目前诊断骨髓增生异常综合征 (MDS) 的金标准是通过细胞形态学检测血细胞减少患者的外周血 (PB) 和骨髓 (BM) 中的红细胞、粒细胞、单核细胞和巨核细胞谱系的发育异常特征，并排除其它原因引起。发育不良不是 MDS特有的，可能非常不明显，尤其是在核型正常或没有其他可检测的遗传变异的情况下，MDS 的诊断通常很有挑战性。与 MDS 相关的细胞遗传学和基因组变异存在广泛的异质性（超过 100 种被充分描述的异常）（Haferlach et al.，2014；Papaemmanuil et al.，2013；Schanz et al.，2011；Schanz et al.，2012），但是与细胞增殖、成熟和功能异常相关的表型却存在较大的共性，可通过细胞形态学和免疫表型评估。

流式细胞术 (FCM) 可以通过 MDS 患者 BM 中抗原表达的细微变化来检测前体群体中的免疫表型异常以及红细胞、粒细胞和单核细胞群体的分化（Loken et al.，2008；Loken & Wells， 2008；Van De Loosdrecht et al.，2009）。目前的关键诊断标准包括了：一个或多个细胞谱系中 >10% 的细胞存在发育异常、存在 >15% 的环状铁粒幼细胞、PB 和 BM 中的原始细胞百分比、存在 MDS 和剪接因子 SF3B1 中存在突变并结合 >5% 的环状铁粒幼细胞（Arber et al.，2016；Malcovati et al.，2020；Valent et al.，2007）。细胞形态学、组织学和细胞遗传学结果根据按照 WHO 分类（Arber et al.，2016；Malcovati et al.，2013）描述的不同亚型对患者进行分类。最新的 WHO 分类（2016）删除了“难治性贫血”和“难治性血细胞减少症”这两个术语，取而代之的是统一用MDS，但改成用“单系”发育不良或“多系”发育不良表述，从而给出更准确和全面的描述（Arber et al.，2016）。

尽管 WHO 的标准看起来很简单，但 MDS 的诊断仍然具有挑战性，尤其是在没有原始细胞增多的低风险 MDS 亚型中，因为非肿瘤性疾病或其它恶性血液病都可能伴随可疑的发育异常。比如，红细胞生成障碍和多系发育不良可能发生在非肿瘤性疾病中，例如维生素 B12、叶酸、铁或铜缺乏症，某些重金属中毒和 HIV 感染，药物诱导的，或形态学涂片前用EDTA抗凝过长时间。

WHO 2016 强调了评估红细胞生成异常的难度，以及红系异常对髓系肿瘤缺乏诊断特异性。当怀疑 MDS 时，必须在临床背景下评估单系红细胞生成障碍及其对其他可能的非克隆诊断（Malcovati et al.，2013）。

WHO 2016 还指出，如果使用 FCM 来评估 BM 细胞，骨髓祖细胞的百分比是有用的，但不能代替常规细胞形态学涂片上的原始细胞分类计数。不过，CD34+ 细胞的异常免疫表型是可以提供异常增生的额外证据的。异常（红系和髓系）分化模式可能表明相应系列存在发育不良和异常，并与 MDS 或 MDS/MPN 高度相关，但是，务必记住，如果在缺乏决定性的形态学和/或细胞遗传学标准的情况下，FCM 不能直接给出MDS诊断，而是应该建议进行随访复查（Westers, Ireland, et al., 2012）。

标准诊断方法有时候无法找出血细胞减少症和发育不良的原因。不明原因的血细胞减少症和没有克隆遗传标记的患者现在被归类为意义不明的特发性血细胞减少症 (ICUS) (Steensma, 2019; Valent et al., 2017)。不明原因的血细胞减少但具有克隆性遗传异常的患者被归类为意义不明的克隆性血细胞减少症 (CCUS)。通过细胞形态学评估有明显异常增生，但在实验室检查中没有血细胞减少或其他异常的患者被称为意义不明的特发性异常增生 (IDUS)。对于 ICUS 或 CCUS 患者，FCM 可能会增加细胞形态学无法检测到的谱系发育不良的表型证据。尽管 FCM 的确切作用尚未确定，但 FCM 异常可能会揭示这些病例中可能的 MDS 前免疫表型。此外，在这些情况下不存在 FCM 异常可能有助于排除 MDS（Cremers et al.，2016；Kern et al.，2013）。

