什么检测波长徐振林&刘英菊：氧化物酶活性MnO2-Au“关开”型双波长比率免疫传感器检测蜡样芽孢杆菌

新闻资讯2026-04-23 20:33:09

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蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus,
B.cereus）作为一种机会致病菌，已导致越来越多的呕吐和腹泻性食物中毒事件，严重者甚至导致暴发性肝衰竭和死亡。因此，迫切需要对B.cereus进行灵敏、快速的检测。目前，细菌培养、生化测定和基于核酸的检测方法是目前B.cereus主要的检测方法。然而，这些方法不仅检测耗时长且需要训练有素的检测人员，限制了其在B.cereus快速诊断中的应用。基于抗体的免疫分析技术由于其简单、快速、灵敏、准确的特性，已成功应用于医疗保健、环境监测和食品安全等许多领域。已报道了一种ELISA方法用于检测B.cereus，方法的线性检测范围为1.0×104-2.8×106 cells/mL。然而，一些食物中毒事件中每克食物含有的B.cereus远低于该方法的检测限。因此，有必要开发更灵敏的免疫测定法来检测B.cereus。
传统ELISA常采用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（ALP）等生物酶对显色底物的催化显色来对目标物进行定量检测。然而，生物酶的高成本和严格的存储条件限制了它们的实际应用。近年来，具有混合表面价态的金属氧化物纳米酶因其成本低、制备方便和稳定性优异而受到广泛关注。作为过渡金属氧化物中最活跃的催化剂，锰基氧化物，特别是MnO2，在自然界中含量丰富，已被开发作为氧化酶模拟物进行应用。此外，由于Au与巯基或氨基的完美结合能力，AuNP常用于固定不同的蛋白质，而三维的MnO2纳米花可以为AuNP沉积提供更多的活性位点。因此，MnO2上AuNP使得MnO2-Au复合物能够直接与抗体结合而无需任何修饰，这大大简化了免疫传感器的制备步骤。
荧光免疫分析法因其灵敏度高而引起广泛关注。然而，重复性差和环境干扰是其固有的缺点。相比之下，基于相同激发波长下两个不同发射波长的荧光强度的比率荧光免疫分析能消除背景荧光的干扰。因此，本研究建立了一种拟氧化酶介导的比率荧光ELISA检测B.cereus。在该检测体系中，MnO2-Au纳米花可以氧化邻苯二胺（OPD），其氧化产物2,3-二氨基吩嗪（DAP）在570nm处的荧光信号作为检测信号，而蓝色碳量子点（bCD）在455nm处的荧光信号作为参考信号。二者可以发生荧光共振能量转移（FRET），响应信号增强而参考信号减弱。通过以MnO2-Au纳米花作为拟氧化酶替代传统ELISA中常用的HRP并与B.cereus多克隆抗体（pAb）结合，建立了检测B.cereus的比率荧光ELISA，方法检测限为1.7×102 CFU/mL，线性范围为1.7×102-3.3×106 CFU/mL。与传统夹心ELISA相比，新方法的检测时间缩短了43分钟，方法灵敏度提高了5倍，表明所建立的比率荧光ELISA作为一种快速、方便的B.cereus筛检平台具有巨大潜力。
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MnO2-Au、MnO2-Au-pAb、bCD的合成与表征
首先，通过两步法进行修饰合成了MnO2-Au。合成后的MnO2-Au首先利用扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）进行了形态表征，SEM图像表明MnO2-Au整体为3D花状纳米球形态，而透射电子显微镜（TEM）图像表明AuNP分布在MnO2纳米花的表面和褶皱上。此外，MnO2-Au纳米花的元素图谱显示，三种元素（Mn、O和Au）均匀分布在MnO2-Au纳米材料中，X射线光电子能谱（XPS）和能量色散光谱仪（EDS）光谱图也验证了合成的MnO2-Au具有Mn、O、Au的特征峰。傅里叶红外光谱（FT-IR）证明了MnO2晶胞的存在。而通过将MnO2-Au纳米花的X射线衍射图（XRD）与标准卡进行比对发现所合成的MnO2-Au纳米花具有MnO2与Au的晶面特征峰。多种手段表征MnO2-Au纳米花合成成功。随后，为验证和表征所合成MnO2-Au的氧化物酶活性，以以OPD为底物，进行了酶催化稳态动力学实验。结果表明，MnO2-Au可以在不添加过氧化氢的情况下将无色OPD直接氧化为黄色的DAP。随后，通过以不同浓度的OPD和其对应的初始催化反应速度绘制了相应的米氏方程，通过双倒数Lineweaver-Burk图计算出以OPD为底物的MnO2-Au的Km值为0.22mM，表明所合成的MnO2-Au纳米花具有高的氧化酶模拟活性。
随后，将合成的MnO2-Au纳米花和B.cereus pAb通过静电吸附组装合成MnO2-Au-pAb探针。合成的MnO2-Au-pAb探针用zeta电位和紫外光谱对其进行表征。zeta电位测定显示，MnO2-Au zeta电位为-16 mV，在与pAb吸附结合后zeta电位显著降低至-6 mV。此外，在紫外光谱中，280nm处出现了归因于蛋白质的吸收峰。综上实验结合验证了MnO2-Au-pAb探针的成功合成。
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图1: 用于B.cereus检测的比率荧光免疫传感器

