慢性间质性炎症和活化免疫细胞的肾脏浸润在高血压中起关键作用。淋巴系统通过清除免疫细胞和多余组织液调节炎症。先前我们证实增加肾脏淋巴管生成可预防小鼠高血压。研究人员假设将血管内皮生长因子-C通过靶向纳米颗粒递送至肾脏可诱导肾淋巴管生成，从而降低高血压小鼠血压。研究人员将装载VEGF-C特异性变体的肾脏靶向纳米颗粒每三日注射至血管紧张素II诱导或LNAME诱导的高血压小鼠体内。与单独注射VEGF-C的高血压小鼠相比，纳米颗粒处理组小鼠表现出肾脏淋巴管密度和宽度增加。该组小鼠同时呈现收缩压降低、促炎性肾免疫细胞减少及尿钠排泄分数升高。本研究证明通过药理学手段扩张肾淋巴管可降低血压，该效应与肾脏免疫细胞良性改变及钠排泄增加相关。

一、介绍

近半数美国成年人患有高血压，且许多患者病情未得到有效控制。尽管加强了健康教育、公共卫生措施和药物治疗，约30%-60%的高血压患者仍无法实现理想血压水平。这一现状令人担忧，因为即使收缩压仅降低10 mmHg也能显著减少健康风险并改善预后。当前亟需开发新的治疗手段帮助高血压人群降低血压， ideally达到正常血压范围。

肾脏免疫细胞浸润、炎症反应和钠潴留与高血压密切相关。淋巴管负责将液体、电解质、细胞和蛋白质从组织间隙输送至引流淋巴结，最终返回循环系统。在急性肾损伤以及糖尿病肾病、肾癌等慢性炎症性疾病中可观察到炎症相关性淋巴管生成。在炎症状态下，淋巴管增生有助于清除器官中的免疫细胞、蛋白质和液体。我们既往研究发现，在不同高血压模型中，肾脏会出现代偿性淋巴管生成现象。然而这种代偿性增生并不足以消除炎症和高血压。基因技术诱导小鼠肾脏特异性淋巴管生成后，成功预防了盐敏感性高血压、一氧化氮抑制性高血压以及血管紧张素II诱导性高血压的发生，该效应与肾脏免疫细胞聚集减少和钠排泄增加相关。此外，基因诱导肾脏淋巴管生成还能缓解已存在的一氧化氮抑制性高血压，并伴随钠排泄增加。

本研究旨在开发一种靶向肾脏促进淋巴管生成的转化疗法，以期在高血压状态下降低血压。基于既往肾脏靶向纳米颗粒的研究成果，我们采用纳米颗粒技术实现淋巴特异性生长因子递送。现有多种纳米颗粒药物递送系统，其共同目标是提高效率、特异性和生物利用度。纳米颗粒可设计为具有特定理化特性（如50-200纳米尺寸、特殊形态和表面化学性质），并能携带一种或多种诊断/治疗制剂，通过温度、pH值和酶等外部触发机制释放载荷。此外，纳米颗粒包封技术可延长治疗/诊断制剂的系统循环半衰期，从而实现靶向区域的显著富集。目前存在多种形态的纳米颗粒，包括胶束、脂质体、纳米球、纳米管、纳米胶囊、立方液晶和水凝胶等。本研究同时测试了胶束和脂质体纳米颗粒的效果比较。

我们假设：通过肾脏靶向纳米颗粒递送促淋巴管生成生长因子——血管内皮生长因子C的VEGFR-3特异性亚型，能够增加血管紧张素II诱导性或一氧化氮抑制性高血压雄雌双性小鼠的肾脏淋巴密度并降低血压。同时推测血压下降将伴随促炎性肾脏免疫细胞减少、抗炎性肾脏免疫细胞增加以及钠排泄增强。由于盐敏感性高血压造模周期较长且小鼠尾静脉注射次数受限，本研究未采用该模型。