根据标准欧洲 LeukemiaNet 指南（Della Porta et al.，2012；Porwit et al.，2014；Van De Loosdrecht et al.，2013），FCM 被添加为用于诊断目的的推荐工具。

使用 FCM，可以评估造血细胞的表型和免疫学特征，能分析骨髓中的骨髓祖细胞、B系祖细胞、成熟粒细胞、单核细胞和红细胞亚群。2009，ELN iMDS Flow WG 发布了其首个样本采集、处理推荐方法指南（Westers、Ireland et al.，2012），还描述了用于研究粒细胞、单核细胞和红细胞亚群的抗体组合的最低共识方案，随后在 2014更新了建议（Porwit et al.，2014）。MDS 没有单一的特定 FCM 标记物，但多种免疫表型异常可表明存在潜在的克隆性异常。因此，必须了解与年龄匹配的正常成熟模式和谱系识别标记的表达水平，以便通过 FCM准确评估骨髓标本。多个 MDS-FCM 评分系统描述了对不同标记和不同评分策略的评估（Van De Loosdrecht & Westers，2013；Westers，Ireland et al.，2012）。

最常用的诊断策略是基于四个参数的简单 MDS流式评分系统（通常称为 Ogata 评分）（Della Porta et al.，2012；Ogata et al.，2006；Porwit et al.，2021），每个异常得分 1 分，得分≥2 分表示 MDS可能。

大多数 MDS-FCM 评分系统已经在 MDS 患者队列中开发和验证，比较了非克隆性血细胞减少症和正常对照的 MDS 患者组（Cremers et al.，2016）。使用这种方法，FCM不仅可区分不同的MDS亚型，还有可能发现细胞形态学易忽略的多系发育不良。

流式对于红系发育的评估，以往缺乏经过验证的标记组合。不过，ELN iMDS Flow WG 已经证明 CD45、CD36、CD71、CD105、CD117 和 CD235a 可用于评估红细胞谱系，得出红细胞评分（RED 评分），结合血红蛋白水平辅助临床诊断 MDS（Mathis et al.人，2013；Westers et al.人，2017）。综合FCM积分 (iFS)包含了 Ogata评分以及未成熟、成熟的粒细胞和单核细胞的额外发育不良特征、红细胞分析（Cremers et al.，2017），就诊断准确性而言，iFS 是目前 MDS 诊断的最佳评分系统（Oelschlaegel et al.人，2021）。巨核细胞的分析由于其大小、稀少和脆弱性，故流式无法很好去检测，巨核细胞系最好通过细胞形态学和组织学进行评估。在细胞形态学不符合 MDS 标准但 FCM 特征与 MDS 一致的情况下，大约 50% 的患者最终演变为明显的 MDS（Cremers et al.人，2016；Kern et al.人，2013；Kern et al.人，2015） ）。相比之下，没有 FCM MDS特征的患者，只有一小部分发生了 MDS（Kern et al.，2013）。最后，FCM 在确认肿瘤性肥大细胞的存在上具有重要作用，有助于完善某些误诊为MDS的诊断，如全身性肥大细胞增多症伴有相关的血液肿瘤，即 SM-MDS 或 SM-CMML（Valent et al.，2019 ）。

FCM 是骨髓祖细胞定量和免疫表型分析的重要补充工具，应与常规细胞形态学联系起来。多个研究小组已经表明，骨髓祖细胞的数值和免疫表型异常有助于区分骨髓增生异常和非肿瘤性血细胞减少症，FCM 与细胞形态学之间的总原始细胞计数和临界原始细胞阈值具有良好的相关性（Fontet al.，2018；Kernet al., 2010; Sandeset al., 2013)。

由于以下几个原因，骨髓祖细胞的 FCM 分析是诊断 MDS 的理想工具：

•由于MDS的本质是干细胞发生克隆性异常，故骨髓祖细胞几乎都会受到影响；•FCM 可以评估骨髓祖细胞比例和免疫表型异常；•与成熟细胞相比，骨髓祖细胞免疫表型受感染和/或炎症共存的影响可能更小，因此可能对 MDS 的诊断更具特异性（Behbehaniet al.，2020；Kernet al.， 2010）。