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图2: MnO2-Au纳米花合成后表征，A-G分别为MnO2-Au的SEM、TEM、HRTEM、元素图谱、EDS、FT-IR、XRD图

以柠檬酸二铵和尿素为反应原料在高温条件下合成了bCD，利用TEM表征了bCD的形态，发现所合成的bCD为平均直径为1.75-2.5
nm的均匀分散球形纳米颗粒。所合成的bCD可在365 nm激发下发出耀眼的蓝色荧光。随后，通过FT-IR光谱进一步证明了bCD的结构中的官能团组成，验证了所合成的bCD结构中包含-NH2、-COOH和-OH等基团。通过XPS表征探测了bCD的表面状态，其中在全扫描测量中出现了三个尖锐的峰，对应于O
1s、N1s和C 1s的结合能。高分辨率C1
s光谱在288.5、286.3、285.4和284.8 eV处被解卷积为四个峰，分别归因于C=O、C-OH、C-N和C-C的键，而O1
s的533.2、532.5和531.7 eV处的三个拟合峰分别分配给C-O、C-O和O-H键。高分辨率N
1s光谱则显示bCD结构中存在吡咯N（400.2eV）、氨基N（399.5eV）和吡啶N（398.9eV）的三种化学态N。以上表征均初步确证了bCD的成功合成。随后对bCD的光学性质进行进一步表征，发现bCD的荧光发射光谱与其激发波长无关，当激发波长为360nm时，bCD的对于的荧光强度最强。此外，bCD的浓度也会影响bCD的荧光。通常，在稀释溶液中，荧光强度与荧光物质的浓度呈正相关。然而，如果浓度过高，荧光物质的自吸附是不可避免的，最终可能会发现荧光强度降低，实验验证表明，1.25
mg/mL的bCD具有最强的荧光发射。因此，选择1.25mg/mL作为bCD的工作浓度。此外，检测溶液的pH也会影响荧光，实验表明bCD仅在中性环境（pH=7.0）中具有强烈的荧光发射，并且在酸性和碱性条件下荧光强度显著降低。因此，最终选择了7.0的pH值作为后续工作PH。随后，研究了作为供体的bCD和作为受体的DAP之间的FRET过程。如图4D所示，单个MnO2-Au或OPD对bCD的荧光没有显著影响。此外，OPD在360nm的激发下不能发出任何荧光，但当MnO2-Au与OPD混合时，DAP的强荧光峰出现在570nm，表明MnO2-Au可以有效地催化OPD的氧化生成具有荧光的DAP。通过向OPD/bCDs溶液中引入MnO2-Au，bCDs的荧光发生显著淬灭，导致了比率荧光响应的出现。随后，进一步研究了OPD+MnO2-Au混合物对bCD的猝灭机理。如图4E所示，OPD+MnO2-Au混合物的荧光激发光谱和紫外-可见吸收光谱与bCD的荧光发射光谱极为重叠，这满足触发FRET的基本条件。此外，评估了存在和不存在OPD/MnO2-Au条件下的bCD的荧光寿命。如图4F所示，加入MnO2-Au+OPD前后bCD的荧光寿命分别为5.17ns和3.90ns，因此，可以验证bCD和OPD/MnO2-Au之间的FRET是导致bCD荧光淬灭的原因。

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图3: bCD合成后表征，A-C分别为bCD的TEM、FT-IR、XPS图，D-F分别为XPS图中O 1s、N1s和C 1s的解卷积图

