空间转录组样本的质量至关重要，直接决定后续数据质量的好坏；10x Genomics推出空间转录组商业化解决方案的同时，也提供了相应的空间样本准备操作指南。官方提供的操作指南中，样本需要通过异戊烷在液氮环境中进行速冻。本期公众号分别就动植物的样品采集进行总结，并说明了注意事项，便于各位老师根据课题研究准备空间转录组样品。

本期就10×Genomics产品：空间转录组10x Genomics Visium所需的动植物样品的样品采集及运输细则展开说明。

1动物样品采集

1. 取新鲜组织，大小以10mm×8mm×6mm为佳；若组织块较大，请用刀片切除非必须部位，以保证组织可以放置进模具中；请务必切除结节和脂肪组织，否则会影响最终有效数据量。

2. 小心用无尘纸吸干净多余液体，如血液等，尽可能保证组织无液体残留，注意不要粘附组织以外的杂质；

3. 在模具上备注好样本名和包埋日期；

4. 将模具水平放置在桌面，将预冷后的OCT注入模具少许，注意不要产生气泡；

5. 确认好组织切片方向，使用镊子将准备好的组织放入装有OCT的模具中，再用OCT彻底覆盖暴露的组织表面；

6. 转移至-80冰箱或干冰中冷冻30min，确保OCT和组织均完全冻结;

2临床样品采集

本案例展示了肺癌样品的采集：首先通过经支气管镜活检和手术取组织两种方法获取人类肺癌组织、癌旁组织(离癌边2cm)和正常组织(离癌旁组织3cm)的样本（图A）。从手术和活检中立即对人肺组织样本的宏观特征进行成像和记录，之后对样本进行病理和空间转录组分析。接下来，将采集的组织用加生理盐水溶液(此处为湿液)或不加溶液(此处为干液)两种方式进行保存，同时设定对湿液在4℃，将干液在4℃或室温条件下暂时保存30分钟左右（B）。将干湿条件下的样品直接放入液氮中，从手术室运输至实验室，时间为30 min至2.5 h。样品在测序前的处理过程包括开箱、超低温保存、储存和质量控制，如图C所示。

3植物样品采集

植物细胞相对于动物细胞有两个最大的不同——细胞壁和大液泡；植物细胞以细胞壁作为支撑，刚性有余而柔性不足，在冷冻切片中易碎或与包埋剂脱离；植物细胞的大液泡增大了细胞体积，也提高了植物细胞的含水量，在冷冻包埋中容易形成尖锐的冰晶，破坏切片完整性，单位面积内的mRNA含量也随之下降。这也就导致了很多时候制片效果不佳或者最终的RNA检测量偏低。而且木质化、次生壁、次生代谢产物均难以处理，因此空间转录组一般只适合处理软组织。对于新鲜植物组织的包埋，也有2种方式可以采用：a. 新鲜样本直接包埋；b. 新鲜样本抽真空后包埋。由于植物组织内部含水量比较大，而且大部分植物样本具有特殊的内部组织结构，如细胞壁、种皮包裹，根、茎等组织中的韧皮部与木质部结构等，给组织切片的完整性带来很大的困难。根据合作项目经验，对于切片要求比较苛刻的样本，建议选择b方案包埋方式，相较于新鲜样本直接包埋，b方案虽然多了一个抽真空的步骤，但对植物样本切片的完整性会有比较明显的提升。从活体植株上取下新鲜目标区域组织置于培养皿中，利用4℃预冷的镊子和剪刀尽量将组织裁剪成 6.5mm3大小（大小要适宜，现阶段芯片大小为6.5x6.5mm2，一般组织覆盖率达到芯片25%以上，低于25%建议多个包埋），利用预冷的蒸馏水将组织冲洗三次，用吸水纸轻轻吸干组织表面的溶液。

推荐液氮异戊烷冷冻-OCT包埋法，液氮可以快速冷冻，组织在异戊烷中未直接接触液氮既可以防止RNA降解，还避免形成晶体，防止组织形态受损。如果组织类型硬度较大或者木质化程度较高或者组织器官存在很多空隙样本，可以推荐蔗糖溶液作为冷冻保护液，将植物组织放在合适浓度蔗糖溶液中固定，用对应浓度的蔗糖磷酸缓冲液浸洗，最后抽真空的方法可较大达到包埋切片效果。

1.客户在制备样本时，需要准备8-10个包埋块/样（质检、切片厚度调整、捕获区域确定）：一份用于常规RNA提取，以确保样本自身及样本制备不存在问题，当RNA RIN>7.0时，可进行后续实验；另外部分用于正常的切片厚度调整(10-50μm)和捕获区域确定以及正式实验；

2.目前Visium芯片捕获区域大小为6.6x6.5mm2, ,较小的组织可建议多个组织包埋在一起，组织间隔尽量小，但是不要重叠，多个组织保持在一个水平面，厚度满足1mm以上即可。

3. 在冰上操作，用镊子轻轻夹住组织，缓慢加入预冷的OCT包埋剂，直至OCT完全包裹组织，并调整组织在OCT中的位置，保证目标平面与切面水平一致，尤其是多个组织包埋一定要排列整齐，避免重叠在一起，此过程中避免产生气泡，如有气泡产生用用针尖轻缓挑出气泡。

