​​每10秒就有1人死于高血压并发症

 

Ang Ⅱ 诱导高血压造模，失败率超50%？

术后存活率骤降？

血压波动失控？

 

问题可能藏在您忽略的 “释放精度”与“手术创伤” 里

 

本篇直击Ang Ⅱ诱导C57BL/6小鼠高血压造模全流程：

 

✅ 从 0.25μL/h 缓释泵精准植入

✅ 到术后72h黄金护理法则

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实验背景

 

血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）是一种强效血管收缩剂，是RAAS的主要效应物，是由血管紧张素Ⅰ在血管紧张素转换酶的作用下水解产生的多肽物质。

 

长期暴露在高浓度的 Ang Ⅱ，可引起多种病理损伤，如心肌和血管重构、氧化应激、炎性反应、血管内皮功能障碍、肾小球损伤等[1,2]。

 

因此，科研中常用Ang Ⅱ进行诱发性高血压造模，这也是最广泛使用的啮齿动物高血压临床前模型之一[3,4]。

 

 

研究证实，大鼠长期皮下输注500 ng/（kg*min） Ang Ⅱ，24 h 血压开始升高，2 周血管重构，2~4 周心肌肥厚，易患鼠第 4 周可出现肾损伤[3]。

 

此外，C67BL/6J 小鼠 (10–12周龄, 体重20–22g)，灌注 MCE Ang II，1.44 mg/kg/day，连续28天，灌注 Ang II的小鼠血压也会明显升高[5]。

图 1. Ang II 诱导小鼠高血压收缩压 (Systolic blood pressure, SBP) 变化[5]

 

本文介绍了一种使用RWD植入式缓释泵建立C57BL/6小鼠高血压模型的方法，以期对您的实验有所助益。

 

实验准备

 

实验动物：SPF级雄性C57BL/6小鼠，8-10周龄，体重25~30g

 

实验试剂：Ang II、生理盐水、异氟烷、碘伏、医用消毒酒精、脱毛膏
 

 

实验设备及耗材：

 

✦ 设备：麻醉机、体温维持仪、手术操作台、灭菌器、冷光源、无创血压计

 

✦耗材：2004W植入式缓释泵、手术器械（精细剪、有齿镊、止血钳、伤口夹及缝合器）、剃毛器、0.22μm滤膜，培养皿，ep管，一次性注射器。

 

植入式缓释泵

 

缓释泵型号选购表：

可根据既往实验自行选择合适的规格，本文以2004W为例

1003D 表示容量100μL有效工作周期三天

 

实验流程（以2004W为例）

 

1

适应性训练及血压基线测定

在缓释泵植入之前一周handle小鼠，使用计算机化尾套系统提前训练小鼠适应尾套束缚，减少应激。测定收缩压（SBP）确定血压基线。

 

2

药物配制

本实验采用Ang Ⅱ诱导高血压，剂量为750 ng/（kg•min）（可根据既往实验自行选择更合适的浓度）。

 

考虑到Ang II的药物特性，使用0.01N乙酸-生理盐水作为溶剂以维持 Ang II 的溶解度和稳定性。（也可直接用生理盐水作为对照组与溶剂）

 

a. 0.01 N乙酸-生理盐水（溶剂）配制

e.g.取冰醋酸（17.5 M）0.57 mL，加入1 L生理盐水（终浓度0.01N，pH≈5.0）；

 

b. Ang II 浓度计算（以 Ang II 剂量750ng/（kg•min）为例）

 

✦ 体重取同一批实验小鼠的体重最大值；按照药物缓释泵每批次包装标贴上的”实际泵送速率”和“容积”计算；

 

✦ 每小时所需 Ang II量=实验小鼠的最大体重× 60 min × 750ng/（kg•min）；

 

✦ 所需浓度=每小时所需 Ang II量/药物缓释泵速率；

 

✦ 总Ang II 量=所需浓度×药物缓释泵计算容积× n（小鼠数量）；

 

✦ 溶解所需生理盐水的量=药物缓释泵计算容积× n（小鼠数量）。

 

3

缓释泵给药

 

a. 释泵称重：在灌充之前，称量空泵（带流量调节计）的重量，同时记录此时的重量数据；

 

b. 灌充药液：将灌充针竖直插入缓释泵，缓慢注入药液并向上抽出针头可见药液从出口溢出；

 

