导读

有研究表明石韦(PL；水龙骨科)可减轻大鼠模型中的肾结石。草酸钙体内沉积可导致肾结石，而肠道菌群于草酸代谢至关重要。因此，本研究分析PL对肾结石影响的分子机制及其与肠道微生物群的关系。在gutMEGA进行差异菌群分析后，本文基于TCMSP、DisGeNET和STRING数据库分析PL与肾结石的网络关系，并将不同剂量的PL粉和PL提取液给予肾结石模型大鼠。本研究采用代谢组学技术，对PL提取物中的活性成分和大鼠粪便中的微生物代谢物进行鉴定。结果发现PL基于槲皮素和山奈酚，介导toll样受体信号通路并调节白细胞介素6、肿瘤坏死因子、丝裂原活化蛋白激酶8和分泌型磷蛋白1的表达水平，对肾结石发挥作用。PL可显著降低肾结石模型大鼠尿中草酸、尿钙和骨桥蛋白(OPN)水平。PL提取物处理后，产甲酸草酸杆菌、拟杆菌属、双歧杆菌和粪杆菌的含量明显降低。本研究表明PL粉及其活性提取物通过调节草酸代谢降低尿液中的草酸水平，从而改善肾组织损伤，预防肾结石的形成。因此利用PL及其提取物可作为一种潜在替代来源，从而直接或间接地抑制肾结石疾病的进展。

论文ID

原名：Molecular mechanism of Pyrrosialingua in the treatment of nephrolithiasis: network pharmacology analysis and in vivo experimental verification

译名：石韦治疗肾结石的分子机制：网络药理学分析及体内实验验证

期刊：Phytomedicine

IF：5.340

发表时间：2022.01

通讯作者：胡翔

通讯作者单位：杭州医学院附属永康市第一人民医院

实验设计

实验结果

1. PL粉对大鼠肾结石形成有抑制作用

为了探索PL粉是否能有效预防大鼠肾结石的形成，我们首先建立大鼠肾结石模型，并用低、中、高剂量PL粉治疗模型大鼠。如补充表2所示，与空白对照(NC)组相比，模型(MC)组大鼠尿草酸水平升高了3倍，尿钙水平降低了5倍。相对于MC组，高剂量PL（HP）组血钙、尿草酸水平降低，尿钙水平升高，接近PC组。中剂量PL (MP)组和低剂量PL (LP)组仅尿钙和尿草酸下降。

此外，偏光显微镜观察结果显示，相对于NC组，MC组大鼠尿液中有大量长柱状和菱形二水草酸钙晶体，甚至形成晶体簇。与MC组相比，PL组大鼠尿液中草酸钙含量呈下降趋势，且呈剂量依赖性。HP大鼠尿液中草酸钙含量与PC大鼠尿液中草酸钙含量相似(图1A)。

图1 PL粉可减轻大鼠肾结石形成，减轻肾组织损伤

A，在偏光显微镜下观察各组大鼠尿液结晶图像及定量分析。B，不同组大鼠肾脏结晶沉淀的Von Kossa染色分析及肾脏组织病理改变的HE染色分析。C-D，采用ELISA法和免疫组化法检测各组大鼠肾脏组织和尿液中OPN的表达。* p < 0.05，与NC组比较；# p < 0.05，与MC组相比。n = 10。

与NC组比较，MC组大鼠肾组织中NO、MDA水平明显升高，SOD活性明显降低。与MC组相比，LP组大鼠肾组织中NO水平降低，SOD活性升高。相较于MC组，MP组和HP组大鼠肾组织中NO、MDA水平降低，SOD活性升高。此外，HP组的上述指标与PC组的变化几乎相同。

Von Kossa染色和HE染色结果显示，NC组大鼠肾组织中几乎没有结晶或病理损伤。相反，MC组大鼠肾脏组织切片各部位均出现晶体，尤其是皮质与髓质交界处，肾小管增大，伴有大量炎症细胞浸润，病理评分增加。与MC组相比，PL组大鼠肾脏组织中晶体沉积和病理评分均呈剂量依赖性降低。所有PL组中，HP组晶体沉积和病理评分最低，与PC组相似(图1B)。

我们采用ELISA法和免疫组化染色法检测尿、肾组织中OPN水平。NC组大鼠肾组织中OPN的表达仅局限于髓袢和上皮细胞表面。与NC组相比，MC组大鼠肾组织中OPN表达增加，分布在近、远曲小管和集合管中，同时尿液中OPN表达也增加。与MC组相比，PL组大鼠肾脏组织和尿液中OPN表达降低，呈剂量依赖性，其中HP组变化最明显，接近PC组(图1C和1D)。综上所述，PL粉可有效预防大鼠肾结石形成，减轻肾组织损伤。

