编者按

对于醉心临床的医生们而言，如果细数“医学院毕业以来用却很重要的知识”，想必基础实验技术会名列前茅。然而，随着行业内科研压力的与日俱增、以及对专业领域的探索逐步加深，似乎基础实验已经成为无法回避的“卡脖子”技术。作为临床医生，自然是没有时间完成每一步实验，但对技术实验的了解能够方便你与同行、技术公司、及学生们进行更深入的科研交流，在设计实验、申请课题时也能够有的放矢。唯脊柱小编们特别设置科研技术速递专栏，从临床视角分析各实验技术的应用场景。

第一篇我们就先浅谈下基础实验中最常用到的蛋白检测技术——Western blot。

Western blot技术（简称WB）是一种广泛用于检测蛋白质含量的方法，也被称为“免疫印迹”或“蛋白质印迹”。可以检测单个或多个特定蛋白质在混合物中的存在以及相对丰度。

Western blot技术的基本原理是利用抗体的特异性结合，将蛋白质从复杂的混合物中分离出来。

首先，需要通过电泳将蛋白质样品进行分离，这种方法可以根据它们的大小和电荷将蛋白质分离成单个带状条纹。其次，将这些分离的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶或聚丙烯酰胺膜上，这被称为“转膜”。转膜后，可以用特定的抗体（一抗及二抗）与膜上的蛋白质结合，一抗用于形成特异性结合，二抗是能够与一抗进行特异性结合并且携带显色基团的抗体，通过两次抗体结合以及显影后便能够特异性标记目标抗体。

至此，你就成功“跑”出了一个条带。

Western blot的结果判读上，一般通过肉眼比较条带的粗细即能比较出蛋白含量的高低，撰写文章时也仅需要展示如上的条带图即可，换言之，属于定性或半定量检测方法。但其实也存在定量Western blot技术，对上样、分析要求，详见知乎：https://zhuanlan.zhihu.com/p/109413147，在此便不展开介绍。

结果的构成除目标蛋白（上图中的Phospho ERK和ERK）外，还需要特别注意内参（上图中的B-Actin）的选择。内参的目的是提供参照，并以此为标准比较目标蛋白的相对含量，因此，一个优秀的内参至少应该满足以下几个要求：

1） 含量丰富：所检测样本组织中的含量足够有效检出。

2） 表达稳定：指各个组织细胞中表达相对恒定，因此不会因外部条件变化（比如所施加药物）而发生变化，理想情况下只与上样量有关。

3） 大小适宜：由于Western blot的原理便是通过蛋白大小进行区分，因此内参需要与目标蛋白具有显著的区分度，否则显色会互相影响，并且内参蛋白需要落在检测范围内，以保证判读准确。

常用内参包括β-actin（42KDa）、β-tubulin（50KDa）、以及GAPDH（37KDa）。具体选择时需要针对目标蛋白进行特殊选择。

以上基础知识了解后，对于我们而言，最重要的还是应用场景。Western blot作为一项经久不衰的基石性实验技术，常常被用作蛋白检测的“金标准”，例如：

1） 检测特定组织中特定蛋白的存在及相对含量：如检测不同时间点、不同损伤程度的大鼠脊髓中，转铁蛋白、组织蛋白酶D、TPI-1、PEA-15的蛋白含量变化，使用碳酸酐酶II作为内参。

2） 验证敲低或过表达实验中目标蛋白是否被成功调控：如利用siRNA技术（后续讲解）敲低嗅鞘神经胶质细胞中LEPRE1、SCARB2、和SERPINI1表达水平后，用Western blot验证蛋白水平的改变才能证明敲低实验的成功，并进一步完成其在脊髓损伤轴突再生中的功能研究。

3） 同一细胞通路的相互调控：使用shRNA转染技术敲低星形胶质瘤细胞中的SMN蛋白，并由此利用Western blot技术观察其对Notch通路的影响。

需要补充的是，虽然Western blot在蛋白检测上具有高度特异性和灵敏度，但它只能作为蛋白质检测的初步手段，因为它无法很好揭示蛋白的结构、修饰等信息，也无法体现蛋白在组织和细胞中的分布和定位，这些信息都各有其他手段去展示，敬请关注后续报道。

最后，敲黑板的重点！尽管Western blot技术非常成熟，结果也广受学界认可。但它的一个最大的缺点就是：耗时！往往跑一次结果可能就需要2天的时间，更不必说对于初学者而言它低到离谱的出图率！兢兢业业做了2天，等待你的或许是一幅“印象派泼墨山水画”。

在Western blot这项技术上你会充分体会到：“会做”和“做得好”之间的鸿沟。也因此，对于已经年过数旬、发剩无几的我们，从头做实验更是不现实的事情，因此，为了打破技术瓶颈，活用此技术，最快捷、直接的做法便是：

招一个会做Western blot的学生！