骨髓祖细胞的异常包括比例增加、早期B祖细胞比例降低、成熟标记的异常或异步抗原表达和跨系表达。骨髓祖细胞定量是 MDS 的关键诊断和预后标志物，在难以或无法进行形态学评估的情况下，FCM 可能变得必不可少。在常规临床实践中，结合细胞形态学和多参数 FCM 可以快速评估以排除或确认疑似 MDS 或急性髓系白血病 (AML) 的诊断，特别是如果涂片质量差和/或血液稀释。在血细胞减少患者中，如果祖细胞存在免疫表型异常，有发育异常，但没有原始细胞增加的证据，也是克隆性疾病的有力指标，这可能有助于选择随后合适的“下游”细胞遗传学和分子学研究，帮助临床做决定。

流式细胞术研究已成为疑似经典慢性粒单核细胞白血病 (CMML)、Pre-CMML 和特殊 CMML变异型患者的基本诊断工具（Itzykson et al.，2018；Valent et al.，2019）。因此，在所有疑似 CMML 或疑似Pre-CMML的情况下，建议对 PB 进行 FCM检测。

在流式上，单核细胞根据 CD14 和 CD16 的表达，进一步分为经典 (cMo) (CD14bright/CD16)、中间 (iMo) (CD14bright/CD16+) 和非经典 (ncMo) 单核细胞 (CD14dim/CD16+)。与健康供体和反应性单核细胞增多症患者相比，CMML 患者 PB 中 cMo 的百分比较高，ncMo 的百分比较低（Selimoglu-Buet et al.，2015；Selimoglu-Buet et al.，2017；Vazquez et al.，2018）。使用 >94% cMo 单核细胞为cut-off值，诊断CMML的灵敏度可达92%和特异度达94%。而且，如果CMML治疗有效，cMo、iMo 和 ncMo 的分布能恢复到接近正常的模式。

不过，需要注意的是，在疑似 CMML 和伴随感染和/或自身炎症的情况下，cMo 分数可能低于 94%（Selimoglu-Buet et al.，2015；Selimoglu-Buet et al.，2017），这时，*低于 1.7%的 SLAN+ ncMo *可能会显著提高 CMML 诊断的准确性（Hofer et al.，2019；Tarfi et al.，2020）。

在临床上，“不明原因的血细胞减少症”需鉴别诊断的范围很广，必须排除血细胞减少症的常见非克隆性原因，例如溶血、铁或维生素缺乏和免疫紊乱。除先天性血小板疾病外，恶性疾病的鉴别诊断还包括淋巴组织增生性疾病、浆细胞瘤、急性髓系和淋巴系白血病以及 MDS。见下图的诊断流程：

鉴别流程的起点通常是细胞形态学和 FCM。结合细胞形态学，FCM 是一种在未知血细胞减少症的急性情况下非常有用的筛查工具，特别是当涂片质量差且缺乏特定的细胞形态学、MDS 标准不满足或评估者之间存在不同意见的情况下。除了 MDS 诊断所需的方案外，还建议使用 FCM 筛查管来检测原始细胞、成熟 B 细胞、T、 NK 细胞和浆细胞的免疫表型异常，这些初步结果可以确定更适合的“下游”细胞遗传学、FISH 或分子学检查。偶尔患者同时存在MDS 和另一种克隆性血液系统恶性肿瘤的双重诊断，但在多数情况下，MDS一般是在先前的血液系统恶性肿瘤治疗之后出现的，并且伴或不伴原发疾病的残留病灶（Jonsdottir et al.，2021）。极少数情况下，MDS 可能与 NK 或 T-NK 细胞的克隆或非克隆增殖有关（Bareau et al.，2010；Saunthararajah et al.，2001）。

免疫失调（包括炎症和适应性免疫异常）在 MDS 发病机制中作用的证据越来越多（Kordasti et al.，2007；Kotsianidis et al.，2009；Winter et al.，2020）。事实上，CD4+ 和 CD8+ T 细胞、NK 细胞、单核细胞和树突状细胞的数量和功能状态与疾病的严重程度相关（Van Leeuwen-Kerkhoff et al.，2020；Van Leeuwen-Kerkhoff et al.，2021）。在疾病进展期间观察到循环髓源性抑制细胞 (MDSC) 和调节性 T 细胞 (Treg) 数量增加（Kittang et al.，2016）。此外，已经提出了低危 MDS 患者 Tregs（外周血）和 骨髓B祖细胞（骨髓）比例的独立预后价值（Kahn et al.，2015），后者已作为单个参数包含在 Ogata 积分中。到目前为止，关于 MDS 中免疫异常的分析还没有达成共识。嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的作用尚未确定，尽管嗜酸性粒细胞增多和/或嗜碱性粒细胞增多可能具有预后意义。未来，有必要进行多中心研究，以更好地了解 T 和 B 细胞亚群的预测价值，并设计更强大的诊断方案和“MDS 相关免疫评分系统”。

