八子补肾胶囊具有抗衰老特性，并能有效增强记忆力。

寻找支持八子补肾胶囊作用机制和生物标志物的证据。

将雄性C57BL/6J小鼠随机分为五组：正常组、衰老组、β-烟酰胺单核苷酸胶囊组、八子补肾胶囊低剂量组和高剂量组。后四组通过皮下注射d-半乳糖诱导衰老进程，同时分别对低剂量组、高剂量组和β-烟酰胺单核苷酸胶囊组灌胃给予八子补肾胶囊（每日1克/千克和2克/千克）及β-烟酰胺单核苷酸胶囊（每日100毫克/千克）进行治疗。60天后，观察整体衰老状态、脑神经元形态、p16INK4a、增殖细胞核抗原、离子化钙结合适配分子1、突触后密度蛋白95、CD11b、Arg1、CD206、Trem2、Ym1和Fizz1的表达变化，以及衰老相关分泌表型因子的变化。

与衰老组相比，高剂量组小鼠在体力、耐力、运动协调性、认知功能和神经元损伤方面均有明显改善。脑蛋白检测显示p16INK4a和离子化钙结合适配分子1表达下降，增殖细胞核抗原和突触后密度蛋白95表达上调。脑mRNA检测显示离子化钙结合适配分子1和CD11b表达下调，Arg1、CD206、Trem2、Ym1、Fizz1和突触后密度蛋白95表达上调，同时衰老相关分泌表型因子得到改善。

八子补肾胶囊通过抑制细胞衰老和小胶质细胞活化改善认知缺陷。本研究为八子补肾胶囊在认知缺陷临床实践中的广泛应用提供了实验依据。

一、介绍

衰老过程伴随着生理功能的渐进性退化，导致发病率和死亡率上升。大脑功能在衰老过程中逐渐衰退，表现为记忆、学习、探索能力以及协调性和运动能力的下降。这些现象增加了老年大脑对阿尔茨海默病、中风和帕金森病的易感性。

针对衰老机制的研究已被证明会影响与年龄相关的认知缺陷。细胞衰老和炎症可被视为衰老的标志，并可能在大脑衰老中发挥关键作用。使用NAD+前体烟酰胺核糖治疗APP/PS1小鼠后，其大脑中NAD+水平升高，促炎因子下调，细胞衰老减少，并激活了阿尔茨海默病脑中的小胶质细胞。

值得注意的是，源自草药的多种小分子已被证明可有效延缓衰老并对神经退行性疾病发挥保护作用。间歇性使用达沙替尼和槲皮素联合治疗APP/PS1小鼠，可选择性清除衰老的少突胶质前体细胞，并改善认知障碍和Aβ斑块相关炎症。槲皮素被指定为一种衰老细胞清除剂，因其能够通过选择性清除衰老细胞来延长健康寿命并降低年龄相关疾病的发病风险。最近，非瑟酮被确定为一种新型衰老细胞清除剂，能够通过抗炎过程、促进突触可塑性和消除细胞衰老来保护神经元并改善认知功能。

神经退行性疾病的发病机制复杂，涉及多种分子机制。因此，治疗神经退行性疾病应针对多个潜在分子靶点。中药及提取物能够以叠加甚至协同的方式作用于多种分子靶点，因而越来越多地用于治疗神经退行性疾病。八子补肾胶囊由16种中药组成，在临床研究中显示出缓解疲劳、治疗阳痿和男性不育、补肾及延缓衰老的显著功效。

通过超高效液相色谱/质谱联用技术分析，研究人员从八子补肾胶囊中鉴定出14种独特物质。这些物质包括绿原酸、黄酮类、苯乙醇苷、香豆素、木脂素以及萜类成分梓醇，其中含有多种抗衰老的天然植物成分，对年龄相关的认知缺陷具有保护作用。近期研究表明，八子补肾胶囊可有效调节脂质代谢，并治疗去卵巢雌性小鼠的绝经后动脉粥样硬化。