图2 肾结石大鼠肠道菌群组成、相互作用及差异分析

A，用16S rDNA测序技术分析NC(红色)和MC(绿色)组代谢菌门和类水平的相对丰度。B，NC组(红色)和MC组(绿色)的未加权和加权bray距离矩阵的Beta多样性分析。C，NC组(红色)和MC组(绿色)大鼠肠道微生物相互作用共现和共排斥网络图。n = 8。

2. PL粉通过调节肠道中草酸相关代谢菌的丰度来预防大鼠肾结石的形成

我们从gutMEGA数据库中检索多种肾结石和正常样品的差异肠道菌群。结果发现，肾结石样本肠道菌群中拟普雷沃菌、假单胞菌属、巨单胞菌属、埃希菌属、屎豆属菌和肠球菌属的丰度显著高于正常样本。为了研究PL粉的作用是否与调节肠道菌群代谢有关，我们采用16S rDNA测序法分析了NC组和MC组大鼠粪便中的微生物多样性。如图2所示，与NC组相比，MC组中厚壁菌门(p = 0.05)，变形菌门(p = 0.0007)，和TM7 (p = 0.044)丰度增加，而拟杆菌(p = 0.007)和蓝藻门(p = 0.004)丰度显著降低，这与之前的结果相一致。

根据菌群分类分析，我们发现MC组中杆菌(p = 0.0005)，γ-变形菌(p <0.0001)和TM7-3 (p = 0.044)富集，而拟杆菌纲(p = 0.007)、β-变形菌纲(p = 0.0004)、Chloroplast (p =0.013)和红蝽菌纲(p<0.0001)相对于NC组下降(图2B)。利用bray距离矩阵进行Beta多样性分析，我们发现NC组和MC组的微生物群落组成存在差异(图2B)。以上结果表明，在PCoA分析中，厚壁菌对MC样品的分离有显著影响。

为了检验MC组肠道微生物相互作用的变化是否由微生物失调引起，我们进行了共现和共排斥网络分析。上述网络共检测到57个交互节点，分别代表MC组和NC组29个(45个交互)和28个(44个交互)显著交互属。接下来，我们发现与NC组相比，MC组具有共现交互作用的节点减少：NC组23例，MC组18例；共排斥相互作用的节点增多：NC组21例，MC组27例(图2C)。以上结果说明，相对于NC组，MC组大鼠肠道内某些细菌操作分类单元数量减少，但其作用成分丰富。

我们利用Spearman相关系数分析NC组、MC组和HP组大鼠肠道差异菌属与尿草酸浓度的正、负相关关系。线性回归分析表明，4个细菌属与草酸含量呈负相关，另外4个细菌属与草酸含量呈正相关。其中与尿液草酸含量负相关最大的是普雷沃菌属、罗氏菌属、拟杆菌属和粪杆菌属，而与厚壁菌门中的韦永氏球菌属、梭状芽胞杆菌和魏斯氏菌属正相关最大(图3)。

图3 采用Spearman相关分析法分析不同微生物属与大鼠尿液中草酸浓度的相关性

黑线表示线性回归的最佳拟合结果，置信区间为95%。图形的位置对应于草酸的浓度。

结合之前的实验结果，PL粉显著降低了大鼠尿液中草酸的含量，因此我们推测，PL粉可能通过改善肠道菌群分布来起到降低尿液中草酸含量的作用。

3. 肾结石大鼠肠道菌群功能及代谢信号通路分析

基于MC组大鼠肠道微生物营养不良的情况，我们探讨这种情况是否与参与草酸代谢的特定微生物的富集有关。

基于KEGG通路数据库，我们采用PICRUSt工具评价肠道微生物对草酸及其相关营养物质的利用能力。结果表明，与NC组相比，MC组中参与能量代谢、聚糖合成、辅因子和维生素代谢的蛋白家族下调，而参与脂质代谢、碳水化合物代谢、以及外源性降解和代谢的蛋白家族上调(图4A)。根据代谢物的KEGG富集分析，我们筛选出与差异代谢物相关的信号通路，包括甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢、氨酰tRNA的生物合成、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成以及鞘脂代谢(图4B)。

