些致盲性眼部疾病最有前景的策略之一 。

实现眼部疾病有效的基因治疗, 需要克服两方面困难：

其一, 基因药物自身分子质量大, 亲水性强, 并且在体内外稳定性差, 不利于递送;

其二, 眼部具有多重阻碍药物吸收的保护性屏障, 包括以泪膜屏障、角膜屏障和结膜屏障为代表的眼前段屏障, 以巩膜屏障和血液-视网膜屏障为代表的眼后段屏障, 以及玻璃体和房水的对流等, 均限制了基因的吸收。

单纯的基因药物通过传统的局部滴眼或全身给药很难到达眼内或眼底的病灶部位, 也很难进入细胞发挥其功效, 必须借助适宜的基因载体实现其有效递送。眼部基因治疗的递送载体分为病毒载体和非病毒载体两大类。

病毒载体主要包括：腺病毒(adenovirus, Ad)载体、腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)载体、慢病毒(lentivirus, LV)载体以及逆转录病毒(retrovirus)载体等。其中, Ad、AAV、LV常用于眼部疾病的基因治疗, 尤其是AAV的使用频率高, 占全部基因载体近50%。

病毒载体具有转染效率高、易于纯化、与基因药物结合能力强等优势。但是, 病毒载体的不足之处在于具有潜在的免疫毒性和染色体毒性, 而且调控靶基因表达的能力较差, 因此其临床应用具有明显的局限性; 非病毒载体最突出的优势是可以弥补病毒载体的安全缺陷, 降低免疫原性, 对基因药物的包载量可调节, 但转染效率相对较低。因此, 目前对非病毒载体的研究, 大多侧重通过各种修饰手段改善其对基因药物的携载、释放与转染能力。

目前, 眼部基因治疗多通过视网膜下腔注射或玻璃体内注射等创伤途径给药。对于XLRS、AMD、LCA、LHON和CHM等眼底疾病, 治疗周期长, 反复进行眼内注射对治疗条件的要求高, 患者顺应性差, 且导致白内障、视网膜分离等并发症的风险较大。利用合理的递送载体通过安全的给药途径将基因治疗药物有效递送至眼内, 进而使其发挥理想的治疗效果, 是当前眼科用药研究的重点。

尽管病毒载体转染效率高, 但携载基因容量有限, 而且应用于人体存在引起免疫原性等致病风险, 实现临床上广泛应用有一定困难, 而非病毒载体安全性更好, 携载基因量大, 可实现大规模生产, 并且可以通过特定方法提高其基因转染效率, 临床应用前景更为广阔。

对于眼后段或眼底疾病的治疗, 可以采取全身给药, 但是由于BRB存在排列紧密的血管内皮细胞和RPE细胞, 这些屏障阻碍了体循环与视网膜内层之间的物质交换, 从而降低了药物的眼部生物利用度。因此, 若想通过无创的局部滴眼给药进行基因治疗, 必须克服多重吸收屏障, 将基因药物递送至眼后段的作用靶点。

1、阳离子脂质体载体

阳离子脂质体由带正电荷的磷脂作为膜材料制备而成, 可与带负电荷的基因通过静电作用结合经内吞途径进入细胞, 随后将基因释放至细胞质。阳离子脂质体可以利用其表面的正电荷附着于黏蛋白覆盖的角膜上皮, 进而促进药物的吸收, 使其发挥更好的治疗效果。有研究利用RGD肽修饰的磷脂(RGD-PEG-DSPE)、阳离子化的胆固醇(3β-[N-(N′, N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] cholesterol)与其他膜材料一同制备包载siRNA的脂质体, 体外实验结果显示, 该脂质体在RPE细胞中具有更高的基因递送效率及较低的细胞毒性。

2、壳聚糖复合物载体

近几十年来, 天然聚合物在眼部药物递送领域的应用取得了长足发展。壳聚糖是天然来源的多糖类聚合物, 在生理条件下带有正电荷, 能与眼表带有负电荷的黏蛋白结合, 延长药物在角膜表面的滞留时间, 减少药物从鼻泪管流失, 进而改善药物的眼部吸收效果。

由乙二醇基壳聚糖(GCS)和质粒DNA (pDNA)通过静电作用制得的纳米复合物能够用于RPE相关疾病的治疗。该纳米复合物的粒径约250 nm, 稳定性良好, 在盐溶液中不会发生聚集, 且不易被DNA酶降解, 能够保持其结构的完整性并将DNA释放至细胞中进行表达。将表达绿色荧光蛋白的pDNA (CBA-eGFP)用GCS纳米粒进行包裹和压缩, 通过视网膜下腔注射到成年白化病小鼠眼部, 在注射后第14天, 仅在用GCS纳米复合物治疗的眼睛中观察到RPE有显著的绿色荧光[63]。

Klausner等以壳聚糖低聚物(NOVAFECT)作为非病毒基因递送载体, 设计了壳聚糖/DNA复合物纳米粒, 其粒径较小, 约98 nm, 带有很强的正电荷, 约44 mV。体外实验证明, 该纳米复合物能够有效转染COS-7细胞。兔角膜注射该纳米复合物后, 其荧光素酶基因的表达量是聚乙烯亚胺(PEI)/DNA复合物的5.4倍, 且细胞能够观察到明显的绿色荧光。该纳米复合物有望为眼前段疾病的基因治疗提供一种潜在的方法。