图1. 八子补肾胶囊与混合对照品的超高效液相色谱图。化合物3：新绿原酸；化合物5：绿原酸；化合物7：隐绿原酸；化合物13：异槲皮苷；化合物14：金丝桃苷；化合物17：毛蕊花糖苷；化合物22：朝藿定A；化合物24：淫羊藿苷；化合物29：宝藿苷I；化合物31：欧前胡素；化合物32：蛇床子素；化合物36：梓醇；化合物37：去氧五味子素；化合物39：五味子乙素。

表1. 相对峰面积精密度测试

此外，八子补肾胶囊可通过调节d-半乳糖和亚硝酸钠诱导的衰老小鼠的Sirt6/NF-κB和Sirt6/P53通路，改善睾丸形态退化和精子发生功能障碍。同时，该药物还能有效改善化学诱导衰老小鼠的大脑功能衰退，这可能与其保护氧化还原稳态、维持端粒完整性、抑制细胞凋亡以及激活Sirt6/P53-PGC-1α-TERT和Sirt6/NRF2/HO-1信号通路有关。目前，八子补肾胶囊延缓衰老和改善大脑衰老的具体机制仍需进一步研究。此外，该药物是否通过抑制细胞衰老和神经炎症这两个导致衰老的关键因素来防治大脑衰老，也有待进一步阐明。

东莞市富临塑胶原料有限公司是IITC神经科学设备中国代理商，为中国客户提供神经科学产品：大小鼠血压测量系统、足底测痛仪、疲劳转棒仪、大小鼠跑步机。

本研究采用d-半乳糖诱导的小鼠衰老模型，探讨八子补肾胶囊对年龄相关认知缺陷的作用及机制。结果表明，八子补肾胶囊能有效减轻神经元损伤，改善突触密度和可塑性下降，从而预防年龄相关的认知功能衰退。这些作用可能与其抑制神经炎症和细胞衰老有关。

二、材料与方法

01.药品与试剂

八子补肾胶囊由IITC提供，β-烟酰胺单核苷酸胶囊同样由IITC提供。将八子补肾胶囊和β-烟酰胺单核苷酸胶囊分别悬浮于0.5%羧甲基纤维素钠溶液中，通过灌胃给药方式给予小鼠。d-半乳糖购自Sigma-Aldrich公司，溶解于经0.22微米微孔膜过滤的灭菌注射用水中。每只小鼠每日一次在颈背部皮下注射d-半乳糖溶液。

02.实验与样本制备

70只C57BL/6J雄性小鼠来自北京维通利华实验动物技术有限公司。每笼饲养5只小鼠，饲养环境保持20-26摄氏度，湿度40-70%，12小时光暗循环，自由获取饮水和食物。本研究经河北以岭中医药研究院伦理委员会批准。

经过30天适应期后，将小鼠随机分为以下五组：正常组、衰老模型组、β-烟酰胺单核苷酸组、八子补肾胶囊低剂量组和高剂量组。后四组小鼠每日皮下注射溶解于灭菌注射用水的d-半乳糖，连续60天以诱导衰老进程。正常组小鼠每日注射等体积灭菌注射用水。

从造模第一天起，β-烟酰胺单核苷酸组每日灌胃给予100毫克/千克剂量的β-烟酰胺单核苷酸悬浮液。八子补肾胶囊低、高剂量组在8周实验期间分别每日灌胃给予1克/千克和2克/千克剂量的药物悬浮液。正常组和衰老模型组小鼠给予等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液。具体实验流程见图2。