二、材料与方法

01.纳米颗粒制备与表征

PLGA-PEG-叶酸嵌段共聚物由IITC提供，其核磁共振、红外光谱和凝胶渗透色谱分析证书见图S1。采用透析法制备胶束纳米颗粒1（NP1）：将50 mg PLGA-PEG-叶酸共聚物与10 mg香豆素6染料、10 mg FITC-卵清蛋白或1 mg VEGF-C共同溶解于二甲基亚砜（DMSO），转移至截留分子量100 kDa的透析膜中， against 去离子水透析24小时。透析后溶液经离心和超声浓缩。

脂质体纳米颗粒2（NP2）制备采用DSPC（120 mg）、胆固醇（16 mg）、DSPE-PEG-叶酸（24 mg）及香豆素6染料（10 mg）或FITC-卵清蛋白（10 mg）。上述组分溶于10 mL二氯甲烷（DCM），通过气流去除DCM形成脂质薄膜，加入10 mL PBS水合形成脂质体。

纳米颗粒尺寸通过动态光散射法测定，样品浓度保持0.5 mg/mL。香豆素6包封量通过吸光度测定：将100 µL纳米颗粒溶于900 µL DMSO，测定444 nm处吸光度，根据标准曲线计算包封量（NP1：5±0.35 mg；NP2：4±0.89 mg）。FITC-卵清蛋白包封量采用相同方法计算（4±0.51 mg）。VEGF-C包封量通过ELISA测定（约500±17 µg）。所有纳米颗粒表面修饰叶酸以靶向肾小管高表达的叶酸受体，组装示意图见图S2。

释放曲线通过透析膜管法测定：将1 mL纳米颗粒溶液置于截留分子量3500的透析管中，浸入含0.5% Tween 80的PBS溶液。定时收集并更换透析液，使用酶标仪测定香豆素6（Ex/Em=444/500 nm）和FITC-卵清蛋白（Ex/Em=488/530 nm）的荧光强度，累积释放率见图S3。

透射电镜样品制备：将纳米颗粒悬液滴加至碳载铜网，真空干燥后观察。体内分布实验：向雌性C57BL/6J小鼠（n=3）尾静脉注射100 µL NP1或NP2（10 mg/mL），12小时后处死小鼠并取各器官，通过成像系统定量纳米颗粒分布。所有动物实验均经相关机构动物伦理委员会批准，符合实验动物护理与使用指南。

02.实验动物

野生型C57BL/6J小鼠由专业机构提供。10-14周龄雄性与雌性小鼠在吸入式异氟烷（1.5-5%）麻醉下，经手术植入装载血管紧张素II（490 ng/kg/min）的 osmotic 微量泵（A2HTN模型），术后局部涂抹利多卡因。另一组雌雄小鼠通过饮用水持续给予L-NAME（0.5 mg/mL）建立LHTN模型。造模2天后通过尾套法血压测量确认高血压形成。随后将小鼠随机分组，每3天通过尾静脉注射一次载有VEGFR-3特异性突变体VEGF-C（VEGF-C c156s）的胶束纳米颗粒或游离VEGF-C蛋白，持续16天（共注射4次）。该注射方案参考既往研究，旨在为血管重塑提供足够时间，同时避免尾静脉损伤。所有小鼠于首次注射后第16天通过深麻醉下组织灌注及颈椎脱位实施安乐死，并采集组织样本。动物实验均经相关伦理委员会批准，符合实验动物护理与使用指南。

03.血压测量

在不同时间点通过尾套法测量收缩压（SBP）。使用IITC无创血压测量系统，所有测量均在专用安静区域进行。小鼠在34°C保温 restraint 舱中适应30分钟后，置于合适尺寸的 restraint 舱内继续适应5分钟，随后由两名独立盲法研究人员根据压力波形计算SBP值。

04.血清与尿液采集及检测

将小鼠置于代谢笼中适应过夜后，收集24小时尿液，并于安乐死时经左心室采血分离血清。采用毛细管电泳法测定尿液钠浓度，直接电位法测定肌酐水平。通过计算获得尿钠排泄分数（FENa）和肌酐清除率。

