微生物病原体检测涉及DNA提取、扩增和病原体检测等步骤。例如，常用方法之一硅基萃取被认需要重复使用有机溶剂和各种塑料耗材，以及耗时的反复离心。这篇文章开发了一种“一体管”平台，DNA提取、扩增和检测基因分析都可以在一个管中进行。其内表面用iCVD沉积了含有叔胺的聚（2-二甲氨基甲基苯乙烯）（pDMAMS）。带正电的pDMAMS涂层PCR管表面可以通过强静电作用有效捕获PCR管表面的DNA。在一体管中，细菌与裂解缓冲液孵育10min，破裂细菌细胞释放的DNA通过静电作用结合在一体管表面，然后用去离子水温和移液冲洗试管三次，去除游离细胞碎片，进行实时PCR。实现在单个试管中检测病原体。

图1 一体式DNA提取管的原理

本文所用到的ICVD化学气相沉积，是将聚合所需的引发剂和功能单体气化引入腔体，在较低加热温度下诱导引发剂裂解，使单体聚合成高分子薄膜沉积于基底上。与传统液相制备过程相比，iCVD法制得薄膜致密均匀、厚度可控，且适用于任何材质的基底；与PECVD等高能气相法相比，其条件温和、过程可控，且可完美保留所需官能团。

然而，非平坦的PCR管表面在保持管的几何形状可靠和可伸缩的同时，要进行共形改性是相当具有挑战性的。为了验证通ICVD对PCR管的拱形表面改性，用连续切片进行荧光监测。首先，我们将Cy3标记的引物溶液注射到一体管中，该管的内表面由pDMAMS通过ICVD进行功能化。经过三次漂洗和连续切片后，观察到一体管横截面的荧光信号。内圈从1到5的整个片段都显示出红黄色的荧光信号，而用Cy3标记的引物处理的裸PCR管没有信号。这一结果表明pDMAMS可以大致均匀地覆盖在PCR管的表面（图2）。

图2 对PCR管连续切片进行荧光监测

采用与PCR管相同的材料聚丙烯（PP）薄膜进行材料表征（图3）。用傅里叶变换红外光谱（FTIR）研究了聚丙烯（PP）膜，查看单体通过化学气相沉积(ICVD)在聚丙烯膜上的情况。聚合体中C=C键的峰在905、1030、1450、1629和3085 cm处消失，说明单体中的乙烯基通过自由基加成反应被成功消耗。另一方面，2764 cm处的特征峰对应于pDMAMS中叔胺基团，表明pDMAMS中的胺基团保留。叔胺功能的质子化可以使DNA通过静电相互作用吸附到pDMAMS表面（图3a）。用X射线光电子能谱(XPS)监测了裸管、有成分沉积的、吸附DNA三者之间的元素组成。原始的PP表面仅在283.0 eV处出现C1峰，而镀膜后的PP表面在397.4 eV处出现N1s峰，该峰来源于DMAMS部分中的叔胺（图3b）。当DNA被捕获到pDMAMS表面时，又出现了530 eV处的O1s峰和131.5 eV处的P2P峰。高分辨率N1S谱的去卷积显示，在DNA捕获的pDMAMS表面有一个新的N+峰，位于398.9 eV。通过比较DNA捕获的pDMAMS的XPS高分辨率N1S谱中N和N、N+部分的比例，发现pDMAMS表面质子化的叔胺的比例为34.7%（图3c）。对NaCl水介质中的原始聚丙烯膜、pDMAMS聚合体沉积的聚丙烯膜和捕获DNA的膜进行Zeta电位分析，裸管的电位是负的，当气相沉积之后，电位变成了正的，捕获DNA之后，其电位又稍有偏移，这是由于DNA的部分偶联作用（图3d）。为了可视化pDMAMS膜吸附目标的能力，通过荧光显微镜检测了羧基荧光素（FAM）标记的DNA吸附情况，在488nm下激发下，原始PP膜表面和pDMAMS改性表面PP均未观察到明显的荧光信号，表明薄膜本身没有自发的荧光信号。两个样品FAM标记的溶液中孵育10min，复查荧光信号，而气相沉积的PP膜则显示出明显的绿色荧光，表明FAM标记的DNA是通过静电作用结合在pDMAMS表面的(图3e)。虽然说通过pDMAMS改良PCR管的DNA吸附能力，但是改造后的PCR管必须保留PCR管的原始特性，包括光学透明性和完全相容性，以便进行下游分析（图3f）。检查了原始和涂覆pDMAMS的PP表面的透过率。由于pDMAMS中的苯环，涂覆pDMAMS的PP薄膜在200-300 nm范围内的透过率明显降低。整个可见光区的透过率仍高于90%，特别是在488 nm荧光激发波长处，用于PCR分析的透过率仍高于90%。因此这个管还是比较直观的。

图3 使用与PCR管相同的聚丙烯材料进行表征

为确保PCR管表面的pDMAM修饰不会干扰PCR扩增程序，将原始试管和一体式试管中的PCR扩增曲线进行比较。扩增图表示两者的实时PCR性能没有明显差异，以上表明在PCR扩增和荧光观察方面，一体式PCR管与原始标准PCR管相当（图4a、b）。本研究以大肠杆菌O157:H7 DNA作为测试病原体，研究了“一体管”系统的捕获能力。以10倍的差值连续稀释的DNA溶液，轻轻搅拌1小时，回收未结合的DNA上清液。随后，通过实时PCR对未结合DNA的量进行定量，并由此估算一体管表面中捕获的DNA的量（图4c-e）。

图4 一体式管的相容性和吸附DNA的量

随着初始DNA量的增加，捕获量开始逐渐上升，捕获效率在30 ng/ul时，突然下降。由于PCR过程中的温度在55℃到95℃之间变化，捕获的DNA可以在实时PCR扩增过程中释放。事实上，在没有任何预处理的情况下，通过实时PCR只能扩增在一体管上捕获的DNA的45.5％。为了增加PCR可扩增DNA的比列，在实时PCR之前加热到25、55、95℃的预处理， 25、55℃的效果不明显，然后用95℃处理，可以达到释放量的90％。

大肠杆菌157:H7、肠炎链球菌、蜡样芽胞杆菌、将所有目标病原体细胞连续稀释并分别装入一体管中进行遗传分析(图5a)。随着病原菌负载量的降低，每种病原菌的扩增曲线均表现出规律性右移(图5b-e)，MID值位于动态检测范围曲线内(图5f-i)，说明其可以满足商业化检菌的目的。通过琼脂糖凝胶电泳进一步研究来自一体管的最终PCR产物。电泳结果也与实时PCR观察结果完全一致。

图5 检测细菌浓度

点评：

1. 本文使用ICVD表面功能化的PCR管，来直接扩增和检测表面捕获的DNA，该多合一试管能够进行直接的分子诊断，大大减少了劳动密集型病原体检测步骤，同时与当前建立的实时PCR仪器的高度兼容性，并说明了其现场适用性，可方便地扩展到包括食品安全检测、法医分析和临床诊断在内的各种遗传分析。

2. 该一体式PCR管的灵敏度能够满足商业化的检测需求，同时与市面上所售的试剂盒性能相当。

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Song, Y., et al., All-in-One DNA Extraction Tube forFacilitated Real-Time Detection of Infectious Pathogens. Advanced HealthcareMaterials, 2021. 10(14).