图2. 八子补肾胶囊治疗d-半乳糖诱导衰老小鼠的研究设计示意图

03.外观与毛发特征

在造模完成并结束治疗流程后的第二天，对小鼠的外观、毛色和光泽度进行观察并拍摄记录。

04.悬吊试验

首先进行悬吊试验以评估小鼠行为表现。将小鼠置于悬挂网架上，待其牢固抓握网面后翻转网架，记录每只小鼠从开始至落地所持续的时间。

05.抓力测试

随后进行抓力测试。将小鼠置于与测力网架相同的位置，待其四肢牢固抓握网面后，平行于检测网牵引小鼠尾部。该测试重复三次，采用数字测力仪记录抓力强度并显示最大值。

06.转棒实验

使用IITC转棒式跑步机进行实验。将小鼠置于纹理滚筒上，初始转速为5转/分钟，最高转速30转/分钟，加速时间30秒，测试时长180秒。当小鼠跌落到下方感应平台时记录结果。连续进行三天适应性训练，第四天进行正式测试。

07.巴恩斯迷宫实验

最后进行巴恩斯迷宫测试。实验前在地面铺设白色背景以便区分小鼠。每只小鼠被放入目标箱适应3分钟（该目标箱设有台阶和暗区以便小鼠更容易逃脱）。

训练开始时，将小鼠置于迷宫中心的光线隔离箱内限制活动5秒。移除隔离箱后启动计时，研究人员在幕布后方观察。当小鼠四肢全部进入目标箱时记为逃脱成功，并让小鼠在箱内停留30秒。

每只小鼠每次观察时间最长3分钟。若未能找到目标箱，则将其移出迷宫并放入目标箱停留30秒。每次测试前用75%酒精擦拭迷宫区域，避免小鼠依赖嗅觉而非记忆。连续三天每日训练一次，第四天进行正式测试。

正式测试时，将小鼠限制在光线隔离箱内5秒，移除箱体后使用动物行为视频分析系统开始采集数据。数据采集时长3分钟，期间小鼠可自由活动。时间阈值设定为1秒，当小鼠进入目标箱并停留至少1秒时终止测试。记录每只小鼠抵达目标箱的逃逸潜伏期和错误次数（定义为头部伸入或探索非目标孔洞的次数）。

08.体重与脏器系数

每周测量一次小鼠体重。所有测试结束后处死小鼠，采用高精度电子天平称量脏器重量。脏器系数按以下公式计算：

09.脑组织形态学分析

采用4微米厚脑组织切片进行苏木精-伊红染色。切片经二甲苯脱蜡后，通过梯度酒精和蒸馏水进行水化处理。苏木精染色10分钟，盐酸酒精分化，流水冲洗15分钟。伊红复染细胞核1分钟。使用数字切片扫描系统观察形态学变化并采集图像。

10.尼氏染色

取6微米厚脑组织切片，经脱蜡水化处理后，用甲苯胺蓝溶液在60°C条件下染色30分钟。流水冲洗后，用95%乙醇快速分化。最后将切片彻底干燥并用中性树脂封片。

11.免疫组化检测

切片经脱蜡、水化和抗原修复后，使用SP检测系统封闭内源性过氧化物酶和非特异性蛋白结合位点。去除切片表面液体后，加入一抗并于4°C孵育过夜。所用一抗包括兔抗p16INK4a多克隆抗体和兔抗增殖细胞核抗原单克隆抗体。

次日，用磷酸盐缓冲液洗涤切片三次，每次10分钟。加入生物素标记的山羊抗兔IgG聚合物，孵育15分钟后PBS洗涤。再加入HRP标记的链霉亲和素孵育15分钟。PBS洗涤后，室温下二氨基联苯胺显色3-5分钟，复染后封片。使用数字切片扫描系统观察并采集图像。

12.免疫荧光检测

切片脱蜡水化后，用0.01M柠檬酸钠抗原修复缓冲液进行抗原修复。10%驴血清湿盒封闭1小时以阻断非特异性蛋白和内源性Fc片段结合位点。加入一抗于4°C孵育过夜，所用一抗包括兔抗突触后密度蛋白95多克隆抗体和兔抗离子钙结合适配分子1单克隆抗体。