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图4: A : bCD在不同激发波长下的荧光发射光谱; B和C分别为不同浓度和不同PH条件下的bCD的荧光强度；D : bCD、bCD+OPD、bCD+MnO2-Au、OPD+MnO2-Au、bCD+OPD+MnO2-Au的荧光发射光谱；E: bCD的荧光激发和发射光谱、OPD+MnO2-Au混合物的荧光激发光谱和紫外吸收光谱；F : 存在和不存在OPD+MnO2-Au条件下的bCD的荧光寿命
用于B.cereus测定的比率荧光免疫分析方法的建立
基于所合成具有氧化物酶活性的MnO2-Au-pAb探针及bCD和MnO2-Au+OPD构成的比率荧光体系建立了用于B.cereus测定的比率荧光夹心ELISA。优化了相关实验参数，包括pH值、孵育温度、OPD浓度、孵育时间和bCD的工作浓度。在夹心ELISA中，B.cereus单克隆抗体（mAb）被预先吸附在96孔板上以捕获B.cereus，然后与MnO2-Au-pAb形成夹心复合物。因此，更高浓度的B.cereus可以结合更多的MnO2-Au-pAb，导致更强的FRET过程的出现。因此，在一系列B.cereus浓度的情况下，比率荧光夹心ELISA测定B.cereus的相应校准图如图5A和5B所示。如图5A所示，B.cereus的引入可以淬灭bCD的荧光，同时可以增强DAP的荧光。当B.cereus浓度从5.6×101增加到1×107 CFU/mL时，DAP和bCD的荧光强度分别表现为逐渐增加和降低。而DAP在570nm处和bCD在455nm处的荧光强度比值I570/I455与B.cereus浓度对数之间呈现线性相关关系，线性方程为y = 0.89x-1.41，线性范围为1.7×102至3.3×106 CFU/mL，相关系数为0.99。所建立的比率荧光夹心ELISA检测限（LOD）为1.7×102 CFU/mL。与传统的双抗体夹心ELISA相比，比率荧光夹心ELISA检测时间缩短为43分钟，灵敏度提高了约5倍（LOD: 9×102 CFU/mL）。此外，以不同浓度的B.cereus直接用牛奶稀释以建立了基质标准曲线，发现在检测过程中没有基质效应，所建立的比率荧光夹心ELISA具有低检测限和宽线性范围，这使其成为测定B.cereus的高灵敏度方法。此外，通过引入相应的抗体，该免疫传感平台可以扩展到检测不同的食源性病原体，这为监测食品安全提供了方便的方式。
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图5: A : 不同浓度B.cereus对应的荧光响应；B : I570/I455与B.cereus浓度对数之间的线性关系

方法的特异性和稳定性评估及实际样本检测

为考评所建立比率荧光传感器的检测特异性，验证了方法对于B.cereus和非靶标细菌（苏云金杆菌、分枝杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌）的荧光响应。如图6A所示，尽管非靶标细菌的浓度是B.cereus的100倍，但结果表明，比率荧光免疫传感器对所有干扰性的非靶标菌表现出可忽略的荧光响应，但对B.cereus表现出显著的荧光响应。随后，对所建立比率荧光免疫传感器的稳定性进行了考评。在不同的时间（2、4、6、8、10、12和14天）条件下记录了传感器在1.0×105 CFU/mL浓度下对B.cereus的荧光响应，结果表明，I570/I455的值仅随时间的增加略有波动，表明所建立比率荧光免疫传感器具有优异稳定性。

使用牛奶作为待测样本来评估所建立比率荧光免疫传感器的实际样本检测性能。作为B.cereus的选择培养基，MYP培养基广泛应用于B.cereus的计数和鉴定。因此，它可以作为所建立比率荧光免疫传感器的对比验证方法，MYP培养基的细菌培养法初步证明市售牛奶为阴性。添加回收试验表明，所建立方法在1×103、2×104和5×105 CFU/mL三种浓度下的B.cereus的回收率分别为98.8%、95.5%和93.8%，变异系数分别为5.1%、4.2%和6.5%。此外，如图5B所示，所建立的比率荧光免疫传感器对B.cereus的计数结果与MYP方法保持了高度一致性，范围为1.8×102至3.3×106 CFU/mL，表明所提出的方法在检测真实食品样品中的B.cereus方面具有巨大潜力。此外，开发的比率荧光免疫传感器可以通过引入响应抗体来检测其他细菌或生物标志物。

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图6: A : 免疫传感器对不细菌的荧光响应；B : 基于比率荧光免疫传感器和MYP方法对B.cereus的计数结果

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本研究合成了具有拟氧化酶活性的MnO2-Au纳米花，并将其与B.cereus pAb偶联作为免疫探针。由于MnO2-Au氧化OPD的产物DAP可以通过FRET过程猝灭bCD的荧光，因此开发了基于一种基于新型比率免疫传感器用于检测B.cereus。在最佳条件下，该免疫传感器对于B.cereus的检测限为1.7×102 CFU/mL，线性范围为1.7×102-3.3×106 CFU/mL。鉴于这种免疫传感器的选择性、灵敏度和方便性，它可能在食品安全中检测B.cereus方面具有很大的前景。

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Meng, J., Shen, H., Luo,
L., Wang, J., Xu, Z., Liu, Y., Dual-wavelength ratiometric immunosensor for Bacillus
cereus: Oxidase-like MnO2-Au trigged “OFF-ON” detection strategy.Sensors and Actuators B: Chemical, 2022, 365: 131925.

指导老师：王战辉

抗体故事分享基于抗体的分析方法研究进展

值此新春佳节来临之际，王战辉教授课题组全体师生祝大家新年快乐！





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