05.免疫荧光

安乐死后取肾脏组织，沿矢状面剖开并于10%缓冲福尔马林中固定48小时。经乙醇脱水、石蜡包埋后制成5-7 μm切片。切片脱蜡、水化并经0.1% Triton溶液透化处理，用10% AquaBlock溶液封闭后，与LYVE-1或podoplanin一抗（多克隆山羊源）4°C孵育过夜。采用Alexafluor 488/594标记二抗室温孵育1小时进行显影，阴性对照仅使用二抗孵育。所有切片均采用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片，使用奥林巴斯荧光显微镜系统及CellSens成像软件在40倍放大下采集图像。心脏、肝脏、肺脏及皮肤淋巴管成像方法相同（放大倍数10×或20×）。

06.肾脏免疫荧光定量分析

每个肾脏切片选取5-7个预定义区域在20倍放大下采集图像，避开组织缺损区、肾小盏及大量肾小球分布区域。采用ImageJ软件设定阳性内皮细胞阈值，计算podoplanin阳性像素点总面积。

07.肾淋巴管最大宽度定量

在每个肾脏切片皮质区采集20倍放大图像，识别所有与动脉伴行的podoplanin阳性淋巴管。使用ImageJ测量所有含管腔淋巴管最宽处的像素长度。

08.流式细胞术

安乐死后取肾脏组织并去除包膜，精细剪碎后于含Collagenase D（2.5 mg/mL）和Dispase II（1 mg/mL）的缓冲液中37°C消化1小时。消化后样本经100 μm和40 μm滤网过滤冲洗，离心收集细胞组分，并用NH4Cl/EDTA裂解红细胞。脾细胞以相同方法分离，用于抗体对照及免疫细胞大小和形状的前向/侧向散射设门。肾细胞重悬于0.1% FBS溶液中，为阻断非特异性Fc结合，样本与抗小鼠CD16/CD32抗体冰上孵育10分钟。随后与CD45、F4/80、CD11c及CD3e荧光标记抗体孵育，并经40 μm滤网过滤。所有抗体均购自专业供应商（详见表S1）。采用流式细胞仪及FACS DIVA软件进行检测，最多分析50万个细胞。CD3e+群在CD45+门内定量，CD3e PacBlue+群排除PE和PerCP-Cy5.5荧光标记；F4/80+和CD11c+群在CD45+/CD3e-门内定量（图S4），并排除PacBlue、APC和APC-Cy7荧光标记。结果以每肾CD45+细胞百分比表示，具体设门策略见图S4。

09.统计学分析

结果以点图及均值或均值±标准误表示。两组间比较采用双尾非配对t检验，多组比较采用单因素方差分析及Student-Newman-Keuls事后检验，显著性水平设定为0.05。所有统计分析均通过SigmaPlot 10软件完成。

三、结果

我们开发了两种靶向肾脏的纳米颗粒：胶束型（NP1）和脂质体型（NP2），平均直径为100 nm，并装载香豆素6染料用于示踪（图1A）。通过叶酸修饰实现纳米颗粒对高表达叶酸受体的肾近曲小管细胞的靶向性。将纳米颗粒注射至雌性C57BL/6J小鼠尾静脉，12小时后取器官进行荧光成像。结果显示，游离染料组和脂质体纳米颗粒（NP2）组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏及肾脏中仅见微弱荧光，而胶束纳米颗粒（NP1）组小鼠肾脏中观察到显著的特异性荧光聚集（图1B）。

图1 纳米颗粒特性及其靶向递送染料与荧光蛋白至肾脏的能力。（A）胶束与脂质体纳米颗粒及其尺寸。标尺=200 nm。（B）单次静脉注射香豆素6染料、载香豆素6的NP1或NP2后12小时的小鼠器官荧光成像。采用活体成像系统采集图像，计算每克组织的平均荧光强度（MFI）。（C）单次静脉注射载FITC-卵清蛋白的NP1、游离FITC-卵清蛋白或空白对照后12小时的小鼠肾脏成像。结果以点图及均值表示（每组n=3），采用单因素方差分析及Student-Newman-Keuls事后检验进行统计学分析。*与同器官游离染料组相比p<0.05。