孵育结束后，摇床上用PBS洗涤三次，每次10分钟。加入驴抗兔IgG抗体于37°C避光孵育1小时。洗涤后室温避光条件下用DIPA孵育1小时。使用激光共聚焦显微镜分析切片。

13.蛋白质印迹分析

采用高效RIPA组织细胞裂解液和PMSF从脑组织中提取蛋白质。使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。每孔上样40微克蛋白，在预制聚丙烯酰胺凝胶中120V电泳分离，后转印至硝酸纤维素膜。

37°C封闭1小时后，加入单克隆或多克隆抗体于4°C孵育过夜。所用一抗针对p16INK4a、PCNA、Iba1和PSD95，β-actin抗体作为内参。次日加入山羊抗兔IgG抗体于37°C避光孵育1小时。使用Odyssey成像系统和图像分析软件，以β-actin为内参蛋白通过灰度扫描定量目标蛋白含量。

表2. 一抗与二抗信息表

14.RNA提取与实时定量PCR分析

采用TRIzol试剂从脑组织中提取总RNA，使用NanoDrop系统进行RNA定量检测。通过PCR扩增仪和实时荧光定量PCR试剂盒，将RNA反转录为cDNA并进行扩增反应。以GAPDH作为内参基因，采用2–ΔΔCt法计算各基因的表达水平。实时定量PCR所用引物序列详见表3。

表3. 基因检测引物序列信息表

15.磁珠液相芯片检测

采用非变性组织细胞裂解液裂解小鼠脑组织，使用BCA蛋白检测试剂盒对脑蛋白进行定量。将脑组织和血浆蛋白样品置于高速离心机中，以16000×g离心4分钟。将蛋白质样品按1:1比例稀释（75μL样品蛋白+75μL校准稀释液RD6-52）并充分混匀。使用小鼠多因子检测试剂盒对稀释后的蛋白进行定量检测。检测前将试剂恢复至室温。

表4. 磁珠液相芯片检测指标列表

向微孔板各孔中加入50μL标准品或样本溶液，使用涡旋振荡器重悬稀释后的微球混合液。每孔加入50μL微球混合液，用锡箔纸紧密覆盖以避免光照。将微孔板置于微量板振荡器上，在室温条件下以800rpm振荡孵育2小时。

采用磁分离装置清洗微孔板，静置1分钟后去除液体。每孔加入100μL清洗缓冲液，静置1分钟后去除。重复清洗三次后，向每孔加入50μL稀释的生物素标记抗体混合液。

用锡箔纸密封微孔板，在振荡器上以800rpm室温孵育1小时，再次进行清洗。每孔加入50μL稀释的链霉亲和素-PE溶液并避光保存。密封微孔板后在振荡器上以800rpm室温避光孵育30分钟，重复清洗步骤。每孔加入100μL清洗缓冲液，在振荡器上以800rpm重悬微球2分钟。使用磁珠液相芯片分析系统在90分钟内完成数据读取。

16.统计学分析

行为学测试、脏器系数、基因蛋白表达及衰老相关分泌表型因子数据采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis H检验进行组间比较，并进行事后检验。p值小于0.05视为具有统计学显著性。

三、结果

01.八子补肾胶囊改善衰老小鼠整体功能状态

衰老组小鼠毛发灰白且脱落严重（图3A）。低剂量和高剂量组小鼠毛发颜色更深、更有光泽且更浓密。实验开始时各组小鼠体重无显著差异（p>0.05，图3B）。但在给药最后一周，正常组、β-烟酰胺单核苷酸组及两个给药组小鼠体重均显著高于衰老组（p<0.05）。脏器系数结果显示，与正常组相比，衰老组大脑、脾脏和胸腺系数均下降（p<0.01），而给药组这些器官系数较衰老组显著升高（p<0.01）（图3C）。悬吊试验、抓力测试和转棒实验表明，衰老组的耐力、力量和运动协调性最差（图3D）。与衰老组相比，低剂量组抓力强度显著提高（p<0.05），高剂量组提高更为明显（p<0.01）。高剂量组小鼠的耐力和运动协调性较衰老组显著增强（p<0.01）。β-烟酰胺单核苷酸组与衰老组在耐力和运动协调性方面无显著差异（p>0.05）。这些结果表明，八子补肾胶囊能改善衰老小鼠的外观、体重、脏器系数、耐力、力量和运动协调性。

