通过肿瘤比例评分(TPS)和联合阳性评分(CPS)可量化肿瘤样本中PD-L1的表达，为免疫治疗在各种实体癌患者中的应用提供指导。TPS和CPS的量化的过程中，有时区分PD-L1阳性的肿瘤细胞和免疫细胞比较困难。多个研究表明通过免疫组化双染可有效区分PD-L1阳性的肿瘤细胞和其他细胞，提高PD-L1判读一致性和准确性。

肺癌

在非小细胞肺癌中由于PD-L1不仅表达于肿瘤细胞，还表达于免疫细胞、坏死细胞甚至正常细胞，给准确评估肿瘤比例评分（TPS）造成困难。

通过PD-L1/TTF-1和PD-L1/P40组化双重染色可剔除非肿瘤细胞的PD-L1/非特异性着色，提高判读者的判读一致性，有利于准确评估NSCLC 中PD-L1的真实表达状态，为筛选适用于免疫治疗的NSCLC 患者及预后评估提供重要参考。

图１腺癌PD-L1/TTF-1免疫组化双重染色显示：PD-L1呈细胞膜阳性，TTF-1表达定位于细胞核;　　

图２鳞状细胞癌PD-L1/P40免疫组化。双重染色显示：PD-L1呈细胞膜阳性及颗粒状着色，P40表达定位于细胞核;　　

图３腺癌，PD-L1阳性细胞包括肿瘤细胞（TTF-1阳性）和免疫细胞（TTF-1阴性），免疫组化PD-L1/TTF-1双重染色;　　

图４鳞状细胞癌，PD-L1/阳性细胞均为免疫细胞（P40 阴性），癌细胞（P40阳性）PD-L1阴性，免疫组化PD-L1／P40双重染色;　　

图５鳞状细胞癌：原发灶部分区域癌细胞PD-L1阴性，免疫组化PD-L1/P40双重染色;　　

图６鳞状细胞癌：同一病灶部分区域癌细胞PD-L1呈强阳性，免疫组化PD-L1/P40双重染色;

图片来源于文献

另有研究将PD-L1/TTF-1双免疫组化用于评估肺腺癌细胞病理学标本中PD-L1的表达情况。结果显示，此方法在评估细胞病理学标本时非常有帮助，特别是当肿瘤细胞很少且分散在非肿瘤细胞中时。数据表明，该方法增加了病理学家的视觉估计和医学技术计算之间的一致性，将病理学家对PD-L1表达的视觉估计误差从9.5%降低到4.8%。

细胞病理学标本。苏木精和伊红染色(左)，PD-L1单染色(中)和PD-L1/TTF-1双染色(右)。

在第一例(A)中，肿瘤细胞很少，分散在非肿瘤细胞中。虽然单染色可以看到PD-L1阳性细胞(B)，但由于难以估计肿瘤总体大小，因此难以直观估计PD-L1表达百分比，从而导致对PD-L1表达频率的低估(<1%)。双染色(C)突出肿瘤细胞，正确估计表达频率为(>1%)。

在第二个病例(D)中，肿瘤细胞簇很容易被识别。单次染色清楚地显示表达PD-L1的肿瘤细胞(E)。在这种情况下，双重染色实际上引起了分心，因为弱棕色的PD-L1膜染色与强红色的核TTF-1染色相比相对模糊，导致低估。

在第三例(G)中，与双染(I)相比，单染(H)中PD-L1的染色强度实际上更弱，导致后者中表达PD-L1的细胞百分比更高。此类病例少见(2/42,4.8%)，临床意义尚不清楚。

图片来源于文献[3]

胸腺肿瘤

胸腺属于人体中枢免疫器官，是T 细胞分化、发育和成熟的场所，胸腺瘤主要起源于胸腺上皮及淋巴细胞，PD-L1不仅在胸腺上皮源性肿瘤细胞中表达，在正常胸腺上皮细胞以及淋巴细胞中也有部分表达，这就给PD-L1 在肿瘤性上皮细胞中表达的免疫组化染色的结果判读带来了很大挑战。

p63 是p53 抑癌基因家族的成员，在胚胎外胚层的发育和上皮组织的发育、分化以及维持细胞形态等方面发挥着重要作用，p63 蛋白广泛表达于上皮组织细胞核。将p63 和PD-L1两种抗体结合起来，使用免疫组化双重染色法，使得胸腺上皮来源的肿瘤细胞胞核呈p63 免疫组化染色的红色，细胞膜呈现PD-L1 免疫组化染色的棕色，而部分淋巴细胞仅在细胞膜上有PD-L1 表达，细胞核无p63 表达。

借助p63 + PD-L1双重免疫组化染色，我们不仅能够判断PD-L1 在胸腺肿瘤性上皮中的表达，也能够在一定程度上反映出在胸腺中各种淋巴细胞PD-L1 的表达状态，为今后进一步分析胸腺组织中各种细胞成分PD-L1 表达状况，与胸腺肿瘤临床病理特点及免疫治疗的相关性，提供更多的数据支持。

图1 A.B1 型胸腺HE 染色; B.PD-L1 免疫组化染色，Multimer 法; C.PD-L1 + p63 免疫组化双重染色，Multimer 法

图2 A.B2 型胸腺瘤HE染色; B.PD-L1 免疫组化染色，Multimer 法; C.PD-L1 + p63 免疫组化双重染色，Multimer 法

图3 A.B3 型胸腺瘤HE 染色; B． PD-L1 免疫组化染色，Multimer 法; C.PD-L1 + p63 免疫组化双重染色，Multimer 法

图4 A.胸腺鳞状细胞癌HE 染色; B.PD-L1 免疫组化染色，Multimer法; C. PD-L1 + p63 免疫组化双重染色，Multimer 法

胃癌

在胃癌组织中，很难通过形态学区分表达PD-L1的低分化腺癌和巨噬细胞，借助PD-L1和Iba-1双IHC染色，可以明确区分两种细胞类型，并通过TPS准确评估PD-L1的表达。

GC病例PD-L1和Iba-1双免疫组化的代表性图像。

a H&E染色。×100(上面)，×400(下面)。

b 免疫组化检测PD-L1。×100(上面)，×400(下面)。

c PD-L1和Iba-1双免疫组化。×100(上面)，×400(下面)

参考文献：

1.Mercier A, Uguen A,et al. Reproducibility in PD-L1 Immunohistochemistry Quantification through the Tumor Proportion Score and the Combined Positive Score: Could Dual Immunostaining Help Pathologists? Cancers. 2023,15, 2768.

2.徐瑶,王满香,王明伟,等.免疫组化双重染色技术在非小细胞肺癌PD-L1检测中的应用. 临床与实验病理学杂志, 2022(003):038.

3.Lin Y Y, Lin L Y , Hang J F,et al. Programmed Death-Ligand 1 (PD-L1)/Thyroid Transcription Factor-1 Double Immunohistochemical Staining Facilitates Scoring of Tumor PD-L1 Expression in Cytopathology Specimens From Lung Adenocarcinoma Patients[J]. Cancer: A Journal of the American Cancer Society, 2021(2):129.

4.邢杰,赵继开,丁闻洁,等.免疫组化双重染色技术在胸腺肿瘤PD-L1检测中的应用. 临床与实验病理学杂志, 2020，36( 12)：1482-1483

5.Yamashita K , Iwatsuki M , Harada K ,et al.Prognostic impacts of the combined positive score and the tumor proportion score for programmed death ligand-1 expression by double immunohistochemical staining in patients with advanced gastric cancer[J].Gastric Cancer, 2020, 23(1):95-104.

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