 

c. 再次称量缓释泵：再次称量缓释泵重量，对比两次数据，前后两次灌充的差值为灌充药液的净重；

 

注意：灌充量应达到产品标贴上标注的平均灌充量的90%以上。若灌充量小于缓释泵容量，则缓释泵内可能混入了空气，应抽空缓释泵并重新灌充。

 

d. 缓释泵体外孵育：如果希望缓释泵立即启动，或者使用的是粘稠液体，可将泵放入37℃无菌生理盐水中敷育60-68个小时（2004W）；

 

注意：敷育时间应视缓释泵具体型号而定（该例为2004W型号）

 

 

e. 皮下给药埋植：待动物麻醉后，两侧肩胛骨处备皮消毒，在肩胛骨之间的皮肤做一个横向切口，用止血钳分离皮下结缔组织，形成一处空隙，缓释泵出液口装上硅胶帽并将缓释泵纵向埋置进空隙中；

 

注意：出液口远离皮肤切口

 

 

4

使用伤口夹缝合皮肤

等待小鼠苏醒后转移至饲养笼。

 

 

5

无创尾套血压测量

将缓释泵皮下植入后，每周监测3次血压，每次重复测试10-15次，取平均值进行记录。两个周期之间间隔5 秒。

 

注意：在测量血压之前，将小鼠置于加热灯下20min，实验在黑暗、安静的环境中进行。对于真实的血压测量，建议在正常睡眠后的清晨测量。

 

血压测量波形示意图

SBP结果示例（AngⅡ组 n=8 ; Saline组 n=4）

 

6

小鼠血液收集及EIA检测（参考） ：

缓释泵埋植0、3、7、14d后，从小鼠左侧颈总动脉取血，离心（离心机半径11cm，3000r/min）15min，收集血清。血清中 Ang II水平通过Ang II EIA试剂盒检测。

 

7

若要确认缓释泵实际给药量（参考）：

输注28天后，取出泵体。吸取泵内药液剩余量，计算小鼠输注残留量与装量比例。

 

术后恢复

 

1

碘伏清洁伤口，给药期间可通过给予青霉素预防感染；

 

2

定期按摩出液口以防蛋白组织等生物碎片堵塞，影响给药效果。

 

检测方法及预期实验结果

 

 

参考文献

[1]A S A .The renin-angiotensin aldosterone system: pathophysiological role and pharmacologic inhibition.[J].Journal of managed care pharmacy : JMCP,2007,13(8 Suppl B):9-20.

[2]K M A ,E C A ,Bertram P .The renin-angiotensin-aldosterone system and its suppression.[J].Journal of veterinary internal medicine,2019,33(2):363-382.

[3]A B K ,L N H ,H S P .Intrarenal ghrelin receptor inhibition ameliorates angiotensin II-dependent hypertension in rats.[J].American journal of physiology. Renal physiology,2018,315(4):F1058-F1066.

[4]李公豪,徐良成,赵艳丽,等.血管紧张素Ⅱ在心血管疾病动物模型构建中的应用进展[J].国际心血管病杂志,2023,50(02):99-103.

[5] Yang J, et al. The Long non-coding RNA MALAT1 functions as a competing endogenous RNA to regulate vascular remodeling by sponging miR-145-5p/HK2 in hypertension. Clin Exp Hypertens. 2023 Dec 31;45(1):2284658.

 

RWD缓释泵心血管相关造模文献 （Ang Ⅱ ）

[6]Wang D ,Yu X ,Gao K , et al.Sweroside alleviates pressure overload-induced heart failure through targeting CaMKⅡδ to inhibit ROS-mediated NF-κB/NLRP3 in cardiomyocytes.[J].Redox biology,2024,74103223-103223.

[7]Shan R ,Zhang Y ,Shi Y , et al.Activation of Cannabinoid Type 2 Receptor in Microglia Reduces Neuroinflammation through Inhibiting Aerobic Glycolysis to Relieve Hypertension[J].Biomolecules,2024,14(3):

[8]Kaihao W ,Min Z ,Youhong Z , et al.IRX2 activated by jumonji domain-containing protein 2A is crucial for cardiac hypertrophy and dysfunction in response to the hypertrophic stimuli.[J].International journal of cardiology,2022,371332-344.

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