图3. 八子补肾胶囊治疗对d-半乳糖诱导衰老小鼠年龄相关行为和指标的影响。（A）小鼠外观（B）给药期间体重变化（n=10-15）（C）给药后大脑、脾脏和胸腺系数（n=3）（D）悬吊试验、抓力测试和转棒实验结果（n=7）。**表示与正常组比较p<0.01，***表示p<0.001；#表示与衰老组比较p<0.05，##表示p<0.01，###表示p<0.001。

02.八子补肾胶囊改善衰老小鼠认知缺陷与神经元损伤

大脑衰老是最早出现的衰老标志之一，主要表现为认知功能障碍。巴恩斯迷宫测试显示，衰老组小鼠的逃逸潜伏期和错误次数表现最差（图4A,B）。与衰老组相比，低剂量组逃逸潜伏期显著缩短（p<0.01），高剂量组缩短更为明显（p<0.001）。高剂量组错误次数显著低于衰老组（p<0.01）。衰老组学习记忆能力显著下降，而八子补肾胶囊治疗能有效改善衰老小鼠的认知功能衰退。

图4. 八子补肾胶囊对d-半乳糖诱导衰老小鼠认知缺陷和神经元损伤的影响。（A）巴恩斯迷宫测试轨迹图（B）巴恩斯迷宫测试逃逸潜伏期和错误次数（n=7）（C）海马DG区和皮层区神经元形态HE染色图像（×400倍）（D）海马DG区和皮层区尼氏小体甲苯胺蓝染色图像（×400倍）。**表示与正常组比较p<0.01，***表示p<0.001；#表示与衰老组比较p<0.05，##表示p<0.01，###表示p<0.001。

神经元是脑组织的主要构成单元。尼氏体作为神经元内的斑块状或颗粒状物质，可有效反映神经元功能状态。海马体和大脑皮层是影响认知功能最重要的两个脑区。HE染色和尼氏染色结果显示，衰老组小鼠海马齿状回和皮层区域的尼氏体数量减少且出现溶解现象（图4C,D）。经八子补肾胶囊治疗后，衰老小鼠海马齿状回和皮层区域尼氏体数量减少和溶解现象得到明显改善。这些结果表明八子补肾胶囊能有效改善认知缺陷和神经元损伤。

03.八子补肾胶囊提高衰老小鼠脑组织突触密度与可塑性

突触密度和可塑性下降直接导致认知功能障碍。PSD95是维持突触后膜受体活性和稳定性的关键蛋白。免疫荧光、蛋白质印迹和实时定量PCR分析显示，与正常组相比，衰老组海马和皮层区域PSD95表达量显著降低（p<0.05，图5A-E）。高剂量组海马和皮层区域PSD95表达量显著升高（p<0.01）。这些结果表明八子补肾胶囊能有效维持突触密度和可塑性。

图5. 八子补肾胶囊对d-半乳糖诱导衰老小鼠突触密度和可塑性的影响。（A）海马DG区PSD95蛋白免疫荧光染色图像（红色，×400倍）（B）皮层区PSD95蛋白免疫荧光染色图像（红色，×400倍）（C）A、B图中PSD95表达定量分析（n=3）（D）海马和皮层组织PSD95及β-actin的蛋白质印迹分析。图示PSD95定量结果，以β-actin作为内参蛋白（n=3）（E）海马和皮层组织PSD95 mRNA水平的实时定量PCR分析，以GAPDH基因作为内参（n=3）。*表示与正常组比较p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001；#表示与衰老组比较p<0.05，##表示p<0.01，###表示p<0.001。