3、脂质聚合物载体

脂质聚合物是采用聚合物与脂质成分共同制备纳米粒, 将核酸药物包载在所形成的纳米粒中, 从而提高核酸药物的稳定性及细胞摄取效率, 进而实现更高效地递送核酸药物。Jain等[65]采取聚合电解质稳定脂质载体的方法制备了载基因纳米粒。该纳米粒以(2, 3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)和磷脂酰胆碱(PC)制成的脂质体为核心, 同时外部应用静电结合的原理修饰了阴离子聚丙烯酸(PAA)和阳离子PEI。相比于单纯的基于DOTAP脂质体或PEI聚合物的载体, 该纳米粒可显著提高基因的入胞效率和细胞核共定位能力, 同时, 该纳米粒的基因转染效率相比于阳离子脂质体提升了5~6倍, 且显示出更低的细胞毒性。

4、多肽复合物载体

由于眼睛具有特殊的生理结构与保护屏障, 使得大多数药物经局部滴眼给药难以到达眼内的靶部位。通过增加药物对眼部保护屏障的渗透性来促进药物的吸收是改善局部生物利用度的可行方法。吸收促进剂可以影响角膜上皮的完整性, 进而增加角膜摄取, 主要包括肌动蛋白抑制剂、表面活性剂、胆酸盐、螯合剂和有机化合物等。细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPPs)是一类序列中富含碱性氨基酸的短肽, 能够以非受体依赖的方式被细胞摄取, 转导效率高且不易造成细胞损伤。目前常用的CPPs有人类免疫缺陷病毒的反式转录激活因子(TAT)、来源于果蝇触角足与DNA结合域的penetratin、人工合成的寡聚精氨酸等。利用这些CPPs可将蛋白质、核酸、纳米粒和脂质体等多种生物大分子或纳米载体成功地递送至细胞中。

由于CPPs的穿膜作用缺乏选择性, 因此并不适合于全身给药途径应用。但是将CPPs用于局部给药, 如用于构建眼部基因递送系统, 使其直接作用于病灶部位的吸收屏障, 可以规避体内复杂的生理环境, 并最大程度地发挥其优良的促进吸收功能, 且可避免其潜在的全身毒性。

5 超声微泡载体

近年来, 超声微泡介导的靶向基因递送引起了广泛关注。超声微泡作为一种新型的声学造影剂, 不仅可以增强超声显像效果, 还可以增加局部组织的通透性, 使药物在局部达到较高浓度而实现靶向治疗作用。超声微泡造影剂主要利用空化效应, 使液体中的微小气泡在超声作用下瞬间破裂, 同时伴有高速微射流、冲击波和高温现象, 进而产生相应的生物学效应。声场内微泡造影剂被超声破坏后, 产生的空化和机械效应会使细胞膜的通透性增加, 导致内皮细胞间隙变大, 因此基因可以通过破裂的微血管和内皮细胞间隙到达外周组织。

该技术可以显著促进基因在靶细胞中发生转染和表达。微泡在血液循环中稳定好, 能够减少基因在达到靶部位前被破坏, 并且能够可逆地打开血-视网膜屏障。携带基因的超声微泡造影剂在眼科的临床研究和眼科疾病的治疗方面展示出了潜在的应用前景。BRB阻止了大部分全身血液循环中的药物到达视网膜, 有研究用超声微泡打开血液-视网膜屏障, 为靶向递送药物至视网膜提供一种非创伤性的给药方法。

眼部基因治疗通过改变基因的表达实现治疗眼部疾病的目的, 特别是对多种退行性视网膜综合征具有很大的治疗潜力, 为眼部疾病的治疗带来了曙光。目前眼部疾病的基因治疗仍迫切需要解决一系列的关键问题, 如寻找有效的治疗基因、开发高效的基因递送载体、调控治疗基因表达的选择性和时机等。

眼部疾病基因治疗的研究重点主要是寻找有效且靶向性强的基因药物, 通过物理方法或开发新型药物递送系统, 提高基因药物在眼部的生物利用度, 降低其毒性及免疫原性等。尽管眼部基因治疗获得了一定的进展, 但是仍处于起步阶段, 大部分依然处于实验研究状态。特别是在基因递送过程中, 大部分递送载体效率较低, 成为基因治疗应用于临床的技术瓶颈。在后续的评价过程中, 难以建立具有临床疾病特征的动物模型也是限制该领域发展重要的因素。另外, 如何选择入组基因治疗的患者、在基因治疗前后采用何种手段评价治疗的效果等, 都给眼部基因治疗带来一定的挑战。尽管如此, 相信随着基因编辑技术的发展, 人类不久将有办法通过改变患者的基因组实现对遗传性眼病的治疗。

参考文献

张燕宇, 高欣, 江宽, 太玲钰, 魏刚, 陆伟跃. 眼部疾病的基因治疗与递送策略[J]. 药学学报, 2018, 53(4): 518-528.