MDS 中的粒细胞和单核细胞发育不良，被 FCM 确定为免疫表型异常，与国际预后评分系统 (IPSS)、WHO 调整预后评分系统 (WPSS)、输血依赖性和进展到晚期 MDS/AML 的时间、造血干细胞移植后的结果等均存在相关性（Alhan et al.，2016 年；Alhan、Westers、Cremers et al.，2014；Alhan、Westers、van der Helm et al.，2014 ；van de Loosdrecht et al.，2008）。

即使 BM 原始细胞的百分比低于 5%，骨髓祖细胞的免疫表型异常也可能具有独立的预后影响。

IPSS 和 IPSS-R 代表了 MDS 中临床试验和治疗决策制定的基准（Della Porta et al.，2015；Greenberg et al.，2012；Van Spronsen et al.，2016）。目前，IWG-PM 小组正在研究下一代预后评分系统，即IPSS-molecular 。根据 Wells 的 FCSS流式评分，通常与 MDS 相关的细胞遗传学异常，如7号单体、del(5q) 和复杂的细胞遗传学，FCM 评分会偏高，而染色体异常如 8号三体、del(20q) 和 Y 缺失，FCM 评分偏低（Cutler et al.，2011）。

此外，据报道 MDS 中发现的 FCM 异常数量与总生存期 (OS) 相关（Alhan et al.，2016 ；Alhan、Westers、Cremers et al.，2014 ；Alhan、Westers、van der Helm，等，2014）。

免疫表型异常的骨髓祖细胞是预测 MDS 对生长因子治疗的反应的关键参数（Westers et al.，2010）。血清促红细胞生成素 (EPO) 水平低且免疫表型正常的骨髓祖细胞的患者对促红细胞生成药物 (ESA) 有反应的可能性很高 (94%)。相比之下，具有异常髓系祖细胞和/或高血清 EPO 水平的患者反应较差 (11%)。同样，表达 CD117/c-kit 的红细胞前体的增高预示着 对ESA反应较好，以及有更长的无进展生存期（Raimbault et al.，2019）。FCM评估ERK磷酸化程度与对ESA的反应和低/int-1 风险 MDS 中的 OS 相关（Frisan et al.，2010）。

在 SF3B1突变的MDS 中，单核苷酸变异与不同的免疫表型特征相关，SF3B1 突变和染色体 5q 缺失共同发生影响 BM 免疫表型。SF3B1-MDS 中的这些基因型-免疫表型关联和免疫表型亚型提供了可能进一步完善该特定 MDS 亚组的治疗策略的线索（Duetz、Van Gassen et al.，2021）。通过 FCM 监测疾病可能很重要，尤其是当其他疾病参数（如血液学、分子和细胞遗传学结果）正常或无信息时。

在具有 del(5q) 异常的 MDS 中，患者的异常免疫表型在用「来那度胺」治疗后可以恢复正常（Oelschlaegel et al.，2015）。

使用低甲基化药物治疗期间，如果FCM异常特征不变或增多，则患者没有必要再使用这类药物进行无效且昂贵的长期治疗，反之，如果FCM异常特征减少了，则说明该药物对患者长期生存有益（Alhan、Westers、Cremers et al.，2014 ；Alhan、Westers、van der Helm，et al，2014 ；Subirá et al.，2021 ）。

到目前为止，除了根据 AML 策略对高危 MDS 进行 MRD 评估外，目前还没有对MDS患者的常规治疗监测中使用 FCM达成共识。最后需要提的是，FCM 可能有助于识别 MDS干祖细胞表面的治疗靶点（CD33、CD47、CD123、CD47、CLL-1、MDR-1 和 PD-L1）。

信源：van de Loosdrecht AA, Kern W, Porwit A, et al. Clinical application of flow cytometry in patients with unexplained cytopenia and suspected myelodysplastic syndrome: A report of the European LeukemiaNet International MDS-Flow Cytometry Working Group [published online ahead of print, 2021 Dec 13]. Cytometry B Clin Cytom. 2021;10.1002/cyto.b.22044. doi:10.1002/cyto.b.22044

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