04.八子补肾胶囊抑制衰老小鼠脑组织小胶质细胞活化并促进保护表型

衰老大脑中活化的小胶质细胞会产生有害于突触功能的炎症因子。Iba1是小胶质细胞的特异性标志物。免疫荧光、蛋白质印迹和实时定量PCR分析显示，与正常组相比，衰老组海马和皮层区域Iba1表达量显著升高（p<0.05，图6A-E）。而八子补肾胶囊治疗能有效抑制这种升高趋势（p<0.01）。

图6. 八子补肾胶囊对d-半乳糖诱导衰老小鼠小胶质细胞活化和极化的影响。（A）海马DG区Iba1蛋白免疫荧光染色图像（红色，×400倍）（B）皮层区Iba1蛋白免疫荧光染色图像（红色，×400倍）（C）A、B图中Iba1表达定量分析（n=3）（D）海马和皮层组织Iba1及β-actin的蛋白质印迹分析。图示Iba1定量结果，以β-actin作为内参蛋白（n=3）（E）海马和皮层组织Iba1、CD11b、Arg-1、Trem-2、CD206、Fizz1和Ym1的实时定量PCR分析，以GAPDH基因作为内参（n=3）。*表示与正常组比较p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001；#表示与衰老组比较p<0.05，##表示p<0.01，###表示p<0.001。

小胶质细胞可根据环境条件分化为保护型（M2表型）或损害型（M1表型）。实时定量PCR结果（图6E）显示，衰老组脑组织中M1表型标志物CD11b的mRNA表达升高，而M2表型标志物Arg1、Fizz1、Trem-2、CD206和Ym1的表达降低（p<0.05）。高剂量组CD11b表达下降，Arg1、Fizz1、Trem-2、CD206和Ym1表达上调（p<0.05）。这些结果表明八子补肾胶囊能抑制小胶质细胞活化，并促使其向保护型状态转化。

05.八子补肾胶囊减轻衰老小鼠脑组织细胞衰老

细胞增殖的永久性停滞被称为细胞衰老。P16INK4a是细胞周期停滞的关键因子，PCNA则是与细胞周期相关的基因。免疫组化和蛋白质印迹结果表明，与正常组相比，衰老组海马DG区和皮层区域p16INK4a表达升高（p<0.05），PCNA表达降低（p<0.01）（图7A-F）。高剂量组海马DG区和皮层区域PCNA表达较衰老组显著升高（p<0.001），p16INK4a表达降低（p<0.05）。这些结果表明八子补肾胶囊能抑制衰老大脑中的细胞增殖停滞，促进细胞增殖。

图7. 八子补肾胶囊对d-半乳糖诱导衰老小鼠p16INK4a和PCNA表达的影响。（A）海马DG区和皮层区域PCNA蛋白免疫组化染色图像（×200倍）（B）海马DG区和皮层区域p16INK4a蛋白免疫组化染色图像（×200倍）（C）A图中PCNA表达定量分析（n=3）（D）B图中p16INK4a表达定量分析（n=3）（E）海马和皮层组织p16INK4a、PCNA及β-actin的蛋白质印迹分析（F）C图中p16INK4a和PCNA表达定量分析，以β-actin作为内参蛋白（n=3）。*表示与正常组比较p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001；#表示与衰老组比较p<0.05，##表示p<0.01，###表示p<0.001。

06.八子补肾胶囊抑制衰老小鼠血浆和脑组织中SASP因子分泌

细胞衰老伴随的增殖停滞状态具有炎症表型，即衰老相关分泌表型（SASP），表现为促炎因子、趋化因子、金属蛋白酶和生长因子的分泌。血浆SASP因子的磁珠液相芯片检测结果显示（图8A），与正常组相比，衰老组促炎因子IL-1β、IL-1α、IL-2和基质金属蛋白酶MMP-9水平显著升高（p<0.05）。高剂量组IL-1β、IL-1α和MMP-9水平较衰老组显著降低（p<0.05）。衰老组TNF-α、CCL3、IGFBP-3、IL-6、GM-CSF、endoglin、ICAM-1、PAI-1和CRP表达升高，经八子补肾胶囊治疗后有所下降，但差异未达统计学显著性。此外，与正常组相比，衰老组IL-10表达显著降低（p<0.05），而八子补肾胶囊治疗能显著提高血浆中IL-10水平（p<0.01）。