4石蜡样品采集

Visium FFPE空间基因表达是基于探针（~18000基因）杂交的原理，从FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）组织样本中获得组织的无偏空间基因表达图谱，在形态学背景下实现真正的原位检测。从 FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）组织中获取空间基因表达信息；人和小鼠RTL探针（~18000基因）杂交原理；高灵敏度和高特异性分析相关基因的表达。

1.组织类型：人、鼠各组织类型；低温寄送样本（冰袋或干冰）；

2.FFPE样本取材要求组织不要大于6.5mm*6.5mm，因为10x visum的每张切片的捕获区域只能容纳6.5mm*6.5mm的组织大小，≤6.5 x 6.5 mm的组织块可与Visium Spatial玻片兼容；对于≤6.5 x 6.5 mm的组织，从组织周围去除多余的石蜡，使其不大于捕获区域就好，并且还能保留组织样本周围的石蜡边缘，以增强组织在玻片上的附着力；对于>6.5 x 6.5 mm的组织，用刀片切掉多余的部分，形成适合捕获区域的样本，但是由于可能会出现组织裸露，边缘没有石蜡包裹，不利于组织粘附，并且在切掉多余的组织的时候可能还会导致组织损伤和解体。所以最好是在组织包埋的时候就要修剪好组织大小，以便适合捕获区域；

3. 样本取材包埋成石蜡块以后，尽量放在低温保存，有研究表明，低温更有利于RNA的完整性的保持。

5组织包埋和运输

耗材准备

冷冻包埋需要准备如下耗材：OCT（经4℃预冷≥30min）；包埋模具（6mm×8mm）；根据样本大小决定，常用规格为775mm以及302012mm；无尘纸；培养皿；镊子；刀片；1XPBS，植物样品包埋还需要准备抽真空仪器和不同浓度的蔗糖溶液；液氮。

组织包埋方案

方案A：组织先冷冻后包埋1. 盛有异戊烷的容器浸没在液氮里预冷15 mim；2. 将新鲜组织擦拭干净，完全浸没于异戊烷中，速冻组织；3. 然后将速冻的组织块放入包埋盒，在干冰上补充OCT 包埋，直到OCT凝固变白。

方案B：组织冷冻和包埋同时进行1. 将新鲜组织擦拭干净，置于培养皿中，加入室温OCT充分润湿；2. 将组织放入包埋盒，组织表面在OCT中完全浸没；3. 然后将包埋盒转移到液氮-异戊烷中（未完全浸没）速冻，或者放在干冰上速冻，直到OCT凝固变白。

包埋方向

将 OCT 包埋的组织块或者包埋盒直接保存在–80℃的密封容器中（一般利用锡箔纸包裹整个包埋盒或者扣下包埋块将包埋块放入50 mL离心管密封处理），并做好样本信息标记，利用干冰运输

包埋块运输

将 OCT 包埋的组织块或者包埋盒直接保存在–80℃的密封容器中（一般利用锡箔纸包裹整个包埋盒或者扣下包埋块将包埋块放入50 mL离心管密封处理），并做好样本信息标记，利用干冰运输。

6注意事项

FAQ1：如果是比较软的组织如何处理？

对于比较柔软的组织，可以将组织稍微冻一下，然后再放入模具中；

FAQ2：包埋过程中出现气泡该如何处理？

注意不要有气泡，特别是在组织附近没有气泡，如果有气泡产生的话，可以用枪头将气泡朝外挤出来；

FAQ3：所有的试剂、包埋盒是否都需要在冰上操作？

动物组织取到组织后，从开始包埋到放入-80℃冰箱的时间，需要控制在5min内；若不熟悉包埋操作，建议提前进行预实验熟悉操作流程；同时降低植物组织RNA降解的可能，需要对相应的器具、试剂放在4℃环境中预冷，也就是前期一些工作需要在冰上操作完成，尽可能减少组织RNA的降解。

FAQ4：这种液氮异戊烷冷冻-OCT包埋的植物组织可以-80℃存放多久？

2个月。理论上密封处理后可以-80℃长期保存，与动物组织不同，植物组织脆弱性和结构特异性，液氮异戊烷冷冻-OCT包埋的植物组织在-80℃可以储存2个月左右，就要进行切片实验和后续实验，不然也会影响切片效果和RNA降解。

FAQ5：植物组织的选择偏好

植物组织需要满足一些特性更容易完成包埋切片，优先考虑幼嫩的组织，木质化程度较低，可以保证获得的切片完整性以及获得较多有效数据。同时，不同组织的取样策略略有不同，具体样品可以联系驻地销售进行相关样品采集咨询。

FAQ6：植物清洗缓冲液选择

推荐蒸馏水作为植物组织表面清洗缓冲液，不建议直接用1xPBS作为植物组织表面清洗缓冲液，为了维持组织形态结构原始稳定性，高浓度PBS会导致植物组织细胞容易收缩变形，选择蒸馏水可以简单快速清洗干净表面污渍。如果采用蔗糖溶液作为冷冻保护液，可以采取相应浓度蔗糖（1x PBS配置）做为植物清洗缓冲液。

FAQ 7：植物组织太小该如何包埋才能最大限度利用芯片覆盖度？

为了保证最大限度利用芯片覆盖度，解决组织样本太小情况，这里推荐多个组织包埋在一起，组织间隔尽量小，但是不要重叠，多个组织保持在一个水平面，如上图所示。另外一定要备注清楚方向和每个样本形态结构，后续数据分析，需要清楚知道对应样本切片位置，此时应该清楚备注每个样本方向和位置信息。