为进一步验证胶束纳米颗粒（下文简称NP）的肾脏蛋白递送能力，对雌性小鼠尾静脉注射载FITC-卵清蛋白的NP、游离FITC-卵清蛋白或空白对照，12小时后处死采集肾脏。仅NP组小鼠肾脏中检测到显著FITC-卵清蛋白聚集，表明肾脏靶向递送具有高度特异性（图1C）。

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为探究该靶向纳米颗粒能否递送VEGFR-3特异性VEGF-C（VEGF-C c156s）并增加高血压小鼠肾淋巴管密度，我们采用皮下植入血管紧张素II微量泵（A2HTN）或饮用水添加一氧化氮抑制剂L-NAME（LHTN）的方法建立雄雌双性高血压模型。根据既往报道，PLGA-PEG-叶酸纳米颗粒在类似注射方案下不会改变肾脏形态，故未设置纳米颗粒空白对照组。两组小鼠收缩压显著升高2天后，每3天通过尾静脉注射游离VEGF-C蛋白或NP包裹的VEGF-C。第16天完成4次注射后处死小鼠采集组织。肾皮质淋巴管podoplanin免疫标记显示，与游离VEGF-C组相比，NP-VEGF-C组高血压小鼠淋巴管生成显著增加（图2A）。肾皮质podoplanin阳性像素定量分析进一步证实该增加具有统计学意义（图2B）。此外，NP治疗组小鼠肾皮质淋巴管最大宽度显著增加（图2C）。这一现象可能与VEGF-C介导的淋巴管增生及淋巴液容量增加有关。所有数据表明肾脏靶向纳米颗粒可特异性促进肾内淋巴管生成，心脏、肝脏、肺脏及皮肤均未观察到淋巴密度增加（图S5）。

图2 纳米颗粒包裹VEGF-C治疗增加高血压小鼠肾脏淋巴管密度。（A）血管紧张素II诱导高血压（A2HTN）及L-NAME诱导高血压（LHTN）雄雌小鼠肾脏切片podoplanin免疫荧光染色。两组小鼠每3天注射一次纳米颗粒包裹VEGF-C（NP组）或游离VEGF-C蛋白（单独治疗组）。标尺=50 μm。（B）通过ImageJ分析podoplanin阳性像素密度测定肾小叶间淋巴管密度。结果以均值表示（每组n=5只小鼠）。（C）肾皮质含管腔淋巴管的最大宽度测量。淋巴管经podoplanin染色识别，使用ImageJ进行测量。结果以均值表示（每组n=4只小鼠）。所有统计分析采用t检验。*与游离VEGF-C治疗组相比p<0.05。

纳米颗粒包裹VEGF-C或游离VEGF-C蛋白治疗对高血压小鼠体重、左右肾重量及脾重量均无显著影响（表S2和S3）。我们进一步探究NP介导的肾淋巴管密度增加对两种高血压模型血压的影响。与游离VEGF-C治疗组相比，NP包裹VEGF-C治疗的A2HTN雄雌小鼠在第13天表现出收缩压显著降低（图3A）。在LHTN雄雌小鼠中，NP治疗组从第10天起即出现收缩压显著下降，且该效应持续至第15天（图3A）。

图3 纳米颗粒包裹VEGF-C治疗后血压显著下降且肾脏免疫细胞良性改变。（A）A2HTN及LHTN雄雌小鼠每3天接受NP包裹VEGF-C或游离VEGF-C治疗后的收缩压变化。（B）流式细胞术检测各组小鼠肾脏免疫细胞群（以CD45+细胞百分比表示）。结果以均值±标准误或均值表示（每组n=4-5），采用t检验或单因素方差分析。*与游离VEGF-C治疗组相比p<0.05。