图4 肾结石大鼠肠道菌群功能及代谢信号通路的KEGG富集分析

A，NC组(红色)与MC组(绿色)微生物代谢相关功能基因丰度差异，如环形进化图所示。B，涉及代谢产物的KEGG信号通路。

综上所述，肾结石大鼠肠道菌群功能和代谢信号通路发生改变，但PL对肠道草酸降解相关酶的作用机制有待进一步研究。

4. PL的活性提取物通过调节肠道中草酸代谢相关细菌和功能基因来预防肾结石的形成

我们开始研究PL粉中某些活性物质预防肾结石的作用机制。参考之前的报道，我们使用石油醚和二氯甲烷从PL中提取活性成分，并使用GC-MS对PL提取物的活性成分进行鉴定。结果表明，PL提取物的有效成分主要包括有机酸、脂类、葡萄糖及其衍生物，如咖啡因、酒石酸和柠檬酸。据报道，这些活性成分具有去除肾结石的作用，但具体作用机制需要进一步探索。

我们随后分别设置NC、MC、PC、HP、EP组。实验结束前24 h，我们取各组大鼠尿液，测定草酸含量。与NC组相比，MC组尿量明显减少，草酸浓度明显升高。同时，与MC组相比，PC组、HP组和EP组尿量恢复，尿中草酸浓度降低，接近NC组。此外，与HP组相比，PC组和EP组干预效果有所改善，更能有效恢复大鼠尿量，降低尿草酸浓度，但PC组和EP组间无差异(图5A)。这些数据表明，PL石油醚提取物和二氯甲烷提取物的主要活性成分能有效恢复大鼠的尿量，降低尿中草酸浓度。

图5 不同组大鼠尿液中草酸浓度及粪便中草酸代谢相关菌丰度的变化

A，实验结束前24小时大鼠尿量和草酸浓度的变化。B-M，RT-qPCR分析大鼠粪便中草酸代谢相关细菌的相对丰度变化。*p < 0.05，与NC组比较。#p < 0.05，与MC组相比。与HP组相比，&p < 0.05。n = 10。

RT-qPCR结果显示，与NC组相比，MC组中乳酸菌(p≤ 0.0001)和frc基因(p≤0.0001)富集，而拟杆菌(p≤0.0001)、双歧杆菌(p = 0.0009)、Fecalibacterium (p= 0.0028)和产甲酸草酸杆菌(p≤0.0001)减少(图5B-J)。RT-qPCR检测结果显示，NC组已知OMBS的产甲酸草酸杆菌为3.2×105~ 8.9×106个，显著高于NC组(图5J)。此外，frc基因被认为是草酸代谢菌的分子标记，其较高的拷贝数可被视为OMBS菌在人肠道中富集的信号。NC大鼠的frc基因数量为7.8×105~ 7.7×107拷贝/g，显著低于MC大鼠的7.4×107~ 1.7×1011拷贝/g(图5K)。此外，我们得到了OMBS细菌frc基因拷贝数的总丰度与16S rRNA基因拷贝数的比值，发现MC组的比值(0.03 - 20.1%)远远高于NC组(0.00018 - 0.01%)(图5L)。以上结果表明，MC组大鼠粪便中活性OMBS细菌高度富集。

产甲酸草酸杆菌是肠内草酸平衡的重要贡献者。接下来，根据Oxalobacter拷贝数与frc基因拷贝数的比值，我们评估了产甲酸草酸杆菌对OMBS总群体的贡献。结果表明，NC大鼠中产甲酸草酸杆菌的比例较高（1.2-88.13%），而MC大鼠极低（0.004-0.22%）(图5M)。综上所述，这些结果为PL提取物的有效成分，包括咖啡因、酒石酸和柠檬酸，调节草酸代谢平衡，预防肾结石提供了证据。

5. PL治疗肾结石的药理学分析

如图6A所示，我们通过TCMSP数据库筛选到147个PL相关靶基因，从DisGeNET数据库中检索到242个肾病相关基因。我们对所获得的PL和肾结石靶基因进行维恩图分析，鉴定出17个可能的基因，并利用Cytoscape绘制网络关系图(图6B)。

图6 PL治疗肾结石的网络药理学分析

A，PL与肾结石相关靶点的网络关系。B，PL治疗肾结石的潜在靶点之间的网络关系。C，条件筛选后PL与肾结石的靶关系。D，图C中靶点的KEGG富集分析。E，PL-化合物-靶点-信号通路网络图(菱形代表PL；V形代表化合物；方块代表TLR信号通路；圆圈表示靶点)。

经过条件筛选，我们获得了6个潜在的PL治疗肾结石的靶点(图6C)。6个靶点的KEGG富集分析，发现21个信号通路有显著影响，其中4个靶点[白细胞介素-6 (IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)、丝裂原活化蛋白激酶8_ (MAPK8)、分泌磷酸化蛋白1 (SPP1)]富集于toll样受体(TLR)信号通路(图6D)。