图8. 八子补肾胶囊对d-半乳糖诱导衰老小鼠SASP和抗炎因子的影响。（A）血浆中IL-1β、IL-1α、TNF-α、IL-2、IL-6、ICAM-1、GM-CSF、endoglin、PAI-1、IGFRP3、CCL2、CCL3、MMP-3、MMP-9、CRP和IL-10水平的磁珠液相芯片检测。CCL-2和MMP3因超出标准曲线范围未检出。（B）海马和皮层组织中上述因子的磁珠液相芯片检测结果。*表示与正常组比较p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001；#表示与衰老组比较p<0.05，##表示p<0.01，###表示p<0.001。

此外，研究人员通过磁珠液相芯片检测评估了脑组织中SASP因子的表达情况（图8B）。衰老组脑组织中IL-1β、ICAM-1、MMP-3和MMP-9的表达均高于正常组。高剂量组脑组织中ICAM-1、MMP-3和MMP-9水平显著降低。衰老组脑组织中CCL2、CCL3、IL-2、IGFBP-3、PAI-1和CRP表达升高，经八子补肾胶囊治疗后有所下降，但差异未达统计学显著性。这表明八子补肾胶囊能抑制血浆和脑组织中的SASP因子，并上调抗炎因子表达。

四、讨论

本研究结果表明，八子补肾胶囊通过减缓突触功能衰退和保护神经元来改善认知缺陷，这可能与其抑制细胞衰老、减少SASP因子分泌以及调节小胶质细胞活化和极化有关。

大脑衰老是神经退行性疾病发生的重要因素，主要表现为认知功能缺陷。d-半乳糖诱导的衰老模型能模拟人类衰老过程，被广泛用于评估抗衰老及年龄相关认知缺陷药物的药效学。该模型基于长期暴露于d-半乳糖会导致脑部炎症这一大脑衰老标志。在d-半乳糖诱导的衰老啮齿类动物中，大脑衰老表现为毛发脱落、运动能力下降和认知缺陷。本研究成功建立了d-半乳糖诱导的小鼠衰老模型。与衰老组相比，八子补肾胶囊治疗能有效改善d-半乳糖诱导衰老小鼠的认知缺陷、毛发脱落、运动能力下降等年龄相关指标。

神经元是脑组织的主要组成部分，通过接收、整合、传导和输出信息进行信息交换。尼氏体是神经元中的斑块状或颗粒状物质，由大量粗面内质网和游离核糖体组成，主要合成细胞器更新所需的蛋白质。尼氏体可作为神经元功能状态的标志物。受损神经元中的尼氏体会出现减少、缺失和溶解现象。在神经元损伤恢复过程中，尼氏体可增加并恢复正常水平。本研究显示八子补肾胶囊能保护d-半乳糖诱导衰老小鼠的神经元损伤并改善认知缺陷。

突触可塑性是指通过调整神经元间连接强度来实现信号传输效率动态变化的特性。突触可塑性受损和突触密度下降是认知缺陷的直接原因。PSD95是突触后膜中最丰富的蛋白质，对维持该膜上受体的活性和稳定性至关重要。本研究发现八子补肾胶囊通过增强衰老小鼠的突触密度和可塑性来改善认知缺陷。

d-半乳糖引起的神经炎症是突触可塑性受损和突触密度下降的主要原因。小胶质细胞是中枢神经系统中的一种先天免疫细胞，是主动免疫防御的首要防线。在损伤、病原体或病理应激的刺激下，静息状态的小胶质细胞通过极化过程被激活为损害型和保护型两种状态。损害型小胶质细胞产生包括TNF-α和IL-1β在内的促炎细胞因子，而保护型小胶质细胞则分泌包括IL-10在内的抗炎细胞因子。