高血压与肾脏免疫细胞群的显著变化相关。我们既往研究发现，与正常血压小鼠相比，A2HTN小鼠肾脏中F4/80-CD11c-细胞显著减少，而F4/80+CD11c+单核细胞及CD3+ T细胞显著增加。NP包裹VEGF-C治疗逆转了上述效应：与游离VEGF-C治疗组相比，NP治疗组A2HTN小鼠肾脏F4/80-CD11c-细胞显著增加，F4/80+CD11c+单核细胞和CD3+ T细胞显著减少（图3B）。研究还发现，NP包裹VEGF-C治疗的LHTN小鼠肾脏中F4/80+CD11c-单核细胞较游离VEGF-C治疗组显著减少（图3B）。这些免疫细胞变化表明NP治疗组小鼠淋巴系统效率提升。由于F4/80+CD11c+单核细胞、F4/80+CD11c-单核细胞及大多数CD3+ T细胞均属促炎性免疫细胞，将其迁出肾脏可能有助于减轻炎症反应。这种肾脏免疫细胞的良性改变可能是高血压小鼠血压下降的部分原因。

钠平衡是血压调控的另一重要因素，钠潴留增加参与病理性高血压的发生。既往研究表明，仅在钠潴留状态下（如LHTN及慢性盐负荷），基因诱导肾淋巴管生成可使尿钠排泄分数（FENa）显著增加一倍并降低血压。本研究同样发现，NP包裹VEGF-C治疗组与游离VEGF-C治疗组的A2HTN和LHTN小鼠在肌酐清除率（图4A）及血钠浓度（图4B）方面无显著差异。然而，NP治疗组两种高血压小鼠的FENa均显著高于游离VEGF-C治疗组（图5A），而24小时尿量无组间差异（图5B）。与FENa升高一致，NP治疗组24小时尿钠浓度显著增加（图S6A），但24小时尿钠排泄总量、尿肌酐及血肌酐均无显著组间差异（图S6B-D）。这些结果进一步证实，在高血压伴钠潴留状态下，诱导肾淋巴管生成可改善钠代谢处理，这可能是其降压作用的部分机制。

图4 纳米颗粒包裹VEGF-C治疗对肌酐清除率及血钠水平无影响。（A）肌酐清除率及（B）血钠浓度检测结果。A2HTN与LHTN雄雌小鼠每3天接受一次NP包裹VEGF-C或游离VEGF-C治疗。结果以均值表示（每组n=4），采用t检验进行统计分析。*与游离VEGF-C治疗组相比p<0.05。

图5 纳米颗粒包裹VEGF-C治疗显著增加尿钠排泄分数。（A）尿钠排泄分数（FENa）及（B）24小时尿量检测结果。A2HTN与LHTN雄雌小鼠每3天接受一次NP包裹VEGF-C或游离VEGF-C治疗。结果以均值表示（每组n=4），采用t检验进行统计分析。*与游离VEGF-C治疗组相比p<0.05。

四、讨论

本研究证实，通过开发和应用靶向肾脏的纳米颗粒递送促淋巴管生成生长因子，可有效增加肾淋巴管密度。该疗法能显著降低已确立高血压小鼠的血压，这一效应与肾脏免疫细胞的良性改变及尿钠排泄分数增加相关。既往研究已报道过主要靶向肾脏（尤其是近曲小管细胞）的纳米颗粒的开发。

尽管高血压存在性别差异，但雄性和雌性个体在高血压相关合并症方面表现相似。在一氧化氮抑制性高血压（LHTN）模型中，由于疾病病理未呈现显著性别差异，以往研究常将雄雌数据合并分析。在大鼠类似模型中，雄雌组间血压直至第15天才出现显著差异；而在小鼠血管紧张素II诱导高血压（A2HTN）模型中，14天内血压也无性别差异。我们既往研究发现，雄性和雌性LHTN及A2HTN小鼠均出现代偿性肾淋巴管生成，且淋巴管密度无性别差异。因此，将雄雌数据合并分析能更好地代表高血压群体。