图6E为使用Cytoscape绘制的PL-化合物-靶点-信号通路网络图。结合上述PL石油醚提取物和二氯甲烷提取物代谢物图谱鉴定结果，我们可以得出结论，PL可能通过槲皮素和山奈酚作用于TLR信号通路，调节IL6、TNF、MAPK8和SPP1进一步治疗肾结石。

图7 PL提取物影响肾结石的机制示意图

PL提取物的有效成分通过改善肠道菌群分布，降低尿液中草酸和OPN水平，从而抑制大鼠肾结石的形成。

肾结石是一种常见的疾病，影响着约9.1%的全球人口，与不同的并发症有关。新的证据表明草药对肾脏疾病有治疗作用。有报道称PL对肾结石治疗有影响，这意味着PL含有可以阻止肾结石进展的活性物质。此外，肠道菌群通过调节草酸代谢在肾结石中发挥作用。在本研究中，我们证明了PL提取物通过介导肠道微生物群来防止肾结石的发生。

多项研究强调了从药用植物中提取的几种草药或化合物对肾结石的疗效。例如，蔺花香茅提取物已被证明可以限制大鼠体内CaOx的沉积。同样，据报道，来自印度的传统草药黄果茄可以防止CaOx晶体的形成。此外，绿茶提取物已被证明在体内和体外都能抑制肾结石。作为抗肾结石的中药，已有报道PL具有抗炎、利尿、保肾的特点。在本研究中，我们发现PL粉显著降低了血钙和尿草酸水平，并降低了肾组织的氧化应激损伤。

然而，使用草药产品可能会有潜在的风险。例如，在植物上存在曲霉和青霉菌等真菌，可产生可导致肾毒性的毒素。草药使用后还伴有尿潴留、尿路癌、肾小管坏死等多种肾综合征。因此，药用植物活性成分鉴定是中药现代化的必然趋势。本研究提示，PL的活性物质，如咖啡因、酒石酸、柠檬酸，可能为肾结石的治疗提供可能。

健康人肠道内的微生物群是一个复杂的群落，有1000多个不同的菌种。在正常状态下，微生物与其宿主之间存在共生关系，这对人体稳态调节至关重要。微生物群的变化与各种疾病的发展密切相关，包括肾脏疾病、心血管疾病和癌症。越来越多的证据表明，肠道菌群功能障碍与不同肾脏疾病的发展日益相关。日常饮食中过量摄入草酸盐是肾结石发展的不利危险因素之一，但人体不能产生用于草酸盐吸收和转化的酶。产甲酸草酸杆菌是肠道的正常菌群，在人体肠道内代谢草酸。在本研究中，我们观察到肾结石组小鼠中产甲酸草酸杆菌的数量明显低于对照组。此外，根据大鼠粪便的代谢谱，从PL中提取的活性物质通过调节草酸代谢平衡来预防肾结石。但PL提取物中特定成分对产甲酸草酸杆菌的影响有待进一步研究。

有研究表明，肾组织中草酸钙晶体的粘附和聚集与活性氧(ROS)的过量产生有关。ROS是生理和代谢过程中不可避免的副产物，肾脏作为药物和毒素的主要清除者，极易受到ROS的损害。多项研究表明，抗氧化治疗可减轻氧化应激引起的肾损伤，防止草酸钙沉积。此外，抗氧化酶，如SOD和MDA，是ROS分解代谢的主要贡献者。在本研究中，我们证实了PL粉降低了大鼠氧化应激水平，提示PL粉通过降低氧化水平来预防肾结石。

结论

综上所述，通过网络药理分析，我们发现PL对肾结石的作用主要是通过槲皮素和山奈酚，介导TLR信号通路实现的(图7)。此外，PL粉可预防大鼠肾结石模型的发生，降低机体氧化应激。高剂量PL粉可显著降低大鼠尿中草酸含量。根据大鼠粪便的代谢谱分析，PL提取物的活性成分如咖啡因、酒石酸和柠檬酸有助于调节草酸代谢平衡，预防肾结石。因此，PL及其提取物有望成为治疗和预防肾结石的有效药物。尽管如此，本研究仅基于网络药理学分析和体内实验来探讨PL在肾结石治疗中的分子机制。未来需要了解细胞和分子机制解释PL及其化合物的活性。同时，我们应基于网络毒理学分析对PL化合物的安全性进行评价，为了解其毒理机制提供有价值的信息。

原文链接：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35104754/

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