在衰老大脑中，小胶质细胞通常呈现M1极化状态，其特征是产生促炎因子和阿米巴样形态。逆转或阻断小胶质细胞从M2向M1表型转化的策略对治疗神经退行性疾病具有巨大潜力。本研究中，八子补肾胶囊抑制了d-半乳糖诱导衰老小鼠海马和皮层中Iba1水平的升高。在转录水平上，八子补肾胶囊降低了衰老小鼠海马和皮层区域损害型小胶质细胞基因的表达，同时上调了保护型小胶质细胞基因的表达。此外，八子补肾胶囊治疗显著提高了衰老小鼠血浆中抗炎因子的水平。因此，我们认为八子补肾胶囊通过抑制小胶质细胞活化和调节其极化状态，从而发挥抗神经炎症和神经保护作用来改善衰老小鼠的认知缺陷。

衰老细胞的积累已被广泛认为是认知障碍的重要因素。一些源自草药的天然化合物，如非瑟酮、槲皮素和姜黄素，已被证明可通过清除衰老细胞来治疗认知缺陷。炎症是导致细胞衰老的关键因素。因此，我们推测细胞衰老参与了以低度慢性炎症为特征的d-半乳糖诱导衰老小鼠的认知缺陷。

研究表明，在侵袭性tau蛋白病模型发病前持续清除表达p16INK4a的衰老细胞，对神经胶质增生、神经变性和认知能力下降具有显著改善作用。神经前体细胞的增殖随着年龄增长而下降。PCNA是维持活跃生长细胞增殖不可或缺的标志物。PCNA的纯合错义序列改变可导致神经变性和早衰。研究发现，PCNA的转移和积累可使来自成年衰老个体骨髓的干细胞恢复活力。

衰老细胞具有SASP特征，表现为分泌促炎因子。长期暴露于这些因子会导致炎症，从而引起衰老大脑的认知能力、突触密度和可塑性下降。相应地，我们检测了d-半乳糖诱导衰老小鼠中p16INK4a、PCNA和SASP因子的表达水平。正如预期，细胞衰老参与了d-半乳糖诱导衰老小鼠的认知缺陷，而八子补肾胶囊治疗抑制了衰老小鼠海马和皮层区域的细胞衰老。

此外，ICAM-1、MMP-9和MMP-3在神经疾病中过度表达，作为促炎因子参与神经炎症的发展。八子补肾胶囊治疗降低了血浆中IL-1α、IL-1β和MMP-9的表达，并显著下调了海马和皮层中ICAM-1、MMP-3和MMP-9的表达。这些结果表明，炎症引起的细胞衰老导致了d-半乳糖诱导衰老小鼠的认知缺陷。

八子补肾胶囊通过抑制细胞衰老和神经炎症，改善突触密度和可塑性下降，保护神经元，从而改善认知缺陷。但本研究存在一些局限性：首先，八子补肾胶囊的成分物质尚未完全明确；其次，需要进一步研究八子补肾胶囊通过细胞衰老改善大脑衰老的潜在作用机制。

五、结论

我们的研究结果表明，八子补肾胶囊通过改善突触密度和可塑性下降，保护神经元，从而改善d-半乳糖诱导衰老小鼠的认知缺陷。这些作用可能与八子补肾胶囊抑制细胞衰老、调节小胶质细胞活化和极化有关（图9）。本研究为八子补肾胶囊治疗年龄相关认知缺陷的作用机制提供了证据。

图9. 示意图显示八子补肾胶囊减轻细胞衰老和SASP因子分泌，调节小胶质细胞活化和极化，将活化小胶质细胞从损害表型转化为保护表型。八子补肾胶囊改善神经元损伤、突触丢失和突触功能障碍，对认知缺陷发挥神经保护作用。

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