既往研究表明，促淋巴管生成的VEGF-C疗法可增加肾脏、皮肤和心脏淋巴管，降低血压和/或减轻肾损伤。例如，隔日皮下注射重组VEGF-C能增加盐敏感性高血压小鼠的皮肤和肾淋巴管，显著降低收缩压和肾损伤；每周静脉注射VEGF-C逆转录病毒可使自发性高血压大鼠心脏淋巴管增加，收缩压从197 mmHg降至189 mmHg；通过微量泵输送重组VEGF-C至单侧输尿管梗阻（肾纤维化模型）小鼠，可显著减轻肾间质纤维化和炎症。虽然这些全身给药方式具有一定效果，但VEGF-C半衰期短，且VEGFR-3在全身多种组织细胞中表达，其脱靶效应尚未充分探讨。因此，特异性靶向肾脏递送促淋巴管生成因子可能代表一种新的抗高血压治疗策略。

我们先前提出了一种理论，将淋巴管增加与肾脏钠处理功能在钠潴留条件下对血压的调控联系起来。病变肾脏的间质可发生纤维化并扩张达60%以上，炎症状态下的液体负荷增加与淋巴管直径及最大宽度增加相关（本研究亦观察到该现象）。肾淋巴管生成与多种慢性炎症性疾病（包括高血压）相关。增强的淋巴网络能够输送更多淋巴液，可能导致间质扩张。这些肾脏生理学改变将产生更多肾组织液，改变肾流体动力学，并要求静脉毛细血管重吸收更多液体。毛细血管重吸收增加及淋巴活性增强将导致静脉回流增加。为补偿系统中增加的液体及其所致心肌拉伸，心脏将释放ANP，这可能是两种高血压模型NP治疗组小鼠FENa和尿钠浓度增加的原因。

另一理论探讨免疫细胞迁移与血压的关联。活化的肾免疫细胞水平升高与高血压等炎症性疾病密切相关，清除和/或改变这种免疫反应可预防高血压，证实活化肾免疫细胞在疾病病理中的关键作用。NP治疗组小鼠促炎免疫细胞减少可能是肾淋巴网络增强的结果——若淋巴管能高效将促炎免疫细胞迁出肾脏，这些细胞便无法通过分泌促炎细胞因子引发炎症，从而降低血压。其他关于肾特异性淋巴管生成降低血压的机制还包括细胞因子水平改变、RAAS系统调节、肾小管-肾小球反馈改善，以及VEGF-C对淋巴泵或其他细胞类型的特异性作用。

尽管VEGF-C与肿瘤发生存在相关性，但其具体机制仍在探索中。肿瘤与VEGFR-2和VEGFR-3的相互作用因起源器官而异。VEGFR-3配体水平升高与原发性肿瘤内部及周围的淋巴管生成相关，并通过淋巴网络增加肿瘤转移。值得注意的是，VEGFR-3特异性VEGF-C变体不会诱导肿瘤血管生成（后者对转移至关重要）。此外，高血压已知会增加肾细胞癌（RCC）风险，但淋巴管生成在人类RCC进展中的作用微小，且VEGF-A（而非B、C或D）与RCC的生理特征相关。因此，VEGF-C156S递送引发RCC的可能性较低，但长期治疗效果仍需观察。

我们既往证实基因诱导肾淋巴管生成可预防实验性高血压，但迄今尚未开发出基于纳米颗粒的肾脏特异性药理疗法通过影响淋巴系统对抗高血压。本研究中靶向肾脏的纳米颗粒能递送促淋巴管生成生长因子、诱导淋巴管生成并缓解高血压，具有临床转化潜力。纳米颗粒材料均获美国FDA批准，且VEGF-C突变体为重组蛋白，使得药物具备规模化生产和低成本优势。当然，推进该疗法仍需更多临床前及毒理学研究，但其有望成为替代或辅助抗高血压治疗的新策略。

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